Summary
इस वीडियो लेख में हम एक नया प्रयोग का वर्णन
Abstract
दाद keratitis एक सबसे गंभीर दाद सिंप्लेक्स 1 वायरस (एचएसवी -1) के साथ जुड़े विकृतियों के है. दाद keratitis वर्तमान में विकसित दुनिया में कॉर्निया व्युत्पन्न दोनों और संक्रमण से जुड़े अंधापन का प्रमुख कारण है. Corneal उपकला की दाद keratitis की विशिष्ट प्रस्तुति संक्रमण और कभी कभी गहरी corneal stroma और endothelium भी शामिल है, scarring के रूप में इस तरह के स्थायी corneal विकृतियों के लिए अग्रणी, thinning, और 1 अस्पष्टता.
कॉर्नियल एचएसवी 1 संक्रमण परंपरागत रूप से प्रयोगात्मक मॉडल के दो प्रकार में अध्ययन किया है. इन विट्रो मॉडल, जिसमें corneal उपकला कोशिकाओं के सुसंस्कृत monolayers एक पेट्री डिश में संक्रमित हैं में सादगी, replicability की उच्च स्तर, तेजी से प्रयोगों, और अपेक्षाकृत कम लागत प्रदान करता है. दूसरी ओर, vivo मॉडल है, जो में खरगोश या चूहों जैसे जानवरों सीधे कॉर्निया में inoculated हैं में एक अत्यधिक परिष्कृत शारीरिक प्रदान करता हैप्रणाली है, लेकिन उच्च लागत, अब प्रयोगों, आवश्यक जानवरों की देखभाल, और परिवर्तनशीलता का एक बड़ा डिग्री है.
इस वीडियो लेख में, हम corneal उपकला एचएसवी 1 संक्रमण के एक पूर्व vivo मॉडल है, जो दोनों में और vivo मॉडल में इन विट्रो की ताकत को जोड़ती है की एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करते हैं. पूर्व vivo मॉडल बरकरार organotypically संस्कृति में बनाए रखा और एचएसवी -1 से संक्रमित corneas का उपयोग किया जाता है. पूर्व vivo मॉडल का उपयोग अत्यधिक physiologically के आधार पर निष्कर्ष के लिए अनुमति देता है, अभी तक यह बल्कि सस्ती है और समय के लिए इन विट्रो मॉडल में तुलनीय प्रतिबद्धता की आवश्यकता है.
Protocol
सभी अभिकर्मकों और उपकरण बाँझ खरीदे गए थे या प्रक्रिया से पहले निष्फल रहे थे. इस लेख में पूर्व vivo पूर्व enucleated आंख के साथ शुरुआत मॉडल की स्थापना के चरणों का वर्णन करता है. हमारे प्रयोगों में, हम युवा (8-12 wks) सूरजमुखी मनुष्य खरगोश (Pel Freez बायोलॉजिकल, रोजर्स, एआर) से ताजा पूरे आंखों का उपयोग करें. इसके अलावा, हम मानव corneas स्थानीय नेत्र बैंक से प्राप्त का उपयोग करें. यदि स्पष्टीकरण अपने प्रदर्शन, देखभाल करने के लिए प्रक्रिया के दौरान कॉर्निया या किनारी हानिकारक से बचने. खरगोश स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल 2 कहीं और पाया जा सकता है.
भाग 1: स्वच्छमण्डल एवं श्वेतपटल या स्क्लेरा से संबंधित बटन के छांटना
- पीबीएस के साथ धुंध की संकरी पट्टी गीला और यह नेत्रगोलक चारों ओर लपेट के लिए यह प्रक्रिया के दौरान पकड़ की सुविधा.
- एक तेज स्केलपेल का उपयोग करने के लिए श्वेतपटल में एक स्पर्शरेखा चीरा बनाने के बारे में 0.5 सेमी किनारी से दूर है.
- तेज कैंची का उपयोग चीरा का विस्तार करने के लिए और पूरी तरह से ग आबकारीorneoscleral बटन.
- एक बार स्वच्छमण्डल एवं श्वेतपटल या स्क्लेरा से संबंधित बटन अलग है, जबकि दूर आईरिस चिढ़ाने के संदंश के साथ scleral रिम पकड़े. Endothelium हानिकारक या कॉर्निया पर अत्यधिक तनाव exerting से बचें.
भाग 2: कॉर्निया की organotypic संस्कृति में परिचय
- Corneas Explanted न्यूनतम आवश्यक (सदस्य) मध्यम गैर आवश्यक अमीनो एसिड (1x), (2 मिमी) एल Glutamine, पेनिसिलीन (200 यू / मिलीलीटर), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (200 / छ मिलीलीटर) के साथ पूरक में संवर्धित कर रहे हैं. Amphotericin के रूप में एक रोधी एजेंट, यदि आवश्यक हो तो भी जोड़ा जा सकता है.
- संस्कृति के माध्यम में एक 1% agarose समाधान तैयार है और 55 डिग्री सेल्सियस पर इसे तैयार रखना
- अच्छी तरह से बाँझ पीबीएस युक्त (200 यू / मिलीलीटर) पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (200 / छ मिलीलीटर) में कॉर्निया कुल्ला.
- कॉर्निया उपकला पक्ष एक बाँझ जगह प्लेट की एक कुएं में नीचे रखें.
- कॉर्निया के endothelial concavity agarose युक्त मध्यम सिर्फ पर्याप्त जोड़ेंयह पूरी तरह से भर. जमना ~ agarose के लिए 1 मिनट के लिए अनुमति दें.
- जेल पाड़ उपकला पक्ष का समर्थन एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में जोड़ने और संस्कृति के माध्यम उपकला सतह को कवर के साथ कॉर्निया रखें.
- कॉर्निया एक सप्ताह से अधिक के लिए इस तरह से संवर्धित किया जा सकता है मध्यम हर 48 घंटा परिवर्तन के साथ.
भाग 3: एचएसवी-1 के साथ संक्रमण और प्रायोगिक दवाओं के साथ उपचार
- एक 35 मिमी ऊतक संस्कृति डिश में वायरस के वांछित राशि युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें. हम आम तौर पर तनाव KOS कॉर्निया प्रति एचएसवी -1 के 1x10 4 pfu साथ संक्रमित. हमारे शेयर titers CV 1-monolayers पर पट्टिका assays प्रदर्शन द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.
- कॉर्निया के साथ मध्यम वायरस युक्त में नीचे agarose पाड़ उपकला पक्ष के साथ रखें.
- एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कॉर्निया प्लेस आंतरायिक कमाल हर 10-15 मिनट के साथ 1 घंटा के लिए संक्रमित.
- 1 घंटे के बाद, वायरस contai aspirateमध्यम ning और पीबीएस के साथ 2-3 बार कुल्ला करने के लिए किसी भी अवशिष्ट वायरल कणों को हटा.
- अपनी पिछली स्थिति में वापस कॉर्निया प्लेस और ताजा संस्कृति के माध्यम जोड़ने उपकला सतह को कवर.
- प्रयोगात्मक उपचार से पहले या बाद संक्रमण शुरू किया जा सकता है, प्रयोग की प्रकृति पर निर्भर करता है.
- संस्कृति मध्यम हर 48 घंटे में बदल जाता है.
भाग 4: नमूना संग्रह
- पट्टिका परख विश्लेषण के लिए मध्यम. मध्यम अच्छी तरह मिक्स और इसे तुरंत -80 में एक पट्टिका परख या दुकान के लिए उपयोग ° C के लिए बाद में उपयोग करने के लिए अगर अलग अलग समय बिंदुओं पर नमूने इकट्ठा.
- डीएनए, शाही सेना, प्रोटीन, या corneal उपकला से कोशिकाओं
- Agarose पाड़ निकालें और कॉर्निया पीबीएस के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
- Scleral ऊतक के कॉर्निया से आबकारी अंगूठी करने के लिए कि केवल corneal उपकला सामग्री सुनिश्चित करने के लिए एकत्र किया जाता है.
- यूएक स्केलपेल गाते हैं, उचित बफर में corneal उपकला कोशिकाओं को अलग किया जा सामग्री के प्रकार पर निर्भर करता है, परिमार्जन. डीएनए और आरएनए के अलगाव के लिए, हम DNeasy रक्त और ऊतक किट और RNeasy मिनी किट, क्रमशः (QIAGEN, Hilden, जर्मनी) का उपयोग करें. प्रोटीन lysates के संग्रह के लिए, हम Laemmli बफर का उपयोग करें. Corneal उपकला कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए, हम trypsin की एक छोटी राशि कोशिकाओं ढीला में corneas पूर्व सेते हैं, और फिर एक स्केलपेल के साथ trypsin में उन्हें स्थानच्युत करना. Corneal उपकला scraping ऊतक के बराबर मात्रा में उपज नहीं है के बाद से, यह महत्वपूर्ण है के लिए उपयुक्त नियंत्रण जब नमूनों का विश्लेषण शामिल है. हम qRT PCRs, GAPDH में एक qPCRs संदर्भ में एक जीन है, और पश्चिमी blots के लिए एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में nucleolin संदर्भ के रूप में प्रतिलिपि के रूप में 18S rRNA का उपयोग करें.
- Immunohistochemistry या immunofluorescence के लिए ऊतक के नमूने
- Agarose पाड़ निकालें और मक्का कुल्लापीबीएस के साथ अच्छी तरह से ea.
- अपने प्रयोगात्मक लक्ष्य पर निर्भर करता है, कॉर्निया का उपयोग करने के लिए एक पैराफिन ऊतक ब्लॉक या एक जमे हुए ऊतक ब्लॉक, के रूप में वीडियो में दिखाया गया है. हम मानक प्रक्रियाओं का पालन जब corneal ऊतक वर्गों की तैयारी कर रहा है.
प्रतिनिधि परिणाम
टिशू कल्चर में कोशिकाओं के अध्ययन के लिए उपलब्ध तरीकों के अधिकांश आसानी से HSV-1 पूर्व vivo के साथ संक्रमित corneas में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यहाँ दिखाया सबसे आम एचएसवी-1 संक्रमण का अध्ययन करने के लिए लागू तकनीकों का कुछ के लिए प्रतिनिधि परिणाम हैं - (चित्रा 1D) qPCR, qRT पीसीआर (चित्रा 1B), वेस्टर्न ब्लॉट (चित्रा 1F), पट्टिका परख (चित्रा 1C), और ऊतक immunofluorescence (चित्रा 1E).
चित्रा 1. Corneas की विश्लेषण HSV-1 पूर्व वी के साथ संक्रमितइवो. (ए) तीव्र corneal उपकला एचएसवी -1 संक्रमण के पूर्व vivo मॉडल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (बीएफ) इस वीडियो लेख में उल्लिखित विधि का उपयोग संक्रमित corneas का विश्लेषण. (बी) Explanted खरगोश corneas तनाव एचएसवी -1 KOS 1x10 4 pfu / कॉर्निया से संक्रमित थे और (PAA) phosphonoacetic एसिड (400 ग्राम / एमएल), एचएसवी प्रतिकृति की एक ज्ञात अवरोध करनेवाला की उपस्थिति या अनुपस्थिति (नकली) में सुसंस्कृत. कुल आरएनए संकेत समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था, और वायरल प्रतिलेखन qRT-पीसीआर के से एचएसवी -1 पोलीमरेज़ प्राइमरों के साथ मूल्यांकन किया गया था. 18S के खिलाफ प्राइमर्स rRNA एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया. n = 3. त्रुटि सलाखों ± SEM संकेत मिलता है (सी) संस्कृति मध्यम hpi 48 में एकत्र किया गया था, और संक्रामक कण उत्पादन CV 1-monolayers पर पट्टिका परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था. (डी) कुल डीएनए hpi 48 में एकत्र किया गया था, और वायरल जीनोम प्रतिकृति में मूल्यांकन किया गया था. एचएसवी -1 जीनोम के लिए प्राइमरों के साथ एक qPCR परख. पीआरGAPDH खिलाफ imers एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया. n = 3. त्रुटि सलाखों ± SEM संकेत मिलता है (ई) नकली इलाज corneas hpi 48, sectioned, फ्लैश जमे हुए और संक्रमित उपकला भीतर एक वायरल जल्दी प्रोटीन (ICP8) की उपस्थिति के लिए अप्रत्यक्ष immunofluorescence द्वारा विश्लेषण. नाभिक Höchst 33258 के साथ counterstained हैं (एफ) प्रोटीन lysates hpi 48 में एकत्र किए गए थे, और एक वायरल प्रोटीन (ICP0) की अभिव्यक्ति वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा मूल्यांकन किया गया था. बीसीए परख के लिए नमूने के बराबर लोड सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. hpi = पोस्ट संक्रमण घंटे.
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Discussion
इस वीडियो लेख में हम एक पूर्व vivo मॉडल में तीव्र corneal उपकला एचएसवी -1 संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन है. इस मॉडल को इन विट्रो में और vivo मॉडल में के बीच एक उपयोगी कदम पत्थर है, क्योंकि यह सेल संस्कृति परिणाम की physiologically सटीक मान्यता के लिए अनुमति देता है, जिससे पशु प्रयोग की राशि है कि प्रदर्शन किया जाना चाहिए की सीमा. इसके अलावा, पूर्व vivo मॉडल एक अद्वितीय और अमूल्य बरकरार मानव corneas में उपकला दाद संक्रमण का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है. नीचे दिये कुछ बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब इस मॉडल का उपयोग कर रहे हैं:
- यह महत्वपूर्ण है पर जोर देना है कि इस वीडियो लेख में उल्लिखित दृष्टिकोण दाद keratitis की एक मॉडल होने का मतलब नहीं है, लेकिन बल्कि तीव्र corneal उपकला एचएसवी -1 संक्रमण के एक मॉडल है. दाद keratitis संक्रमण, सूजन, और मेजबान im सहित कई confounding प्रक्रियाओं का एक परिणाम हैवायरस के लिए प्रतिक्रिया Mune. प्रतिजन विशेष CD4 + और CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया दाद keratitis, जो इस मॉडल में reproduced नहीं हो सकता के रोगजनन के एक महत्वपूर्ण घटक हैं क्योंकि explanted corneas प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ के अधीन नहीं हैं. इस कारण से, वे विशिष्ट उपकला वृक्ष के समान अल्सर नहीं विकसित करने और stromal प्रतिष्ठित दाद stromal 3 keratitis में मनाया भागीदारी की कमी है. इसलिए, रोग की गंभीरता और corneal अल्सर के fluorescein इमेजिंग के स्कोरिंग पूर्व vivo मॉडल में संभव नहीं है. इसके अलावा, दाद keratitis के ज्यादातर मामलों विलंबता से वायरल पुनर्सक्रियन की वजह से कर रहे हैं. चूंकि हमारे दृष्टिकोण exogenous वायरस के साथ explanted corneas के प्रत्यक्ष संक्रमण पर निर्भर करता है, यह तीव्र एचएसवी 1 corneal संक्रमण और रोग पुनर्सक्रियन नहीं मॉडल. इन कारणों के लिए, यहाँ प्रस्तुत मॉडल रोग के कुल विकृति को समझने के लिए उपयुक्त नहीं है, बल्कि शould corneal उपकला में वायरल प्रतिकृति और वायरस मेजबान बातचीत को कड़ाई से अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- इन विट्रो टिशू कल्चर प्रयोगों में से अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता के साथ पूर्व vivo दाद keratitis मॉडल पैदावार परिणाम. शायद यह है कि तथ्य यह है कि प्रत्येक कॉर्निया एक अलग खरगोश से एकत्र की है और थोड़ा अलग तरीके से संसाधित किया जा सकता है के कारण है. मानव corneas खरगोश corneas की तुलना में परिणामों की परिवर्तनशीलता एक भी अधिक दिखाने के लिए, क्योंकि वे चर उम्र, जाति, और स्वास्थ्य की स्थिति के दाताओं से उत्पन्न, और समय पोस्टमार्टम के विभिन्न मात्रा के लिए संरक्षित कर रहे हैं. हालांकि, उपयोग के साथ प्रयोगात्मक उपचार के प्रति कम से कम पांच corneas, हम सांख्यिकीय विश्वसनीय डेटा उत्पन्न करने में सक्षम थे.
- संवर्धन explanted corneas 4-5 के लिए पारंपरिक विधि अभी पर्याप्त संस्कृति के माध्यम का उपयोग करने के लिए कॉर्निया की किनारी कवर पता चलता है. हमने पाया है कि मध्यम करने के लिए पूरी तरह से उपकला कवर की राशि में वृद्धि और अधिक अनुरूप परिणाम पैदावार,संभावना व्यक्तिगत corneas उसमें निहित मध्यम और प्रायोगिक दवाओं के उपयोग के बीच अंतर को कम करने के लिए कारण.
- जब किसी भी आवेदन का उपयोग एंटीबॉडी खरगोश corneas का उपयोग करते हुए, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि मानव, माउस, चूहा, आदि specificities के साथ पारंपरिक एंटीबॉडी खरगोश प्रतिजनों के खिलाफ नहीं पार प्रतिक्रिया की संभावना हैं. इसके अलावा, इन आवेदनों में पाठ्यक्रम के माध्यमिक विरोधी खरगोश एंटीबॉडी नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है. इन कारणों के लिए, हम सेलुलर लक्ष्य के एंटीबॉडी धुंधला हो जाना शामिल प्रयोगों में मानव corneas का उपयोग करें.
- प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए उपकला कोशिकाओं का संग्रह, experimenter trypsin की झिल्ली बाध्य प्रोटीन पर प्रभाव के बारे में सतर्क होना चाहिए. इस प्रकार, सतह प्रोटीन का पता लगाने के लिए, यह collagenases या गैर trypsin proteases के रूप में कोशिकाओं, dislodging के अन्य साधनों का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.
- दाद keratitis के पशु मॉडल corneal प्रच्छान पर निर्भर साथ टीका करने के लिए पहलेवायरस. हम explanted corneas scarifying बिना संक्रमण के अनुरूप स्तर को प्राप्त करने में सक्षम हो गया है. यह सबसे अधिक संभावना फिल्म के आंसू और निमिष है कि तेजी से एक जीवित जानवर में corneal सतह से वायरस को खत्म करने के अभाव के कारण है.
इस वीडियो लेख में पूर्व vivo दाद keratitis मॉडल के संभावित संशोधन नहीं लगाया:
- Corneal उपकला कोशिकाओं के आनुवंशिक डीएनए वितरण सेल संस्कृति में और जीन अभिकर्मक, वायरल, वितरण और जीन 6 निशाना साध के रूप में चिकित्सा अनुसंधान, में उपयोग के तरीकों का उपयोग कर के द्वारा एचएसवी -1 संक्रमण के लिए पहले संशोधन.
- का प्रयोग GFP व्यक्त एचएसवी 1 7-8 या FITC संयुग्मित विरोधी एचएसवी एंटीबॉडी 9-10 नेत्रहीन संक्रमण की हद तक का आकलन.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
डेलावेयर घाटी के लायंस नेत्र बैंक के समर्थन के इस काम के लिए अमूल्य था. ICP8 के खिलाफ प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी डॉ. डेविड Knipe (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) से एक तरह का उपहार था. हम भी उपयोगी चर्चा और विशेषज्ञता के लिए डॉ. स्टीफन जेनिंग्स (मेडिसिन के Drexel विश्वविद्यालय कॉलेज) और डॉ. पीटर Laibson (विल्स नेत्र संस्थान) धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
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- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
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- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
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