Høy og lav Kapasitet Skjermer med root-knuten nematoder Meloidogyne SPP. Published: March 12, 2012 doi: 10.3791/3629

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology, University of California, Riverside

Summary

To forskjellige metoder til skjermen planter med rot-knuten nematoder er beskrevet. De beskrevne tilnærminger inkluderer high-throughput skjermer med nematoder i en destruktiv måte legge til rette for bruken av disse plantene i avlsprogram.

Abstract

Root-knuten nematoder (slekten Meloidogyne) er obligate plante parasitter. De er ekstremt polyphagous og regnes som en av de mest økonomisk viktige planter kveis. Den mikroskopiske andre-etappe juvenil (J2), molted gang i egg, er infeksiøs scenen. De J2s klekkes fra eggene, bevege seg fritt i jord innen en film av vann, og finn root tips om egnede plantearter. Etter trenger inn i planten rot, vandrer de mot vaskulære sylinderen der de etablere en fôring nettsted og initiere fôring bruke sine stylets. Den flercellet fôring området består av flere forstørrede multinuclear celler kalt 'gigantiske celler' som dannes fra celler som gjennomgikk karyokinesis (gjentatt mitose) uten cytokinese. Nabolandene pericycle celler deler og forstørre i størrelsen gir opphav til en typisk galle eller rot knute, den karakteristiske symptomet på root-knot nematode infeksjon. Når fôring initieres, J2s blir stillesittende og undergo tre ekstra molts å bli voksne. Den voksne hunnen legger 150-250 egg i en geléaktig matrise på eller under overflaten av roten. Fra eggene nye infeksiøs J2s klekkes og starter en ny syklus. Roten-knute nematode livssyklus er fullført i 4-6 uker ved 26-28 ° C.

Her presenterer vi den tradisjonelle protokollen til å infisere planter, dyrket i potter, med root-knuten nematoder og to metoder for high-throughput analyser. Den første high-throughput metoden brukes for planter med små frø som tomat, mens andre er for planter med store frø som cowpea og felles bønne. Store frø støtte utvidet frøplante vekst med minimal næringsinnhold supplement. Den første high throughput analysen benytter frøplanter dyrket i sand i skuffene mens i den andre analysen plantene er dyrket i poser i fravær av jord. Frøplante veksten posen er laget av en 15,5 x 12.5cm papir veken, brettet øverst for å danne en 2-cm dyp gjennom der frøet eller spiren er plassert. Detpapir veke finnes inne i en gjennomsiktig plast pose. Disse vekst poser tillate direkte observasjon av nematode infeksjon symptomer, riving av røtter og egg masseproduksjon, under overflaten av en gjennomsiktig pose. Begge metodene tillate bruk av de skjermede plantene, etter phenotyping, for kryssende eller frøproduksjon. En ekstra fordel av bruken av veksten poser er det lite plassbehov fordi posene lagres i plast hengende mapper arrangert i rack.

Protocol

1. Tomato Plantekvalitet Vekst i potter og skuffer

1. For pot analyser, plante tomat frø i en enkelt pott i en organisk rik jord som Sunshine mix. Opprettholde i et drivhus ved 22-28 ° C. Etter spiring, gjødsle en gang i uken med Miracle-Gro.
2. Om to uker etter spiring, på to sanne-blad stadium, transplantere individuelt frøplantene i potter (10 cm diameter og 17 cm dype) fylt med steril sandholdig jord inneholder 90% sand og 10% organisk blanding. Legg Osmocote slow release gjødsel og opprettholde i et drivhus ved 22-28 ° C i to uker. Fortsett å befrukte plantene en gang i uken med Miracle-Gro.
3. For high-throughput skjermer, plante frø direkte i skuffene i sandholdig jord, dekk fatet med plast brytes før spiring og vedlikeholde som ovenfor. Etter spiring, legg Osmocote slow release gjødsel og gjødsle en gang i uken med Miracle-Gro.

2. Cowpea Veksten i frøplante Pouches

1. Seeds enten spirer i en petriskål, foret med flere lag Kimwipe papir, og overføres enkeltvis til poser eller plassert direkte inn i papiret sporet av posen og spirer.
2. Plasser poser i en plastpose hengende fil mappe, to per mappe, og ordne mapper i et stativ i en vertikal stilling. Plasser rack i et kontrollert miljø-kammer opprettholdt ved en temperatur på 25-28 ° C og 16 h lys / 8 t. mørk syklus. Stativer også kan opprettholdes i et drivhus, men krever en folie eller stiv papirdekselet plasseres over stativet på begge sider av anlegget stengler, for å redusere potensialet for Dieseldyr.
3. Vann posene en eller to ganger per dag med omvendt osmose vann. Rundt 10 til 14 dager etter såing, da en tilstrekkelig rotsystem med høyere root tips har utviklet (figur 1), frøplantene er klare for inokulasjon.

3. Utvinning av nematode Eggs

Utvinning av eGGS fra infiserte røtter er endret fra en protokoll utviklet av Hussey og Barker (1973).

1. Tre til fire dager før nematode inokulasjon, trekke ut rot-knuten nematode egg fra infiserte tomat røtter. Før du starter egg utvinning, vaske arbeidsområdet grundig med varmt vann for å unngå forurensning. Også vask i varmt vann en blender, to bøtter, en netting støtte, en gummihammer, tre sikter på 425, 90 og 25 mikrometer blenderåpning, en gradert sylinder og saks.
2. Stable såldene fra topp til bunn i følgende rekkefølge: 425, 90 og 25 mikrometer blenderåpning. Eggene vil bli samlet på 25 mikrometer sil nederst. Sett såldene på en netting støttet i en vask. Sett en bøtte under netting å samle oppkjøringen gjennom løsningen.
3. Skjær toppen av den infiserte planten (e), som brukes som kilde til podestoff, og kast. Fjern forsiktig anlegget fra potten. Vask røttene ved å dyppe i en plastbøtte full av vann. Skyll røttene videre under løpening vann inntil jordpartikler vaskes bort fra røttene.
4. Skjær røttene med saksen i små biter. Kast taproot.
5. Sett de hakkede røtter fra en enkelt plante i en stor plast krukke med lokk, tilsett akkurat nok 10% blekemiddel løsning for å dekke røttene og lukk lokket.
6. Rist glasset inneholder røttene for 2 min.
7. Åpne glasset og hell røttene på toppen sil og vask med en slange festet til en misting dyse. Vask godt til all blekemiddel lukten er borte. Bruk en hammer for å banke sidene av såldene å unngå tilstopping silen porene.
8. Fjern den øverste sil og skyll rusk på andre sil.
9. Fjern andre sil og samle den fine rusk, som inkluderer egg, fra den siste silen. Med en svak strøm fra en vannflaske, flytte rusk til den ene siden av silen. Samle rusk og egg inn i en ren beholder med minst mulig vann.
10. Sil en gang vannet samles opp ibøtte gjennom 25 mikrometer sikten å samle noen egg som kan ha rømt. Skyll godt med vann og samle i samme beger.
11. Kast planteavfall fra toppen sil og vask grundig alle tre sikter med trykkvann. Ikke berør mesh del av siktene som det kan forvrenge porestørrelse.

4. Klekking nematode Egg

1. Linje en ren metall kurv med noen få lag Kimwipe papir og passer på et glass petriskål. Tillat en 1-cm avstand mellom bunnen av kurven og fatet.
2. Hell de utpakkede nematode eggene på papiret i trådkurv. Legg nok væske slik at bunnen av trådkurv berører vannflaten, men er ikke nedsenket i vann. Dekk toppen med en plastlokk.
3. Hver dag se etter vann fordampning og tilsett litt vann i petriskål slik at bunnen av kurven berører vannet. Dette vil hindre at eggene tørker ut.
4. Annenhver dag, samle water som inneholder J2s fra petriskåler i et begerglass. Hvis ikke brukt umiddelbart, lufte samlet podestoff ved romtemperatur ved hjelp av en lab lufttilførsel eller luft generert av et akvarium pumpe. Bruk luftet podestoff innen 2 dager. J2s kan hentes fra klekking satt opp over en periode på 6-8 dager.

5. Tomato Root Infeksjon i potter eller skuffer og evaluering av infeksjon

1. Bruk tre alikvoter av de innsamlede nematoder for å telle antall J2s i en telling lysbilde eller parabol, beregne gjennomsnitt og bestemme ønsket volum for inokulasjon. Typisk 3000 J2s brukes per plante i krukker og 500 J2s for planter dyrket i frøplante skuffer.
2. Rør podestoff på en magnetisk røring plate på lav hastighet.
3. Før du vaksinere plantene, sørg for at jorden er fuktig, men ikke for våt. For potten inokulasjon, lage tre hull på ca halv pott dybde i sanden rundt hver tomat rotsystem med en blyant (Figur 2
4. For high-throughput skjermer i skuffer, bruk en modifisert forseglet tips nål med hull på sidene limt til en 5-ml pipettespissen langs en ​​pipetter (figur 3) for å levere J2s i jorda. Alternativt kan nematoder leveres som i trinn 5.3.
5. Opprettholde plantene i et drivhus ved 24-27 ° C i seks til åtte uker. Fortsett å befrukte to ganger i måneden med Miracle-Gro.
6. For evaluering av infeksjon, forsiktig fjerne plantene fra potter og vaske røttene (som beskrevet i trinn 3.3).
7. Flekk egg massene blå ved å senke røttene i 1 mg / L erioglaucine, for 15 min.
8. Skyll røttene i vann og evaluere ved å telle de fargede egg massene på individuell rotsystem. En opplyst skrivebord forstørrelsesglass kan brukes til å visualisere egg massene.
9. Hvis filtrerte plantene er nødvendig for videre genetic studier, ikke kutter toppene før vask røttene for evaluering. Etter beising og telle egg massene, transplantere frøplantene i organisk jord, beskjære topper tungt å redusere transpirasjon, og opprettholde i et drivhus.

6. Cowpea Root Infeksjon i poser og Evaluering av infeksjon

1. Tell nematode podestoff og røre på en magnetisk røring plate som beskrevet tidligere.
2. Fjern posene fra de hengende mapper og legg dem på en horisontal flate. Inokuler hver pose med 1500 J2s i 5 ml. Løft plastdekslet av posen og distribuere nematoder jevnt over overflaten av røttene.
3. Hold poser i en horisontal stilling i 24 timer etter inokulasjon, dekket med mørk papir til å ekskludere lys, så tilbake til de hengende mapper i veksten kammeret.
4. Vann plantene etter behov, en eller to ganger daglig, med halv styrke Hoagland løsning (Hoagland & Arnon, 1950; tabell 1
5. Ca 30 dager (range 28-35 dager) etter vaksinering, sette mot hver pose med ca 10-20 ml på 75 mg / L erioglaucine. Hold pouches oversvømte med fargestoff i en horisontal posisjon over natten.
6. Tømme lommene og vurdere de bakenforliggende systemene ved å telle egg massene under en lysende skrivebord forstørrelsesglass.
7. Hvis filtrerte plantene er nødvendig for videre genetiske studier eller avlsarbeid, trekk ut røttene fra papiret, transplantasjon i organisk jord i potter og opprettholde i et drivhus.

7. Representative Resultater

De aktuelle stadier av tomat og cowpea anlegg for nematode vaksinasjoner for de to systemene er beskrevet er vist i figur1 og 2. I tillegg er eksempler på godt infiserte røtter tomat og cowpea vist i figur 4 og 5. Som i de fleste sykdomsresistens skjermer, er det tilrådelig å bruke minst 6-10 planter pr genotype for nematode inoculation å beregne gjennomsnittet av infeksjonen rate. Variasjon i nematode smitte mellom planter av samme genotype, kan reduseres ved å bruke uniform plante størrelse og nøyaktig mengde og levering av podestoff.

Bruken av skuffer og vekst poser gjør screening av hundrevis til tusenvis av planter i en liten vekst plass. Vekst poser også tillate rask og effektiv ikke-destruktiv evaluering av root-knuten nematode infeksjoner uten behov for vask røtter (figur 4).

Figur 1. En to uker gammel cowpea plante dyrkes i en pose og klar for root-knot NEMATode inokulasjon.

Figur 2. En tre uker gammel tomatplante klar for root-knot nematode inokulasjon.

Figur 3. En modifisert nål og pipettespissen brukt for høy gjennomstrømming inokulering av nematoder. Bunnen av en nål ble forseglet og tre sett med hull ble boret i nålen ved hjelp av en laserstråle. Deretter ble den modifisert nål limt til en 5-ml pipette tips.

Figur 4. En tomat rotsystem infisert med rot-knuten nematoder.

Figur 5. Et cowpea rotsystem med egg massene farget med erioglaucine 30 dager etter inokulasjon vokst28 ° C.

Discussion

Det er to viktige skritt for en vellykket nematode skjerm: Utarbeidelse av en svært smittsomme podestoff og bruke planter på riktig utviklingsstadiet. Klekking frekvensen av rot-knuten nematode egg er svært variabel og varierer mellom 5 - 50%. Derfor å oppnå optimale nivåer av luke og svært smittsomme J2s, må nøye betales til egg uttak og klekking prosedyrer. Egg bør utsettes for blekemiddel i minimum tidsperiode og blekemiddel bør skylles godt ut fra roten blandingen. Når klekke eggene, bør slurry som inneholder eggene ikke dyppes i vann. I tillegg unngå å søle eggene inn i underliggende petriskål der klekket yngel er samlet. En måte å unngå å søle eggene under klekking prosessen er ikke å legge vann direkte til Kimwipe som papiret skulle bryte. I stedet legger vannet direkte til petriskål.

For best resultat, bruk fersk klekket J2s. Dersom hatch er lav og mer podestoff er nødvendig, kan J2s lagres ved 15 ° C for en lengre periode. Varm den lagrede podestoff til romtemperatur for å gjenopplive de nematoder før inokulasjon. Men ikke lagre J2s for lengre perioder, selv ved 15 ° C som sultet J2s ikke vil infisere effektivt.

Unge frøplanter er det beste utviklingsstadiet for root-knot nematode inokulasjon. Imidlertid må dette være balanserte med dannelsen av et tilstrekkelig rotsystem som gir et tilstrekkelig antall rot tips som innganger for J2s. Opprettholde optimal plantevekst tilstand er også kritisk for skjermene. Unngå over-vanning planter spesielt de dyrket i poser. Over-vanne poser, som indikert av stillestående vann i bunnen av posen, kan fremme soppvekst og redusere rot helse.

Med både analyser videre evaluering av nematode infeksjon og beregning av antall egg / rotsystem og egg / gram av fresh root kan utføres. For tomat analysene, er individuelle røtter veies og egg ekstrahert som beskrevet for podestoff forberedelse (§ 3). Ved behandling stort antall plante prøver, kan enkelte rotsystemer bli macerated bruke en blender for egg utvinning. Antall egg som skal regnes i minst tre alikvoter og eggene / gram fersk rotsystem beregnet. For posen analysene, er rotsystemet dro av papiret sette inn, veid, og egg ut.