Høj og lav gennemløb Skærme med rodgallenematoder Meloidogyne spp. Published: March 12, 2012 doi: 10.3791/3629

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology, University of California, Riverside

Summary

To forskellige metoder til skærmen anlæg med rodgallenematoder er beskrevet. De beskrevne tilgange omfatter high-throughput skærme med nematoder på en destruktiv måde at fremme brugen af ​​disse anlæg i avlsprogrammer.

Abstract

Rodgallenematoder (slægten Meloidogyne) er obligate plante parasitter. De er ekstremt polyphagous og betragtes som en af ​​de mest økonomisk vigtige planter nematoder. Den mikroskopiske andet trin juvenil (J2), molted gang i ægget, er det infektive fase. De J2s klækker fra æggene, bevæge sig frit i jorden inden for en film af vand, og find rodspidserne af egnede plantearter. Efter trænger planten rod, vandrer de mod vaskulære cylinder, hvor de etablerer en fodring websted og indlede fodre bruger deres stiletter. Den flercellet fodring stedet består af flere forstørrede multinucleare celler kaldet 'kæmpeceller', som er dannet ud fra celler, der undergik karyokinesis (gentaget mitose) uden cytokinese. Omkringliggende pericycle cellerne deler sig og vokse i størrelse giver anledning til en typisk galde eller rod knude, de karakteristiske symptomer på rodgallenematode infektion. Når fodring er initieret, J2s bliver stillesiddende og undergo yderligere tre molts at blive voksne. Den voksne hun lægger 150-250 æg i en gelatinøs matrix på eller under overfladen af ​​roden. Fra æggene nye smitsomme J2s klække og starte en ny cyklus. Den rodgallenematode livscyklus er afsluttet i 4-6 uger ved 26-28 ° C.

Her præsenterer vi den traditionelle protokollen til at inficere planter, der dyrkes i potter, med rodgallenematoder og to metoder til high-throughput analyser. Den første high-throughput metode til anlæg med små frø som tomat, mens den anden er for planter med store frø som cowpea og fælles bønner. Store frø understøtte udvidet frøplante vækst med minimal kosttilskud. Den første high throughput assay udnytter planter dyrket i sand i skuffer, mens der i andet assay planterne dyrkes i poser i mangel af jorden. Den vækst af frøplanter pose er fremstillet af en 15,5 x 12,5 cm papir væge, foldes på toppen at danne en 2 cm dyb rende, i hvilken frø eller kimplanter er placeret. Denpapir væge er indeholdt inden i en transparent plastpose. Disse vækstfaktorer poser muliggøre direkte observation af nematodeinfektion symptomer, rivning af rødder og æg masseproduktion, under overfladen af ​​et transparent lomme. Begge metoder muliggør anvendelse af de screenede planterne efter fænotypebestemmelse for passage eller frøproduktion. En yderligere fordel ved anvendelse af vækst poser er lille pladsbehov for poserne opbevares i plast hængende mapper anbragt i stativer.

Protocol

1. Tomatkimplanten Vækst i Gryder og bakker

1. For pot assays, plante tomatfrø i en enkelt pot i en organisk rig jord som Sunshine mix. Opretholde et drivhus ved 22-28 ° C. Efter spiring, befrugte en gang om ugen med Miracle-Gro.
2. Ca. to uger efter spiring, med de to sand-bladsstadiet transplantere individuelt kimplanterne i potter (10 cm diameter og 17 cm dybe) fyldt med sterilt sandet jord indeholdende 90% sand og 10% organisk blanding. Tilsættes Osmocote langsom frigivelse gødning og opretholde i et drivhus ved 22-28 ° C i to uger. Fortsæt med at gøde planterne en gang om ugen med Miracle-Gro.
3. For high-throughput skærme, frø direkte i bakker i sandjord dækker bakken med plast wrap, indtil spiring og vedligeholde som ovenfor. Efter spiring, tilføje Osmocote langsom frigivelse gødning og befrugte en gang om ugen med Miracle-Gro.

2. Vigna Vækst i sætteplante Pouches

1. Seeds enten spirede i en petriskål, foret med flere lag Kimwipe papir og overført enkeltvis til poser eller anbringes direkte i papiret rillen af ​​posen og spiret.
2. Læg poserne i en plasticpose hængende mappe, to pr mappe og arrangere mapper i et rack i en lodret position. Placere hylden i en kontrolleret miljø kammer holdt ved en temperatur på 25-28 ° C og 16 timers lys / 8 h mørke-cyklus. Stativer kan også opretholdes i et drivhus, men kræver en folie eller stift papir låg anbragt over tandstangen på begge sider af plantestænglerne, for at reducere risikoen for svampeangreb.
3. Vand poserne én eller to gange om dagen med omvendt osmose vand. Omkring 10 til 14 dage efter podning, når et passende rodsystem med tertiære rodspidser har udviklet (fig. 1), kimplanterne er klar til inokulering.

3. Ekstraktion af Nematodeæggene

Udvinding af eGGS fra inficerede rødder er modificeret fra en protokol udviklet af Hussey og Barker (1973).

1. Tre til fire dage før nematoder podning, udtrække rodgallenematode æg fra inficerede tomat rødder. Før du starter æg udvinding, vaske arbejdsområdet grundigt med varmt vand for at undgå forurening. Også vaskes i varmt vand i en blender, to spande, et trådnet understøttet, en gummihammer tre sigter på 425, 90 og 25 um åbning, en gradueret cylinder og saks.
2. Stak soldene fra top til bund i følgende rækkefølge: 425, 90 og 25 um blænde. Æggene vil blive opsamlet på 25 um sigten ved bunden. Sættes sigterne på et trådnet understøttet i en vask. Sætte en spand under trådnet at indsamle forud gennem opløsningen.
3. Skær toppen af ​​den inficerede plante (r), der anvendes som kilden til inokulum og kasseres. Fjern forsigtigt planten fra puljen. Vaskes rødderne ved dypning i en plastspand fyldt med vand. Skyl rødderne yderligere under løbeNing vand, indtil jordpartiklerne vaskes bort fra rødderne.
4. Skær rødderne med saksen i små stykker. Bortskaf pælerod.
5. Sæt de hakkede rødder fra en enkelt plante i en stor plastik krukke med låg, tilsættes lige nok til 10% blegemiddel til at dække rødderne og luk låget.
6. Ryste glasset indeholdende rødderne i 2 min.
7. Åbne beholderen og hæld rødderne over på den øverste sigte og vaskes med en slange fastgjort til en dug dyse. Vask godt, indtil al lugt af klor er væk. Anvender en hammer til at trykke siderne af sigter for at undgå tilstopning af sigten porer.
8. Fjern den øverste sigte og skyl snavs på den anden sigte.
9. Fjern den anden sigte og indsamle den fine rester, som omfatter de æg, fra den sidste sigte. Med en blid strøm fra en vandflaske, bevæger resterne til den ene side af sigten. Opsamle snavs og æg i et rent bægerglas med minimal mængde vand.
10. Sieve igen vand opsamles ispand gennem 25 um sigte at indsamle de æg, der kan have undsluppet. Skylles godt med vand og opsamles i det samme bægerglas.
11. Kassér planterester fra den øverste sigte og vaskes grundigt alle tre sigter med vand under tryk. Rør ikke mesh del af soldene, da det kan forstyrre porestørrelsen.

4. Udklækning Nematodeæggene

1. Linje en ren metal kurv med et par lag af Kimwipe papir og passer på et glas petriskål. Tillade en 1 cm afstand mellem bunden af ​​kurven, og skålen.
2. Hæld de udtrukne Nematodeæggene på papiret i trådkurv. Tilsættes tilstrækkeligt med væske, så at bunden af ​​trådkurv rører vandoverfladen, men er ikke nedsænket i vand. Dække toppen med et plastlåg.
3. Hver dag kontrollere vandfordampning og tilsættes noget vand i petriskålen, således at bunden af ​​kurven rører vand. Dette vil forhindre æggene tørrer ud.
4. Hver anden dag, indsamle water, der indeholder J2s fra petriskålene i et bægerglas. Hvis det ikke anvendes straks, luftes de indsamlede inokulum ved stuetemperatur ved hjælp af et laboratorium luftforsyning eller luft genereret af et akvarium pumpe. Brug luftede inoculum inden for 2 dage. J2s kan opsamles fra udklækning nedsætte over en periode på 6-8 dage.

5. Tomat Root Infektion i potter eller Bakker og evaluering af infektion

1. Brug tre portioner af de indsamlede nematoder til at tælle antallet af J2s i en tælle slide eller parabol, beregne gennemsnit og bestemme den ønskede lydstyrke for podning. Typisk 3000 J2s anvendes per plante i potter og 500 J2s til planter dyrket i sætteplante bakker.
2. Omrøre inokulum på en magnetisk omrøring plade ved lav hastighed.
3. Før du pode planterne, sørg for, at jorden er fugtig, men ikke for våd. For pot podning, lave tre huller på ca halv pot dybde i sandet omkring hver tomat rodsystem med en blyant (Figur 2
4. Til high-throughput skærme i bakker, anvender en modificeret forseglet spids nål med huller på siderne limet til en 5 ml pipette spids langs en ​​pipette (fig. 3) til at levere J2s i jorden. Alternativt kan nematoder leveres som i trin 5.3.
5. Vedligehold planterne i et drivhus ved 24-27 ° C i seks til otte uger. Fortsæt med at gøde to gange om måneden med Miracle-Gro.
6. Til evaluering af infektion, fjernes omhyggeligt planter fra potterne, og der vaskes rødderne (som beskrevet i trin 3.3).
7. Pletten ægmasser blå ved nedsænkning rødderne i 1 mg / L erioglaucine, i 15 min.
8. Skyl rødderne i vand og vurdere ved at tælle de farvede æg masserne på de enkelte rodsystem. En oplyst skrivebord lup kan bruges til at hjælpe visualisere ægmasser.
9. Hvis de screenede planterne er nødvendige for yderligere genetic undersøgelser, klip ikke toppe før vask rødderne til evaluering. Efter farvning og tælle ægmasser, transplantatafstødning kimplanterne i organisk jord, beskære toppe stærkt at reducere transpiration og opretholde i et drivhus.

6. Vigna Root Infektion i poser og evaluering af infektion

1. Tælle nematoder og omrør på en magnetomrører plade som beskrevet tidligere.
2. Tag poserne fra de hængende mapper og sted på en vandret flade. Inokulere hver pose med 1500 J2s i 5 ml. Løfte plastlåg af posen og fordele nematoder jævnt over overfladen af ​​rødderne.
3. Opbevar poserne i vandret stilling for 24 timer efter podning, dækket med mørk papir at udelukke lys, og derefter vende tilbage til de hængende mapper i klimakammeret.
4. Vand planterne efter behov, en eller to gange dagligt, med halv styrke Hoagland løsning (Hoagland & Arnon, 1950; tabel 1
5. Ca. 30 dage (interval 28-35 dage) efter inokulering, tilføre hver pose med omkring 10-20 ml 75 mg / L erioglaucine. Holde poser fyldes med farvestoffet i en vandret stilling natten over.
6. Hæld vandet fra poserne og vurdere de bagvedliggende systemer, ved at tælle de ægmasser under en oplyst skrivebord lup.
7. Hvis de screenede planterne er behov for yderligere genetiske undersøgelser eller avlsarbejde, forsigtigt trække rødderne fra papiret, transplantation i økologisk jord i potter og vedligeholde i et drivhus.

7. Repræsentative resultater

De passende trin i tomat og Vigna-planter for nematoder inokulationer for de to beskrevne systemer er vist i fig1 og 2. Desuden er eksempler på vel-inficerede rødder af tomat-og cowpea vist i figur 4 og 5. Som i de fleste sygdom modstand skærme, er det tilrådeligt at anvende mindst 6-10 planter pr genotype for nematoder podning til at beregne gennemsnittet af infektionen sats. Variation i nematodeinfektion mellem planter, af den samme genotype, kan reduceres ved hjælp af ensartet anlægsstørrelse og nøjagtig mængde og levering af inokulum.

Anvendelsen af ​​bakker og vækst poser muliggør screening af hundredvis til tusindvis af planter i en lille vækst plads. Vækst poser også tillade en hurtig og effektiv ikke-destruktiv evaluering af rodgallenematode infektioner uden behov for vask rødder (figur 4).

Figur 1. Et to uger gamle Vigna plante dyrket i en pose og klar til rodgalle-nemaTode inokulering.

Figur 2. En tre uger gamle tomatplante klar til rodgallenematode inokulering.

Figur 3. En modificeret p og pipettespidsen anvendes til high-throughput podning af nematoder. Bunden af ​​en nål blev forseglet og tre sæt af huller blev boret i nålen ved hjælp af en laserstråle. Derefter blev den modificerede nålen limet til en 5 ml pipettespids.

Figur 4. En tomat rodsystemet inficeret med rodgallenematoder.

Figur 5. En vignabønne rodsystem med ægmasser farvet med erioglaucine 30 dage efter inokulering dyrket ved28 ° C.

Discussion

Der er to vigtige trin for en vellykket nematode skærm: Fremstilling af en stærkt smitsom inokulum og anvendelse planter på den korrekte udviklingsstadium. Skravering på rodgallenematode æg er meget varierende og spænder mellem 5 - 50%. Derfor for at opnå optimale niveauer af Hatch og stærkt smitsomme J2s, skal meget opmærksom på ægget udvinding og rugeæg procedurer. Æg skal udsættes for blege for et minimum periode og blegemiddel skal skylles godt ud fra roden blandingen. Når klækningen æggene, skal gyllen indeholder æg ikke nedsænkes i vand. Hertil kommer, at undgå at spilde æggene ind i den underliggende petriskål, hvor de udklækkede unger er samlet. En måde at undgå spild af æggene under udrugningsprocessen er ikke at tilsætte vand direkte til Kimwipe som papir kan knække. Stedet tilsættes vand direkte til petriskålen.

For de bedste resultater ved at bruge frisk udklækkede J2s. Hvis hatch er lav og mere inokulum er nødvendigt, kan J2s opbevares ved 15 ° C i en længere periode. Opvarme den lagrede inokulum til stuetemperatur for at genoplive nematoder før inokulering. Du skal dog ikke gemme J2s i længere perioder selv ved 15 ° C som udsultede J2s ikke vil inficere effektivt.

Unge kimplanter er den bedste udviklingsstadiet for rodgallenematode inokulering. Men det skal være afbalanceret med dannelsen af ​​et passende rodsystem giver et tilstrækkeligt antal rodspidserne som indgangssteder for de J2s. Opretholdelse af optimal plantevækst betingelse er også kritisk for skærmene. Undgå over-Vanding af planter specielt dem, der dyrkes i poser. Over-vanding af poser, som angivet ved stillestående vand i bunden af ​​posen, kan fremme svampevækst og mindsker rod sundhed.

Med både analyser yderligere evaluering af nematodeinfektion og beregning af antallet af æg / rodsystem og æg / gram fresh rod kan udføres. For tomat analyser, er de enkelte rødder vejet og udtrukne æg som beskrevet for inokulum forberedelse (afsnit 3). Ved behandling af stort antal af plantebeskyttelsesmidler prøver, kan de enkelte rodsystemer blive udblødt hjælp af en blender for æg ekstraktion. Antallet af æg bør tælles i mindst tre portioner og æg / gram frisk rodsystemet beregnes. For posen assays rodsystemet trækkes papiret insert, vejet, og æggene blev ekstraheret.