Summary
In questo video articolo si descrive l'uso di una nuova
Abstract
Cheratite da herpes è una delle patologie più gravi associati al virus herpes simplex di tipo 1 (HSV-1). Cheratite Herpes è attualmente la principale causa di cecità sia cornea-derivata e associata ad infezione nel mondo sviluppato. Presentazione tipica di cheratite da herpes include infezione dell'epitelio corneale e talvolta più profonda stroma corneale e endotelio, portando a tali patologie corneali permanenti come cicatrici, assottigliamento e opacità 1.
Corneale HSV-1 infezione è tradizionalmente studiato in due tipi di modelli sperimentali. Il modello in vitro, in cui vengono coltivate infettato monostrati di cellule epiteliali corneali in una capsula di Petri, offre semplicità, elevato livello di replicabilità, esperimenti veloci e costi relativamente bassi. D'altra parte, il modello in vivo, in cui vengono inoculati animali come conigli o topi direttamente nella cornea, offre una fisiologica altamente sofisticatosistema, ma ha costi più elevati, più lunghi esperimenti, per la cura degli animali necessari, e un maggior grado di variabilità.
In questo articolo video, forniamo una dimostrazione dettagliata di un nuovo modello ex vivo di corneale HSV-1, che unisce i punti di forza sia in vitro e in vivo. Il modello ex vivo utilizza cornee intatte organotypically mantenute in coltura e infettati con HSV-1. L'uso del modello ex vivo permette conclusioni altamente fisiologicamente basati, tuttavia è piuttosto costoso e richiede impegno di tempo paragonabile a quella del modello in vitro.
Protocol
Tutti i reagenti sono stati acquistati ed attrezzature sterili o sono stati sterilizzati prima della procedura. In questo articolo viene descritta la procedura di impostazione del modello ex vivo inizia con un pre-enucleato occhi. Nei nostri esperimenti, usiamo freschi bulbi oculari interi da giovani (8-12 settimane) conigli albini (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Inoltre, utilizziamo cornee umane ottenute dalla banca degli occhi locale. Se si esegue l'enucleazione te stesso, fare attenzione a non danneggiare la cornea o il limbo nel corso della procedura. Protocolli di enucleazione Coniglio può essere trovato altrove 2.
Parte 1: L'escissione del pulsante corneosclerale
- Bagnare una stretta striscia di garza con PBS e avvolgerlo intorno al bulbo oculare per facilitare la presa durante il procedimento.
- Utilizzare un bisturi affilato per fare una tangenziale incisione nella sclera, circa 0,5 cm di distanza dal limbus.
- Paio di forbici affilate per estendere l'incisione e completamente delle accise, la cpulsante orneoscleral.
- Una volta che il pulsante corneosclerale è isolato, prendere in giro via il diaframma mentre si tiene il cerchio sclerale con una pinza. Evitare di danneggiare l'endotelio o esercitare sollecitazioni eccessive sulla cornea.
Parte 2: Introduzione di Cornea in Cultura organotipiche
- Cornee espiantate vengono coltivate in Medium minimo (MEM) supplementato con amminoacidi non essenziali (1X), L-glutammina (2 mM), penicillina (200 U / ml) e streptomicina (200 mcg / ml). Un agente antifungino, come amfotericina, possono anche essere aggiunti, se necessario.
- Preparare una soluzione di 1% agarosio in mezzo di coltura e tenerlo pronto a 55 ° C.
- Sciacquare la cornea in PBS sterile contenente penicillina (200 U / ml) e streptomicina (200 mcg / ml).
- Posizionare il lato epiteliale della cornea giù in un pozzetto di una piastra sterile posto.
- Aggiungere l'agarosio mezzo contenente la concavità endoteliale della cornea quanto basta perriempirlo completamente. Permettono ~ 1 min per l'agarosio a solidificare.
- Posizionare la cornea con il terreno di coltura di supporto gel lato epiteliale scaffold su in un piatto di coltura tissutale 35 millimetri e aggiungere per coprire la superficie epiteliale.
- La cornea può essere coltivato in questo modo per più di una settimana, con cambiamenti medi ogni 48 ore.
Parte 3: L'infezione da HSV-1 e il trattamento con farmaci sperimentali
- Aggiungere 1 ml di terreno contenente la quantità desiderata di virus in un piatto di coltura tissutale 35 millimetri. Di solito infettare con 1x10 4 PFU del ceppo KOS HSV-1 per cornea. I nostri titoli azionari sono determinati con saggi di placca sulla CV-1 monostrati.
- Posizionare la cornea con il lato agarosio scaffold epiteliale giù nel terreno contenente virus.
- Posizionare la cornea in una coltura tissutale incubatore di infettare per 1 ora con dondolo intermittente ogni 10-15 min.
- Dopo 1 ora, aspirare il virus-conteNing medie e sciacquare 2-3 volte con PBS per rimuovere eventuali particelle residue virali.
- Posizionare la cornea nella sua posizione precedente e aggiungere mezzo fresco coltura per coprire la superficie epiteliale.
- Trattamenti sperimentali può essere iniziata prima o dopo l'infezione, a seconda della natura dell'esperimento.
- Terreno di coltura viene cambiato ogni ora 48.
Parte 4: Raccolta dei campioni
- Media per l'analisi della placca dosaggio. Miscelare il mezzo di bene e utilizzarlo immediatamente per un saggio di placca o conservare a -80 ° C per un uso successivo, se il prelievo dei campioni in momenti diversi.
- DNA, RNA, proteine, o cellule di epitelio corneale
- Rimuovere il patibolo agarosio e sciacquare bene la cornea con PBS.
- Accise l'anello di tessuto sclerale dalla cornea per garantire che solo i materiali corneale viene raccolto.
- Ucantare un bisturi, raschiare le cellule epiteliali corneali nel buffer appropriata, a seconda del tipo di materiale da isolare. Per l'isolamento di DNA e RNA, si usa il Kit DNeasy Blood & Tissue e il kit RNeasy Mini, rispettivamente (Qiagen, Hilden, Germania). Per la raccolta dei lisati proteici, usiamo tampone Laemmli. Per l'analisi di citometria a flusso di cellule epiteliali corneali, si pre-incubare le cornee in una piccola quantità di tripsina per allentare le cellule, e quindi rimuoverli in tripsina con un bisturi. Poiché raschiare l'epitelio corneale non produce la stessa quantità di tessuto, è importante comprendere controlli appropriati quando si analizzano i campioni. Usiamo rRNA 18S come una trascrizione di riferimento in RT-PCR, GAPDH come gene di riferimento in qPCRs, e nucleolina come controllo di carico per Western blot.
- I campioni di tessuto per immunoistochimica o immunofluorescenza
- Rimuovere il patibolo agarosio e sciacquare il maissincerarsi bene con PBS.
- Seconda obiettivo sperimentale, utilizzare la cornea per fare un blocco di tessuto paraffina o un blocco di tessuto congelato, come mostrato nel video. Seguiamo le procedure standard per la preparazione sezioni di tessuto corneale.
Risultati rappresentativi
La maggior parte dei metodi disponibili per studiare le cellule in coltura tissutale può essere facilmente adattato per l'uso in cornee infettati con HSV-1 ex vivo. Visualizzati sono risultati rappresentativi per alcune delle più comuni tecniche applicabili allo studio HSV-1 - qPCR (Figura 1D), qRT-PCR (Figura 1B), Western blot (figura 1F), saggio di placca (Figura 1C), e tessuto immunofluorescenza (Figura 1E).
Figura 1. Analisi di cornee infettati con HSV-1 ex vIvo. (A) Rappresentazione schematica del modello ex vivo di acuta corneale HSV-1. (BF) Analisi delle cornee infette con il metodo descritto in questo articolo video. Cornee espiantate coniglio sono stati infettati con 1x10 4 PFU / cornea del ceppo KOS HSV-1 e coltivate in presenza (PAA) o assenza (Mock) di acido fosfonoacetico (400 mcg / ml), noto inibitore della replicazione di HSV. (B) RNA totale è stato raccolto nei punti temporali indicati, e trascrizione virale è stata valutata mediante RT-PCR con primer per HSV-1 polimerasi. Primers contro 18S rRNA sono stati utilizzati come riferimento. n = 3. Le barre di errore indicano ± SEM. (C) Il terreno di coltura è stato raccolto in 48 hpi, e la produzione di particelle infettive è stata valutata mediante saggio di placca su monostrati CV-1. (D) DNA totale è stato raccolto in 48 hpi, e la replicazione del genoma virale è stata valutata in un saggio qPCR con primer per il genoma HSV-1. Premporizzatori contro GAPDH sono stati utilizzati come riferimento. n = 3. Le barre di errore indicano ± SEM. (E) Mock-trattati cornee sono stati rapidamente congelati a 48 hpi, sezionato, e analizzati mediante immunofluorescenza indiretta per la presenza di una proteina virale precoce (ICP8) entro l'epitelio infetto. Nuclei sono contrastate con Höchst 33.258. (F) lisati proteici sono stati raccolti a 48 hpi, e l'espressione di una proteina virale (ICP0) è stata valutata mediante Western blot. BCA saggio è stato utilizzato per garantire caricamento parità di campioni. HPI = ore post infezione.
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Discussion
In questo video articolo si descrive un metodo per lo studio acuta corneale HSV-1 in un modello ex vivo. Questo modello è un passo utile tra la in vitro e in vivo, perché permette di convalida fisiologicamente accurata dei risultati di coltura cellulare e, quindi, limita la quantità di sperimentazione animale che deve essere eseguita. Inoltre, il modello ex vivo offre un'opportunità unica e preziosa per lo studio epiteliale infezione da herpes in intatti cornee umane. Riportate qui di seguito sono alcune considerazioni che devono essere presi in considerazione quando si utilizza questo modello:
- E 'importante sottolineare che l'approccio descritto in questo articolo il video non vuole essere un modello di cheratite da herpes, ma è piuttosto un modello di forte corneale HSV-1. Cheratite Herpes è il risultato di diversi processi di confondimento, tra cui infezioni, infiammazioni, e l'im ospiterisposta immunitaria al virus. Antigene-specifica CD4 + e CD8 + risposte di cellule T sono una componente significativa della patogenesi di cheratite da herpes, che non possono essere riprodotti in questo modello, perché cornee espiantate non sono soggette ad infiltrazione di cellule del sistema immunitario. Per questo motivo, non sviluppano le ulcere tipiche dendritiche epiteliali e manca il coinvolgimento stromale classicamente osservato in cheratite stromale herpes 3. Pertanto, il punteggio della gravità della malattia e di imaging fluoresceina di ulcere corneali non è possibile nel modello ex vivo. Inoltre, la maggior parte dei casi di cheratite da herpes sono causati da riattivazione virale dalla latenza. Dal momento che il nostro approccio si basa su infezione diretta delle cornee espiantate con virus esogeno, si modella acuta da HSV-1 infezione della cornea e non la malattia riattivazione. Per queste ragioni, il modello presentato qui non è appropriato per la comprensione della patologia complessiva della malattia, ma piuttosto should essere usato per studiare la replicazione virale e virus e ospite interazioni strettamente nell'epitelio corneale.
- Gli ex herpes vivo cheratite modello rese risultati con una maggiore variabilità rispetto al esperimenti in tessuto di coltura in vitro. Questo è probabilmente dovuto al fatto che ciascuna cornea viene raccolto da un coniglio diverso e possono essere trattati in modo leggermente diverso. Cornee umane mostrano una variabilità ancora maggiore di risultati rispetto a cornee di coniglio, in quanto provengono da donatori di età variabile, razza e stato di salute, e sono conservati per diverse quantità di tempo dopo la morte. Tuttavia, con l'uso di almeno cinque cornee per trattamento sperimentale, siamo stati in grado di generare dati affidabile statisticamente.
- Il metodo tradizionale per la coltura delle cornee espiantate 4-5 suggerisce utilizzando terreno di coltura appena sufficiente a coprire il limbo della cornea. Abbiamo scoperto che aumentando la quantità di mezzo di coprire completamente l'epitelio produce risultati più coerenti,probabilmente a causa di minimizzare le differenze tra cornee accesso singoli ai farmaci medie e sperimentale ivi contenute.
- Quando si utilizza cornee coniglio per qualsiasi applicazione utilizzando anticorpi, è importante tenere presente che gli anticorpi con specificità tradizionali umano, topo, ratto, ecc probabilmente non cross-reagiscono contro antigeni coniglio. Inoltre, secondari anti-coniglio ovviamente non possono essere utilizzati in queste applicazioni. Per queste ragioni, usiamo cornee umane in esperimenti di colorazione anticorpale di bersagli cellulari.
- Quando si raccolgono le cellule epiteliali per l'analisi di citometria a flusso, lo sperimentatore deve essere cauti gli effetti della tripsina sulla membrana associati a proteine. Così, per la rilevazione di proteine di superficie, può essere vantaggioso utilizzare altri mezzi di staccare le cellule, come le collagenasi o non-proteasi tripsina.
- Modelli animali di cheratite da herpes si basano su scarificazione della cornea prima dell'inoculo conil virus. Siamo stati in grado di raggiungere livelli coerenti di infezione senza scarificare le cornee espiantati. Questo è probabilmente dovuto all'assenza del film lacrimale e lampeggiante che rapidamente eliminare il virus dalla superficie corneale in un animale vivo.
Le eventuali modifiche del modello ex vivo cheratite da herpes non esplorato in questo articolo il video:
- La modificazione genetica di cellule epiteliali corneali prima di HSV-1 infezione usando metodi di consegna DNA utilizzati in coltura cellulare e nella ricerca terapia genica, come la transfezione, consegna virale, e Gunning gene 6.
- Uso di GFP-esprimere HSV-07-08 Gennaio o FITC-coniugato anti-HSV anticorpi 9-10 per valutare visivamente l'estensione dell'infezione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il sostegno della Banca degli Occhi Lions del Delaware Valley era preziosa per questo lavoro. Anticorpo di topo primario monoclonale contro ICP8 era un gentile dono del Dr. David Knipe (Harvard Medical School). Ringraziamo anche il dottor Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) e il Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) per le discussioni utili e competenze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A.
- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
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