根こぶ線虫、高および低スループット画面サツマイモ属。 Published: March 12, 2012 doi: 10.3791/3629

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Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology, University of California, Riverside

Summary

根こぶ線虫、画面の植物には2つの異なるメソッドが記述されています。説明したアプローチは、繁殖プログラムでこれらの植物の使用を容易に非破壊で線虫による高スループットスクリーニングが含まれています。

Abstract

根瘤線虫（属サツマイモ ） は、嫌気植物の寄生虫である。彼らは非常に多食し、最も経済的に重要な植物寄生性線虫の一つと考えられています。卵で一度脱皮微視的な第二段階の少年（J2）は、感染の段階です。 J2Sは、卵から孵化し、水の膜内の土壌中で自由に移動し、適切な植物種の根を探します。彼らは給餌のサイトを確立し、それらのスタイレットを使用して供給開始する場所植物の根を貫通した後、彼らは血管の筒に向かって移行します。多給サイトが分裂せずに核分裂（有糸分裂を繰り返す）を受けた細胞から形成された "巨大細胞"と呼ばれるいくつかの拡大多核細胞で構成されています。近隣の内鞘細胞は分裂し、典型的な胆嚢やルートノット、根こぶ線虫感染症の特徴的な症状を生じさせるのサイズが拡大します。一度給餌が開始されると、J2Sは、定住や国連になる大人になるための3つの追加moltsをdergo。成人女性は、ルートの表面上または下にゼリー状のマトリックスに150から250個の卵を産む。卵から新たな感染J2Sハッチと新しいサイクルを開始します。根こぶ線虫のライフサイクルは26から28で4-6週間で完了℃で

ここでは、根こぶ線虫およびハイスループットアッセイには、2つの方法とポットで生育した植物を、感染させる伝統的なプロトコルを提示します。第二は、そのようなササゲとインゲンマメなどの大きな種子を持つ植物のためですが初の高スループットメソッドは、トマトのような小さな種子植物のために使用されます。大型種は最小の栄養補助食品で拡張苗の成長をサポートしています。最初のハイスループットアッセイは、第二のアッセイ工場で土壌の非存在下で袋で栽培されていながら、トレイに砂で育った苗を利用しています。苗の成長ポーチは、種子や苗が置かれている2cmの深さの谷を形成するために、上部に折りたたまれ、15.5×12.5センチメートル紙の芯で作られています。ザ紙の芯は、透明プラスチック袋の内側に含まれています。これらの成長の袋は透明な袋の表面の下に、根と卵の大量生産のかじり、線虫感染症の症状の直接観察を可能にします。どちらの方法で生産を横断またはシードのために、表現型解析の後、スクリーンの植物を使用することができます。パウチは、ラックに配置されたプラスチック製のハンギングフォルダに格納されているため、成長の袋の使用の追加の利点は、小さなスペースの要件です。

Protocol

1。鍋やトレイのトマト苗の成長

1. ポット試験、そのようなサンシャイン·ミックスとして有機物に富む土壌でシングルポットの植物トマトの種子。 22から28までの温室で維持℃の発芽後は、ミラクル·グロで週に一度受精。
2. 約2週間発芽後、2真の葉の段階で、90％砂10％、有機混合物を含む滅菌した砂質土を充填したポット（直径10cm、深さ17センチメートル）に個別に苗を移植。徐放性肥料をOsmocote、2週間22から28℃の温室内に維持するに追加します。ミラクル·グロで週に一度植物を受精し続けています。
3. 高スループットの画面では、直接砂質土壌におけるトレイの植物の種子は、発芽するまでラップとトレイをカバーし、上記のように維持します。発芽後は、徐放性肥料をOsmocoteとミラクル·グロで週に一回肥料を追加します。

2。苗ポーチのササゲの生育

1. Seedsのいずれか、ペトリ皿の中で発芽させたキムワイプ紙のいくつかの層で裏打ちし、袋に単独で転送したり、パウチの紙の溝に直接配置して、発芽しています。
2. フォルダごとのプラスチック製のハンギングファイルフォルダ、二つに袋を置き、垂直位置でラック内のフォルダを配置します。 25から28℃の温度、16時間明/ 8時間暗サイクルで維持制御環境チャンバ内のラックを配置します。ラックは、温室で維持さが、真菌汚染の可能性を減らすために、箔や植物の茎の両側にラックの上に配置硬い紙のカバーを必要とすることができます。
3. 逆浸透水で1日に1回または2回ごとに水が袋。播種後14から10日程度、第三のルートヒントを適切な根系（ 図1）を開発した場合には、苗が接種の準備ができている。

3。線虫卵の抽出

電子メールの抽出感染した根からGGSはハッセーとBarker（1973）によって開発されたプロトコルから変更されています。

1. 線虫接種前に3〜4日、感染したトマトの根から根こぶ線虫の卵を抽出します。卵の抽出を開始する前に、汚染を避けるためにお湯で十分に作業領域を洗ってください。また、お湯で洗うブレンダー、2つのバケット、ワイヤメッシュのサポート、ゴム槌、425の3ふるい、90と25μmの開口部、メスシリンダーとはさみ。
2. 次の順序で上から下までふるいをスタック：425、90、25μmの開口部。卵は下部に25μmのふるい上で収集されます。シンクでサポートされている金網にモレキュラーシーブを入れてください。実行して、ソリューションを収集するためにワイヤーメッシュの下にバケツを置く。
3. 接種源として使用される感染した植物（s）のトップを切って、捨ててください。慎重にポットから植物を削除します。水の完全なプラスチック製のバケツの中に浸漬することにより根を洗います。実行の下にさらに根をすすぎ土壌粒子は根から洗い流されるまで、水を寧。
4. 小さな部分にハサミで根をカット。主根を処分してください。
5. 蓋付きの大きなプラスチック瓶に単一の植物から根のみじん切りを入れ、根をカバーし、蓋を閉じるには、ちょうど足りるだけの10％漂白剤溶液を追加します。
6. 2分間根を含むjarファイルを横に振る。
7. jarファイルを開き、上部ふるいの上に根を注ぐと霧吹きノズルに取り付けられたホースで洗浄する。すべての漂白剤の臭いがなくなるまでよく洗います。ふるい孔を目詰まりを避けるためにモレキュラーシーブの側面をタップする木槌を使用しています。
8. トップシーブを取り外し、第二ふるい上に残渣を洗い流してください。
9. 第二ふるいを削除し、最後のふるいから、卵を含む微細な破片を収集します。水のボトルから穏やかな流れで、モレキュラーシーブの一方の側に破片を移動します。最小量の水ときれいなビーカーに破片や卵を収集します。
10. もう一度ふるいで収集された水エスケープされた可能性のあるすべての卵を収集するために25μmのふるいを通してバケット。水でよくすすぎ、同じビーカーに収集されます。
11. トップふるいから植物の残骸を破棄し、加圧された水で十分にすべての3つのふるいを洗浄する。それは細孔サイズを歪める可能性があるふるいのメッシュ部分には触れないでください。

4。ハッチング線虫卵

1. キムワイプ紙のいくつかの層に沿ってきれいな金属製のバスケットをガラスペトリ皿に収まる。バスケット、皿の底部との間に1cmの距離を可能にします。
2. ワイヤーバスケットで紙の上に抽出した線虫の卵を注ぎます。ワイヤーバスケットの底が水面に触れるが、水に浸漬されないように十分な液体を追加します。プラスチック製のふたで上部をカバーしています。
3. 毎日、水の蒸発をチェックし、バスケットの底が水に触れるように、ペトリ皿に水を追加します。これは乾燥から卵を防ぐことができます。
4. 一日おきに、waを収集するビーカーにペトリ皿からJ2Sが含まれていますTER。すぐに使用しない場合は、水槽ポンプによって生成されたラボの空気供給または空気を用いて室温で収集された接種材料を通気する。 2日以内に気泡接種を使用しています。 J2Sは6-8日の期間にわたって設定孵化から収集することができます。

5。トマトの根鉢またはトレイで感染し、感染性の評価

1. カウントスライドまたは皿にJ2Sの数を数えるために収集された線虫の3アリコートを使用して、平均値を計算し、接種のために必要なボリュームを決定します。通常は3000 J2Sはポットと苗トレイに生育した植物500 J2Sで工場ごとに使用されています。
2. 低速で、磁気撹拌プレート上で接種をかき混ぜる。
3. あなたが植物に接種する前に、土壌が湿った、あまりにも濡れていないことを確認してください。ポット接種のために、鉛筆（ 図2を使用して、それぞれのトマトの根系の周囲に砂の中に約半分の鍋の深さの3つの穴を作る
4. トレイのハイスループットスクリーニングのために、土壌にJ2Sを提供するピペッターに沿って5 mlのピペットチップ（ 図3）に接着側面の穴に変更された密封された先端の針を使用しています。また、線虫は、ステップ5.3のように配信することができます。
5. 24から27までの温室で植物を維持°C 6〜8週間のために。ミラクル·グロで月に二回受精を続けています。
6. 感染症の評価のために、慎重に鉢から植物を除去し、根を（ステップ3.3で説明されるように）洗ってください。
7. 15分間は、1 mg / L erioglaucineに根を浸して青色の卵塊を染色する。
8. 水中で根を洗い、個々の根系に染色された卵塊を数えることによって評価する。照らされた机の拡大鏡は、卵塊を視覚化するために使用することができます。
9. スクリーニングされた植物は、さらにgの必要な場合enetic研究では、評価のための根を洗浄する前に、上部をカットしないでください。染色と卵塊数をカウントした後、有機質土壌に苗を移植し、温室効果の蒸散を軽減し、維持するために頻繁にトップをプルーニングします。

6。ポーチや感染症の評価におけるササゲの根の感染

1. 線虫の接種をカウントし、前述のように磁気攪拌プレート上でかき混ぜる。
2. 水平な面の上にぶら下がって、フォルダや場所から袋を削除します。 5ミリリットル1500 J2S各ポーチを接種する。ポーチのプラスチックカバーを持ち上げて、根の表面に均等に線虫を配布しています。
3. 光を除外するには、暗い紙で覆われた接種24時間後の水平方向の位置で袋を維持し、成長チャンバー内で吊り下げフォルダに戻ります。
4. 表1に 、半強度ホーグランドのソリューション（ホーグランド＆アルノン、1950年の水植物を、必要に応じて、一回または1日2回、
5. 接種後約30日（範囲28から35日）、75 mg / Lでerioglaucineの約10〜20 mlの各ポーチを吹き込む。一晩水平に染料が殺到袋に保管してください。
6. 袋を切り、照明デスクルーペの下に卵塊を数えることによって、根系を評価します。
7. スクリーニングされた植物は、慎重に温室内で、紙から根を引き抜くポットに有機質土壌に移植し、維持、さらに遺伝学的研究または繁殖の仕事のために必要な場合。

7。代表的な結果

説明した2つのシステムのための線虫接種のためにトマトとササゲ植物の適切な段階は、 図に示されている1と2。加えて、トマトとササゲのよく感染根の例は図4と図5に示されています。ほとんどの病害抵抗性の画面のように、それは感染率の平均を計算するために、線虫接種のための遺伝子型ごとに少なくとも6月10日の植物を使用することをお勧めします。植物の間に線虫感染における変化は、同一の遺伝子型から、均一な植物のサイズと正確な量と接種​​の配信を使用することによって削減することができます。

トレイと成長の袋の使用は、小さな成長の空間での植物の数百〜数千のスクリーニングが可能になります。成長ポーチも洗濯根（ 図4）を必要とせず、根こぶ線虫感染症の迅速かつ効率的な非破壊評価を可能にします。

図1：2週齢のササゲ植物ポーチに成長し、根こぶNEMAの準備戸出接種。

図根こぶ線虫の接種2。3週齢のトマト植物の準備。

図3線虫のハイスループット接種のために使用される変更された針とピペットチップ。針の下には、封印されたと正孔の3つのセットは、レーザービームを使用して針で掘削された。その後、変更された針は、5 mlのピ​​ペットの先端に接着された。

図4。根こぶ線虫に感染したトマトの根系。

図5で成長erioglaucine 30日後接種で染色した卵塊とササゲの根系28℃

Discussion

そこに成功した線虫の画面の2つの重要な手順は次のとおりです。非常に感染性接種の準備と適切な発達段階で植物を使用します。根こぶ線虫卵の孵化率は5〜非常に変数と範囲である - 50％。したがって、ハッチ、非常に感染J2Sの最適なレベルを得るために、細心の注意が卵抽出および孵化手順に支払わなければならない。卵は、最低期間の漂白剤にさらされるべきであり、漂白剤は、ルートの混合物からうまくリンスする必要があります。時孵化卵は、卵を含むスラリーは、水に沈めてはいけません。さらに、孵化した稚魚が収集された基本的なペトリ皿に卵をこぼし避けてください。孵化プロセス中に卵をこぼし回避する一つの方法は、紙が破損するおそれがあるとして、キムワイプに直接水を追加することではありません。代わりに、ペトリ皿に直接水を追加します。

最良の結果を得るために、新たに孵化したJ2Sを使用しています。 HATC場合hの速度が低く、より多くの接種が必要な場合は、J2Sは長い期間を15℃で保存することができます。接種前に虫を復活させるために室温に保存されている接種を温める。しかし、たとえ15歳で長期間J2Sを格納していない°C飢えJ2Sが効率的に感染しませんように。

若い苗は根こぶ線虫接種のための最高の発達段階があります。しかし、これはJ2S用のエントリポイントとして根の十分な数を提供する十分な根系の形成とバランスする必要があります。最適な植物の成長条件を維持しても画面が非常に重要です。特別に袋で栽培それらオーバー散水植物を避けることができます。過剰散水袋を、袋の底に水を立っているで示されるように、真菌の増殖を促進し、根の健康を減少させることができます。

線虫の感染と卵/ルートシステムと卵/周波数のグラム数の計算のアッセイをさらに評価の両方を持つshのルートを行うことができます。トマトアッセイについては、個々のルーツを秤量し、卵が接種の準備（セクション3）で説明したように抽出されます。植物の多数のサンプルを処理するとき、個々のルートシステムは、卵抽出のためにブレンダーを用いて浸軟することができます。卵の数は、少なくとも3つのアリコートと計算された新鮮な根系の卵/グラムでカウントする必要があります。ポーチアッセイのために、根系は、用紙の挿入をオフに引っ張ら秤量し、卵が抽出されます。