Summary
في هذه المقالة الفيديو وصفنا استخدام جديد
Abstract
التهاب القرنية الهربس هو واحد من أشد الأمراض المرتبطة بفيروس الهربس البسيط من النوع 1 (HSV-1). التهاب القرنية الهربس هو حاليا السبب الرئيسي للعمى القرنية سواء المستمدة من العدوى المرتبطة بها وفي العالم المتقدم. عرض نموذجية من التهاب القرنية الهربس تشمل التهاب في ظهارة القرنية وأحيانا سدى القرنية أعمق والبطانة، مما يؤدي إلى الأمراض مثل القرنية كما تندب دائم، رقيق، والتعتيم 1.
تدرس تقليديا القرنية HSV-1 الإصابة في نوعين من النماذج التجريبية. ونموذج في المختبر، حيث يتم تربيتها من المصابين monolayers الخلايا الظهارية القرنية في طبق بتري، ويقدم بساطة، مستوى عال من التكرار والتجارب سريع، وتكاليف منخفضة نسبيا. من ناحية أخرى، فإن نموذج في الجسم الحي، حيث يتم تلقيح الحيوانات مثل الأرانب أو الفئران مباشرة في القرنية، ويقدم الفسيولوجية متطورة للغايةالنظام، ولكن لديه ارتفاع التكاليف، تعد التجارب، من الضروري رعاية الحيوانات، ودرجة أكبر من التباين.
في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم مظاهرة مفصل لنموذج جديد من خارج الجسم القرنية الطلائية العدوى HSV-1، والذي يجمع بين نقاط القوة في كل من المختبر في وفي نماذج الجسم الحي. نموذج الجسم الحي السابقين يستخدم القرنيات سليمة الحفاظ organotypically في الثقافة والمصابين HSV-1. استخدام نموذج الجسم الحي السابقين يسمح للغاية من الناحية الفسيولوجية الاستنتاجات المستندة، ومع ذلك فهو غير مكلفة نوعا ما، ويتطلب التزاما زمنية مماثلة لتلك التي في النموذج المختبر.
Protocol
تم شراء جميع المعدات والكواشف معقمة أو تم تعقيمها قبل الإجراء. توضح هذه المقالة خطوات إنشاء نموذج الجسم الحي السابقين بدءا العين قبل منزوعة النواة. في تجاربنا، ونحن نستخدم كل مقل العيون العذبة من الأرانب (8-12 أسبوعا) الشباب البيضاء (PEL-فريز الحيوية، روجرز، AR). وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم القرنيات الإنسان الحصول عليها من بنك العيون المحلية. إذا أداء استئصال نفسك، أن تحرص على تجنب إتلاف القرنية أو حوف وأثناء العملية. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات استئصال الأرانب في أماكن أخرى 2.
الجزء 1: استئصال القرنية والصلبة زر
- الرطب شريط ضيق من الشاش مع PBS وألفه حول مقلة العين لتسهيل عقده أثناء العملية.
- استخدام مشرط حاد لجعل شق عرضية في الصلبة، حوالي 0.5 سم بعيدا عن حوف.
- استخدام مقص حاد لتوسيع شق والمكوس تماما جorneoscleral زر.
- مرة واحدة على زر يتم عزل القرنية والصلبة، ندف بعيدا القزحية في حين الضغط على حافة الصلبة مع ملقط. تجنب إتلاف البطانة أو ممارسة الضغط المفرط على القرنية.
الجزء 2: مقدمة القرنية في الثقافة عضوي النمط
- يتم استزراع القرنيات في Explanted متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع غير الأحماض الأمينية الأساسية (1X)، الجلوتامين L-(2 ملم)، البنسلين (200 U / مل)، والستربتوميسين (200 ميكروغرام / مل). ويمكن أيضا وكيل المضادة للفطريات، مثل الأمفوتريسين، تضاف إذا لزم الأمر.
- إعداد الحل الاغاروز 1٪ في المتوسط الثقافة وابقائه على استعداد في C. ° 55
- شطف جيدا القرنية في معقمة تحتوي على البنسلين PBS (200 U / مل) والستربتوميسين (200 ميكروغرام / مل).
- وضع الجانب القرنية الطلائية إلى أسفل داخل بئر لوحة بقعة العقيمة.
- إضافة المتوسطة المحتوية على الاغاروز إلى التقعر البطانية للقرنية يكفي لملئه بالكامل. ~ 1 دقيقة تسمح للالاغاروز لترسيخ.
- وضع القرنية مع دعم ثقافة المتوسط هلام سقالة الجانب الظهارية حتى في طبق نسيج الثقافة 35 مم وإضافة لتغطية سطح الظهارية.
- قد يكون مثقف القرنية في هذا المجال لأكثر من أسبوع، مع تغييرات المتوسطة كل 48 ساعة.
الجزء 3: عدوى مع HSV-1 والعلاج بالأدوية التجريبية
- إضافة 1 مل من المتوسط الذي يحتوي على المبلغ المطلوب من الفيروس في طبق نسيج الثقافة 35 مم. نحن تصيب عادة مع PFU 4 1x10 من سلالة KOS HSV-1 في القرنية. يتم تحديد التتر مخزوننا من خلال إجراء فحوصات على البلاك monolayers CV-1.
- وضع القرنية مع الجانب سقالة الاغاروز الظهارية أسفل إلى المتوسطة التي تحتوي على الفيروس.
- وضع القرنية إلى الأنسجة حاضنة الثقافة لتصيب ل1 ساعة متقطعة مع هزاز كل 10-15 دقيقة.
- بعد 1 ساعة، نضح الفيروس-CONTAIنينغ المتوسطة وشطف 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي جزيئات المتبقية الفيروسية.
- وضع القرنية مرة أخرى إلى مكانتها السابقة وإضافة جديدة لتغطية مستنبت سطح الظهارية.
- ويمكن أن يبدأ العلاج التجريبي قبل أو بعد العدوى، وتبعا لطبيعة التجربة.
- يتم تغيير ثقافة المتوسط كل 48 ساعة.
جزء 4: جمع عينة
- المتوسطة لتحليل فحص اللوحة. اخلطي جيدا والمتوسطة استخدامه على الفور لفحص اللوحة أو المحل في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا إذا جمع العينات في نقاط زمنية مختلفة.
- DNA، RNA والبروتين، أو خلايا من ظهارة القرنية
- إزالة السقالة الاغاروز وشطف القرنية بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني.
- يتم جمع الضرائب حلقة من الأنسجة الصلبة من القرنية للتأكد من أن المواد القرنية الطلائية فقط.
- Uالغناء مشرط، كشط القرنية الخلايا الظهارية في المخزن المؤقت المناسبة، اعتمادا على نوع المادة المراد عزلها. لعزل DNA و RNA، ونحن نستخدم عدة الدم والأنسجة DNeasy وكيت RNeasy البسيطة، على التوالي (QIAGEN، هيلدن، ألمانيا). لجمع البروتين لست]، ونحن نستخدم Laemmli العازلة. لتحليل التدفق الخلوي للخلايا الظهارية القرنية، ونحن قبل احتضان القرنيات في كمية صغيرة من التربسين لتخفيف الخلايا، ومن ثم إخراجهم إلى التربسين مع مشرط. منذ إلغاء ظهارة القرنية لا تسفر عن كميات متساوية من الأنسجة، من المهم أن تشمل الضوابط المناسبة عند تحليل العينات. 18S الرنا الريباسي نستخدم كذلك نص الإشارة الواردة في تقارير إتمام المشروعات QRT-، GAPDH باسم الجينات الإشارة في qPCRs، ونوكليولين كعنصر تحكم التحميل للالبقع الغربية.
- عينات الأنسجة المناعية لأو المناعي
- إزالة السقالة الاغاروز وشطف الذرةEA بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني.
- اعتمادا على هدفك التجريبية، استخدم القرنية لجعل كتلة الأنسجة البارافين أو كتلة الأنسجة المجمدة، كما هو موضح في الفيديو. نتبع الإجراءات المعيارية عند إعداد أقسام الأنسجة القرنية.
ممثل النتائج
يمكن معظم الطرق المتاحة لدراسة الخلايا في زراعة الأنسجة تكييفها بسهولة للاستخدام في القرنيات المصابين فيفو HSV-1 السابقين. النتائج المعروضة هنا هي ممثل لعدد قليل من التقنيات الأكثر شيوعا التي تنطبق على دراسة HSV-1 العدوى - qPCR (1D الشكل)، QRT-PCR (1B الشكل)، لطخة ويسترن (الشكل 1F)، فحص اللوحة (الشكل 1C)، و المناعي الأنسجة (الشكل 1E).
الشكل 1. تحليل القرنيات المصابين HSV-1 V EXايفو. (A) تمثيل تخطيطي لنموذج الجسم الحي السابقين من القرنية الطلائية الحاد عدوى HSV-1. (BF) تحليل القرنيات المصابة باستخدام طريقة الموضحة في هذه المقالة الفيديو. أصيب القرنيات الأرنب Explanted مع 1x10 4 القرنية / PFU من سلالة KOS HSV-1 ومثقف في وجود (PAA) أو غياب (موك) من حمض phosphonoacetic (400 ميكروغرام / مل)، المانع من تكرار HSV المعروفة. (B) وقد تم جمع الحمض النووي الريبي مجموع النقاط في الوقت المشار إليه، وجرى تقييم النسخ الفيروسية من QRT-PCR مع الاشعال للبوليميريز HSV-1. الاشعال ضد 18S الرنا الريباسي استخدمت كمرجع. ن = 3. أشرطة الخطأ تشير ± SEM. (C) تم جمع ثقافة المتوسط في 48 HPI، وجرى تقييم المعدية إنتاج الجسيمات عن طريق الاختبار الصفائحي على monolayers CV-1 (D) وقد تم جمع إجمالي DNA في 48 HPI، وجرى تقييم الفيروسية تكرار الجينوم في مقايسة qPCR مع الاشعال للجينوم HSV-1. العلاقات العامةواستخدمت ضد imers GAPDH كمرجع. ن = 3. أشرطة الخطأ تشير ± SEM. (E) وموك المعالجة القرنيات فلاش المجمدة في 48 HPI، مقطوع، وتحليلها بواسطة المناعي غير المباشر لوجود البروتين الفيروسي في وقت مبكر (ICP8) داخل الظهارة المصابة. وcounterstained نوى مع ببتون 33258. (F) تم جمع لست] بروتين في 48 HPI، وجرى تقييم تعبير عن البروتين الفيروسي (ICP0) من لطخة غربية. واستخدم فحص BCA لضمان المساواة التحميل من العينات. HPI = ساعات العدوى آخر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة الفيديو وصفنا طريقة لدراسة القرنية الطلائية الحاد HSV-1 الإصابة في نموذج الجسم الحي السابقين. هذا النموذج هو نقطة انطلاق مفيدة بين في المختبر والمجراة في نماذج، لأنه يسمح للمصادقة الناحية الفسيولوجية-دقيق لنتائج زراعة الخلايا، وبالتالي يحد من كمية التجارب على الحيوانات التي يجب أن يؤديها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النموذج السابق فيفو يوفر فرصة فريدة وقيمة لدراسة الظهارية الهربس العدوى في الإنسان القرنيات سليمة. المبينة أدناه هي بعض الاعتبارات التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند استخدام هذا النموذج:
- من المهم التأكيد على أن ليس المقصود النهج المذكورة في هذه المقالة الفيديو لتكون نموذجا للالتهاب القرنية الهربس، بل هو نموذج للعدوى القرنية الطلائية الحاد HSV-1. الهربس هو التهاب القرنية نتيجة لعمليات الخلط عدة، بما في ذلك العدوى، والتهاب، وايم المضيفاستجابة المناعية للفيروس. المستضد CD4 محددة CD8 + + واستجابات الخلايا T هي عنصر هام من التسبب في التهاب القرنية الهربس، والتي لا يمكن استنساخها في هذا النموذج، لأن القرنيات explanted لا تخضع لتسلل خلايا الجهاز المناعي. لهذا السبب، لا تتطور لديهم قرحة النموذجية شجيري الظهارية وتفتقر إلى المشاركة في انسجة القرنية احظ كلاسيكي الهربس اللحمية 3. ولذلك، وسجل لشدة المرض والتصوير فلوريسئين من قرحة القرنية غير ممكن في نموذج الجسم الحي السابقين. وبالإضافة إلى ذلك، هي سبب معظم حالات التهاب القرنية الهربس عن طريق إعادة تنشيط الفيروسات من الكمون. منذ نهجنا تعتمد على العدوى مباشرة من القرنيات explanted بفيروس الخارجية، ومن نماذج الحاد HSV-1 العدوى القرنية وليس المرض إعادة التنشيط. لهذه الأسباب، فإن النموذج المقدم هنا ليس مناسبا لفهم علم الأمراض العام للمرض، ولكن بدلا SHولد استخدامها لدراسة تكاثر الفيروس والتفاعلات الفيروسات المضيفة بدقة في ظهارة القرنية.
- التهاب القرنية الهربس السابقين فيفو نموذج تعطي نتائج أكبر من التباين في تجارب المختبر زراعة الأنسجة. هذا ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن يتم جمع كل من القرنية أرنب مختلفة ويمكن معالجتها بشكل مختلف قليلا. القرنيات البشرية تظهر التباين أكبر من النتائج من القرنيات الأرنب، لأنها تنبع من الجهات المانحة من العمر متغير والعرق والحالة الصحية، ويتم الاحتفاظ لكميات مختلفة من الوقت بعد الوفاة. ومع ذلك، مع استخدام لا يقل عن خمسة القرنيات في العلاج التجريبي، كنا قادرين على توليد البيانات إحصائيا، يمكن الاعتماد عليها.
- الطريقة التقليدية لزراعة القرنيات 4-5 explanted يوحي باستخدام يكفي ثقافة المتوسط لتغطية حوف القرنية. وجدنا أن زيادة كمية متوسطة لتغطية تماما ظهارة تعطي نتائج أكثر اتساقا،الأرجح بسبب التقليل من الاختلافات بين الحصول القرنيات الفرد للعقاقير المتوسطة والتجريبية الواردة فيه.
- عند استخدام القرنيات الأرنب لاستخدام أي تطبيق الأجسام المضادة، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن الأجسام المضادة التقليدية مع خصوصيات الإنسان ل، الجرذ، الفأر، وما إلى ذلك من المرجح أن لا ضد مستضدات الأرانب عبور الرد. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن الثانوية المضادة للأرنب الأجسام المضادة بالطبع أن تستخدم في هذه التطبيقات. لهذه الأسباب، ونحن نستخدم القرنيات الإنسان في التجارب التي تنطوي على تلطيخ الأجسام المضادة للأهداف الخلوية.
- عند جمع الخلايا الظهارية للتحليل التدفق الخلوي، يجب أن نكون حذرين مجرب حول تأثير التربسين على غشاء محدد البروتينات. وهكذا، للكشف عن البروتينات السطحية، قد يكون من المفيد استخدام وسائل أخرى لطرد الخلايا، مثل البروتياز collagenases أو غير التربسين.
- النماذج الحيوانية من التهاب القرنية الهربس خدش القرنية تعتمد على التلقيح قبل معالفيروس. لقد تمكنا من تحقيق مستويات ثابتة من دون خدش للعدوى القرنيات explanted. هذا هو على الأرجح بسبب عدم وجود الفيلم المسيل للدموع وامض التي تقضي على الفيروس بسرعة من سطح القرنية في الحيوانات الحية.
التعديلات المحتملة للنموذج الجسم الحي السابقين التهاب القرنية الهربس لم تستكشف في هذه المقالة الفيديو:
- الجينية تعديل الخلايا الظهارية القرنية للإصابة قبل HSV-1 باستخدام طرق التسليم DNA المستخدمة في زراعة الخلايا والبحوث في العلاج الجيني، مثل ترنسفكأيشن، والتسليم الفيروسية، ويعد العدة الجين 6.
- استخدام GFP، معربا عن HSV-07-08 يناير أو FITC، مترافق الأجسام المضادة المقاومة للHSV 9-10 بصريا لتقييم مدى الإصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وكان ذلك بدعم من بنك العيون ليونز وادي ديلاوير لا تقدر بثمن لهذا العمل. كان الضد الأولية الماوس وحيدة النسيلة ضد ICP8 هدية عينية من الدكتور ديفيد Knipe (كلية هارفارد الطبية). نشكر أيضا الدكتور ستيفن جينينغز (جامعة دريكسيل كلية الطب) والدكتور بيتر Laibson (الوصايا معهد العيون) لإجراء مناقشات مفيدة والخبرات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
- Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
