Summary
I denne video artikel beskriver vi anvendelsen af en ny
Abstract
Herpes keratitis er en af de mest alvorlige patologier forbundet med herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis er i øjeblikket den hyppigste årsag til både hornhinde-afledt og infektion-associeret blindhed i den udviklede verden. Typisk præsentation af herpes keratitis omfatter infektion af det corneale epithel og undertiden dybere hornhindens stroma og endothel, hvilket fører til sådanne permanente hornhinden patologier som ardannelse, udtynding, og opacitet 1.
Corneal HSV-1-infektion er traditionelt undersøgt i to typer af eksperimentelle modeller. Den in vitro-model, hvor dyrkede monolag af hornhindeepithelceller inficeres i en petriskål, tilbyder enkelthed, højt formeringsevne hurtige forsøg og relativt lave omkostninger. På den anden side byder in vivo-model, hvor dyr, såsom kaniner eller mus inokuleres direkte i hornhinden, en meget avanceret fysiologisksystem, men har højere omkostninger, længere eksperimenter, nødvendig pasning af dyr samt en højere grad af variabilitet.
I denne video artiklen, giver vi et detaljeret demonstration af en ny ex vivo model for hornhinde-epitel HSV-1 infektion, der forener styrken i både in vitro og in vivo modeller. Den ex vivo model benytter intakte hornhinder organotypically opretholdt i kultur og inficeret med HSV-1. Anvendelsen af ex vivo model giver mulighed for stærkt fysiologisk baserede konklusioner, men det er temmelig billig og kræver tid engagement sammenlignes med den in vitro model.
Protocol
Alle reagenser og udstyr blev indkøbt sterile eller blev steriliseret forud for proceduren. Denne artikel beskriver de trin for oprettelsen af den ex vivo model begynder med en pre-kerneløs øje. I vores eksperimenter, anvender vi friske hele øjne fra unge (8-12 wks) albinokaniner (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Derudover anvender vi humane hornhinder opnået fra den lokale Eye Bank. Hvis du udfører enucleation selv, sørge for at undgå at beskadige hornhinden eller limbus under proceduren. Kanin enucleation protokoller kan findes andetsteds 2.
Del 1: Udskæring af Corneoscleral Button
- Fugt en smal strimmel gaze med PBS og pak det omkring øjeæblet for at lette at holde det under proceduren.
- Brug en skarp skalpel til at foretage en tangential snit i sclera, omkring 0,5 cm fra limbus.
- Brug skarp saks til at udvide snittet og helt udskære corneoscleral knap.
- Når corneoscleral knap er isoleret, drille væk iris, mens du holder sclerale fælg med en pincet. Undgå beskadigelse af endotelet eller udøve store påvirkninger på hornhinden.
Del 2: Indførelse af Cornea i organotypisk kultur
- Eksplanterede cornea dyrkes i minimalt essentielt medium (MEM) suppleret med ikke-essentielle aminosyrer (1X), L-glutamin (2 mM), penicillin (200 U / ml) og streptomycin (200 ug / ml). Et antisvampemiddel, såsom amphotericin, kan også tilsættes om nødvendigt.
- Der fremstilles en 1% agarose-opløsning i dyrkningsmedium og holde den parat ved 55 ° C.
- Skyl hornhinden i sterilt PBS indeholdende penicillin (200 U / ml) og streptomycin (200 ug / ml).
- Anbring hornhinden epithelial nedad i en brønd af en steril spot plade.
- Tilsæt agarose-holdige medium til endotel konkavitet af hornhinden lige nok til atfylde det helt. Tillad ~ 1 min til agarose at størkne.
- Anbring hornhinden med den understøttende gel scaffold epithelial opad i en 35 mm vævsdyrkningsskål og tilføje dyrkningsmedium til dækning epiteloverfladen.
- Hornhinden kan dyrkes på denne måde i over en uge, med mediumskift hver 48 timer.
Del 3: Infektion med HSV-1 og Behandling med eksperimentelle stoffer
- Der tilsættes 1 ml medium indeholdende den ønskede mængde af virus til et 35 mm vævsdyrkningsskål. Vi plejer at inficere med 1x10 4 PFU af stamme KOS HSV-1 pr hornhinden. Vores stock titere bestemmes ved at udføre plakanalyser på CV-1-monolag.
- Anbring hornhinden sammen med agarose scaffold epitel nedad i virusholdige medium.
- Anbring hornhinden ind i en vævskulturinkubator at inficere i 1 time med intermitterende rocking hver 10-15 min.
- Efter 1 time, opsug virus-contaidelsen medium og skyl 2-3 gange med PBS til fjernelse af eventuelt resterende viruspartikler.
- Placer hornhinden tilbage til sin tidligere stilling, og der tilsættes frisk dyrkningsmedium til dækning af epiteloverfladen.
- Eksperimentelle behandlinger kan påbegyndes før eller efter infektion, afhængigt af arten af forsøget.
- Dyrkningsmedium udskiftet hver 48 timer.
Del 4: Prøvetagning
- Medium for plaque-assay-analyse. Bland medium godt og brug det straks til en plaqueanalyse eller opbevares ved -80 ° C til senere brug, hvis indsamling af prøver på forskellige tidspunkter.
- DNA, RNA, protein eller celler fra corneaepithel
- Fjern agarose stillads og skyl cornea godt med PBS.
- Udskære ring af sclerale væv fra hornhinden for at sikre, at kun hornhinde-epitel materiale opsamles.
- Usynge en skalpel, skrabe de hornhindeepithelceller i den passende puffer, afhængigt af den type materiale, der skal isoleres. Til isolering af DNA og RNA, anvender vi den DNeasy Blood & Tissue Kit og RNeasy Mini Kit, henholdsvis (QIAGEN, Hilden, Tyskland). Til opsamling af proteinlysater, bruger vi Laemmli buffer. Til flowcytometrianalyse af hornhindeepithelceller, vi pre-inkuberes hornhinderne i en lille mængde trypsin for at løsne cellerne, og derefter løsne dem i trypsin med en skalpel. Siden skrabe hornhindeepitelet ikke giver lige mængder af væv, er det vigtigt at medtage passende kontrol ved analysen af prøverne. Vi bruger 18S rRNA som reference udskrift i qRT-PCR'er, GAPDH som reference gen i qPCRs, og nucleolin som en loading kontrol for Western blots.
- Vævsprøver til immunhistokemi eller immunofluorescens
- Fjern agarose stillads og skyl majsea godt med PBS.
- Afhængigt af eksperimentelle mål, hornhinden bruge for at foretage en paraffin vævsblok eller frosne vævsblok, som vist i videoen. Vi følger standardprocedurer, når de udarbejder hornhindevæv sektioner.
Repræsentative resultater
De fleste af de metoder til rådighed til undersøgelse af celler i vævskultur kan let tilpasses til anvendelse i hornhinder inficeret med HSV-1 ex vivo. Her vises repræsentative resultater for nogle af de mest almindelige metoder for at studere HSV-1 infektion - qPCR (figur 1D), qRT-PCR (figur 1 B), Western blot (fig. 1F), plaque-assay (figur 1C), og væv immunfluorescens (fig. 1E).
Figur 1. Analyse af hornhinder inficeret med HSV-1 ex vIvo. (A) Skematisk fremstilling af ex vivo model af akut hornhindeepitel HSV-1 infektion. (BF) Analyse af hornhinder inficeret anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i videoen artikel. Eksplanterede kanin hornhinder blev inficeret med 1x10 4 PFU / hornhinden af stamme KOS HSV-1 og dyrket i nærvær (PAA) eller fravær (Mock) af phosphoneddikesyre (400 ug / ml), en kendt inhibitor af HSV-replikation. (B) Totalt RNA blev opsamlet ved de angivne tidspunkter, og viral transkription blev bedømt ved qRT-PCR med primere for HSV-1-polymerase. Primere mod 18S rRNA blev anvendt som reference. n = 3. Fejlbjælker angiver ± SEM. (C) Dyrkningsmedium blev opsamlet ved 48 HPI, og infektiøs partikel produktionen blev vurderet ved plakassay på CV-1-monolag. (D) Total DNA blev opsamlet ved 48 HPI, og virusgenomet replikation blev vurderet i en qPCR assay med primere for HSV-1-genomet. Primers mod GAPDH blev anvendt som reference. n = 3. Fejlbjælker angiver ± SEM. (E) Mock-behandlede hornhinder blev flash-frosset ved 48 HPI, snittet og analyseret ved indirekte immunofluorescens for tilstedeværelsen af et viralt tidlige protein (ICP8) i den inficerede epitel. Kerner modfarvet med Höchst 33258. (F) proteinlysater blev opsamlet ved 48 HPI, og ekspression af et viralt protein (ICP0) blev vurderet ved Western blot. BCA assay blev anvendt til at sikre ligelig belastning af prøverne. HPI = timer efter infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video artikel beskriver vi en fremgangsmåde til undersøgelse af akut hornhindeepitel HSV-1 infektion i en ex vivo model. Denne model er en nyttig skridt på vejen mellem in vitro og in vivo modeller, fordi det giver mulighed for fysiologisk nøjagtig validering af cellekultur resultater og derved begrænser mængden af dyreforsøg, der skal udføres. Desuden giver den ex vivo model en unik og uvurderlig mulighed for at studere epitel herpes infektion hos intakte humane hornhinder. Nedenfor redegøres for nogle overvejelser, der skal tages i betragtning, når du bruger denne model:
- Det er vigtigt at understrege, at den tilgang, der er skitseret i denne video artikel ikke er ment som en model af herpes keratitis, men er snarere en model for akut hornhindeepitel HSV-1 infektion. Herpes keratitis er et resultat af flere forstyrrende processer, herunder infektion, inflammation, og værten imimmunrespons mod virus. Antigenspecifikke CD4 + og CD8 + T celle responser er en væsentlig komponent i patogenesen af herpes keratitis, der ikke kan reproduceres i denne model, eftersom eksplanterede cornea ikke er underlagt infiltration af celler fra immunsystemet. Derfor udvikler de ikke de typiske epitel dendritiske sår og mangler det stromale engagement klassisk observeret i herpes stromal keratitis 3. Derfor scoring af sygdommens sværhedsgrad og fluorescein billeddannelse af hornhindesår er ikke mulig inden for ex vivo model. Desuden er de fleste tilfælde af herpes keratitis forårsaget af viral reaktivering fra latens. Da vores tilgang er baseret på direkte infektion af eksplanterede hornhinder med eksogent virus, det modellerer akut HSV-1 hornhinde infektion og ikke reaktivering sygdom. Af disse grunde er den model præsenteres her ikke egnet til forståelsen af de overordnede patologi af sygdommen, men snarere should anvendes til undersøgelse af viral replikation og virus-vært-vekselvirkninger strengt i hornhindeepitelet.
- De ex vivo herpes keratitis-model giver resultater med større udsving end in vitro-vævskultur-eksperimenter. Dette skyldes sandsynligvis den kendsgerning, at hver hornhinde er indsamlet fra en anden kanin og kan behandles smule anderledes. Menneskelige hornhinder viser en endnu større variation af resultater end kanin hornhinder, fordi de stammer fra donorer af variable alder, race og sundhedstilstand, og bevares for forskellige mængder af tid postmortem. Med anvendelsen mindst fem hornhinder per eksperimentel behandling, var vi i stand til at generere statistisk pålidelige data.
- Den traditionelle fremgangsmåde til dyrkning af eksplanterede cornea 4-5 foreslår anvendelse af lige nok dyrkningsmedium til at dække limbus af hornhinden. Vi fandt, at forøgelse af mængden af medium til fuldstændigt at dække epitel giver mere konsekvente resultater,sandsynligvis på grund af at minimere forskellene mellem de enkelte hornhinder adgang til de mellemstore og eksperimenterende medicin indeholdt deri.
- Når der anvendes kanin corneae til enhver applikation under anvendelse af antistoffer, er det vigtigt at huske på, at traditionelle antistoffer med specificiteter for mennesker, mus, rotte, etc. sandsynligvis ikke krydsreagere mod kanin-antigener. Desuden kan sekundære anti-kanin-antistoffer naturligvis ikke anvendes i disse applikationer. Af disse grunde bruger vi humane hornhinder i forsøg, der involverede antistof farvning af cellulære mål.
- Når der indsamles epitelceller for flowcytometrianalyse skal forsøgslederen være forsigtig om virkningerne af trypsin på membran-bundne proteiner. Således, til påvisning af overfladeproteiner, kan det være fordelagtigt at anvende andre midler til løsner de celler, såsom collagenaser eller ikke-trypsin proteaser.
- Dyremodeller af herpes keratitis er afhængige af hornhinden skarifikation inden inokulering medvirus. Vi har været i stand til at opnå ensartede niveauer for infektion uden oprivning de eksplanterede hornhinder. Dette er mest sandsynligt på grund af fraværet af tårefilmen og blinke som hurtigt fjerne virus fra hornhindeoverfladen i et levende dyr.
Potentielle ændringer af ex vivo herpes keratitis model ikke undersøgt i denne video artikel:
- Genetisk modifikation af hornhindeepithelceller forud for HSV-1-infektion ved anvendelse af DNA leveringsmetoder anvendes i cellekultur og i genterapi forskning, såsom transfektion, virale levering og gen Gunning 6.
- Anvendelse af GFP-udtrykkende HSV-1 7-8 eller FITC-konjugerede anti-HSV-antistoffer 9-10 til visuelt at vurdere omfanget af infektionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den støtte fra Lions Eye Bank of Delaware Valley var uvurderlig for dette arbejde. Primært muse-monoklonalt antistof mod ICP8 var en venlig gave fra Dr. David Knipe (Harvard Medical School). Vi takker også Dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) og Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) for personer diskussioner og ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A.
- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
