Summary
Neste artigo de vídeo que descreve o uso de um novo
Abstract
Ceratite herpética é uma das mais graves patologias associadas com o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Ceratite herpética é actualmente a principal causa de cegueira córnea tanto derivados e infecção associada no mundo desenvolvido. Apresentação típica de ceratite herpética inclui infecção do epitélio da córnea e, por vezes, o estroma eo endotélio da córnea profunda, conduzindo a tais patologias corneanas permanentes como cicatrizes, desbaste, e opacidade 1.
Corneal infecção HSV-1 é tradicionalmente estudada em dois tipos de modelos experimentais. O modelo in vitro, em que as monocamadas de culturas de células epiteliais da córnea são infectadas numa placa de Petri, oferece nível simplicidade, elevado de reprodutibilidade, experiências rápidas, e custos relativamente baixos. Por outro lado, o modelo in vivo, em que os animais, tais como coelhos ou ratos são inoculados directamente na córnea, oferece uma fisiológica altamente sofisticadosistema, mas tem custos mais elevados, experimentos mais longos, cuidado de animais necessário, e um maior grau de variabilidade.
Neste artigo de vídeo, que proporcionam uma demonstração detalhada de um novo modelo ex vivo de corneal epitelial infecção HSV-1, que combina as vantagens de ambos os vitro e em modelos in vivo o. O modelo ex vivo utiliza córneas intactas organotypically mantidas em cultura e infectadas com HSV-1. A utilização do modelo ex vivo permite conclusões altamente fisiologicamente baseados, no entanto, é bastante barato e requer compromisso de tempo comparável à do modelo in vitro.
Protocol
Todos os reagentes e equipamentos foram comprados estéreis ou foram esterilizadas antes do procedimento. Este artigo descreve as etapas de implementação do modelo ex vivo começando com um olho pré-enucleado. Em nossos experimentos, utilizamos frescos olhos inteiros de jovens (8-12 semanas) coelhos albinos (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Além disso, usamos córneas humanas obtidos a partir do banco de olhos local. Se realizar a enucleação si mesmo, tome cuidado para não danificar a córnea ou o limbo durante o procedimento. Protocolos enucleação de coelho pode ser encontrada em outras duas.
Parte 1: Excisão do botão córneo
- Molhe uma estreita faixa de gaze com PBS e envolvê-la em torno do globo ocular para facilitar a segurá-lo durante o procedimento.
- Usar um bisturi afiado para fazer uma incisão na esclera tangencial, cerca de 0,5 cm de distância a partir do limbo.
- Use uma tesoura afiada para estender a incisão e completamente especial sobre o consumo do corneoscleral botão.
- Uma vez que o botão córneo é isolado, longe provocar a íris, segurando a borda escleral com uma pinça. Evitar danificar o endotélio ou exercer pressão excessiva sobre a córnea.
Parte 2: Introdução de Córnea em Cultura organotípicas
- Córneas explantadas são cultivadas em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com não-aminoácidos essenciais (1X), L-glutamina (2 mM), penicilina (200 U / ml) e estreptomicina (200 ug / ml). Um agente antifúngico, tal como anfotericina, podem também ser adicionados, se necessário.
- Prepara-se uma solução de 1% de agarose num meio de cultura e mantê-lo pronto a 55 ° C.
- Enxaguar bem a córnea em PBS estéril contendo penicilina (200 U / ml) e estreptomicina (200 ug / ml).
- Coloque o lado epitelial da córnea para baixo dentro de um poço de uma placa de mancha estéril.
- Adicionar o meio de agarose contendo a concavidade endoteliais da córnea apenas o suficiente paraenchê-lo completamente. Permitir min ~ 1 para a agarose solidificar.
- Coloque a córnea, com o meio de cultura de apoio lateral gel andaime epitelial para cima para um prato de cultura de tecido de 35 milímetros e adiciona-se a cobrir a superfície epitelial.
- A córnea pode ser cultivado neste meio durante mais de uma semana, com mudanças de meio a cada 48 h.
Parte 3: A infecção com HSV-1 e de tratamento com medicamentos experimentais
- Adicionar 1 ml de meio contendo a quantidade desejada de vírus em um prato de cultura de tecido 35 milímetros. Nós normalmente infectam com 1x10 PFU 4 de estirpe KOS HSV-1 por córnea. Os títulos de nossas ações são determinadas através da realização de ensaios de placa no CV-1 monocamadas.
- Coloque a córnea em conjunto com o lado do andaime agarose epitelial para baixo para o meio contendo vírus.
- Coloque a córnea num incubador de cultura de tecido para infectar durante 1 hora com agitação intermitente a cada 10-15 minutos.
- Depois de 1 hora, aspirar o vírus contai-ning meio e lavar 2-3 vezes com PBS para remover quaisquer partículas residuais virais.
- Coloque a córnea de volta para a sua posição anterior e adicionar o meio de cultura fresco para cobrir a superfície epitelial.
- Os tratamentos experimentais pode ser iniciada antes ou após a infecção, dependendo da natureza do ensaio.
- Meio de cultura é trocado a cada 48 horas.
Parte 4: Coleta de Amostra
- Meio de ensaio em placas de análise. Misturar bem o meio e utilizá-la imediatamente para um ensaio de placa ou armazenar a -80 ° C para uso posterior, se a recolha de amostras em diferentes pontos temporais.
- DNA, RNA, proteínas ou células de epitélio da córnea
- Remover o andaime de agarose e enxaguar a córnea bem com PBS.
- O anel de tecido escleral Excise da córnea para garantir que o material só epitelial da córnea é recolhida.
- Ucantar um bisturi, raspar as células epiteliais da córnea no tampão apropriado, dependendo do tipo de material a ser isolado. Para o isolamento de DNA e RNA, usamos o Kit Blood & Tissue Dneasy e o Kit Mini RNeasy, respectivamente (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Para a coleta de lisados de proteínas, usamos tampão Laemmli. Para a análise de citometria de fluxo de células epiteliais da córnea, é pré-incubar as córneas em uma pequena quantidade de tripsina para desprender as células, e, em seguida, desalojar-los para a tripsina com um bisturi. Uma vez que a raspagem do epitélio da córnea não produz a mesma quantidade de tecido, é importante incluir controlos adequados ao analisar as amostras. Usamos rRNA 18S como um transcrito de referência em qRT-PCR, GAPDH como gene de referência em qPCRs e nucleolin como um controlo de carga para transferência de Western.
- Amostras de tecido para imuno-histoquímica ou imunofluorescência
- Retire o andaime de agarose e lavar o milhoEa bem com PBS.
- Dependendo do seu objectivo experimental, utilize a córnea para fazer um bloco de tecido ou de um bloco de parafina do tecido congelado, como mostrado no vídeo. Nós seguimos os procedimentos padrão quando se prepara cortes de tecido da córnea.
Resultados representativos
A maior parte dos métodos disponíveis para o estudo de células em cultura de tecidos pode ser facilmente adaptado para o uso em córneas infectadas com HSV-1 in vivo ex. Mostrado aqui são resultados representativos para algumas das técnicas mais comuns aplicáveis ao estudo da infecção por HSV-1 - qPCR (Figura 1D), qRT-PCR (Figura 1B), Western blot (Figura 1F), ensaio de placa (Figura 1C), e tecido de imunofluorescência (Figura 1E).
Figura 1. Análise de córneas infectadas com HSV-1 ex vivo. (A) Representação esquemática do modelo ex vivo de aguda epitelial corneal HSV-1 infecção. (BF) Análise de córneas infectadas utilizando o método descrito neste artigo de vídeo. Córneas explantadas de coelho foram infectados com 1x10 4 PFU / córnea da estirpe KOS de HSV-1 e cultivadas na presença (PAA) ou ausência (Mock) de ácido fosfonoacético (400 ug / ml), um conhecido inibidor da replicação do HSV. (B) O ARN total foi colhido nos pontos de tempo indicados, e a transcrição viral foi avaliada por qRT-PCR com os iniciadores para o HSV-1 de polimerase. Primers contra rRNA 18S foram usados como referência. n = 3. As barras de erro indicam ± SEM. (C) O meio de cultura foi recolhido a 48 hpi e a produção de partículas infecciosas foi avaliada por ensaio de placas em monocamadas de CV-1 (D). O ADN total foi recolhido a 48 hpi e a replicação do genoma viral foi avaliada em um ensaio qPCR com iniciadores para o HSV-1 do genoma. PrIMers contra GAPDH foram utilizados como referência. n = 3. As barras de erro indicam ± SEM. (E) Mock tratados com córneas foram rapidamente congeladas a-48 hpi, seccionados e analisados por imunofluorescência indirecta para detectar a presença de uma proteína viral precoce (ICP8) dentro do epitélio infectado. Os núcleos são contrastadas com Höchst 33258. (F) Os lisados de proteína foram recolhidas às 48 hpi e a expressão de uma proteína viral (ICP0) foi avaliada por Western blot. BCA ensaio foi utilizado para assegurar carga igual das amostras. IPH = horas após a infecção.
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Discussion
Neste artigo de vídeo foi descrito um método para o estudo agudo epitelial da córnea infecção por HSV-1 em um modelo ex vivo. Este modelo é um degrau entre a utilidade in vitro e a modelos in vivo, uma vez que permite a validação fisiologicamente precisa dos resultados de cultura de células e, deste modo, limita a quantidade de experimentação animal, que deve ser realizada. Além disso, o modelo ex vivo proporciona uma oportunidade única e valiosa para estudar a infecção herpes epitelial em córneas humanas intactas. Descrito a seguir algumas considerações que devem ser levadas em conta quando se utiliza este modelo:
- É importante ressaltar que a abordagem descrita neste artigo de vídeo não é para ser um modelo de ceratite herpética, mas é antes um modelo de aguda epitelial HSV-1 da córnea infecção. Ceratite herpética é o resultado de vários processos de confusão, incluindo a infecção, inflamação e o hospedeiro imMUNE resposta ao vírus. Antigen-specific CD4 + e CD8 + respostas de células T é um componente importante da patogénese da herpes ceratite, que não podem ser reproduzidos neste modelo, devido córneas explantadas não estão sujeitos a infiltração por células do sistema imunitário. Por esta razão, eles não desenvolvem as úlceras típicas epiteliais dendríticas e não possuem o envolvimento do estroma classicamente observado em herpes ceratite estromal 3. Assim, marcando a severidade da doença e de imagem de fluoresceína de úlceras da córnea não é possível no modelo ex vivo. Além disso, a maioria dos casos de queratite herpes são causadas pela reactivação da latência viral. Desde a nossa abordagem baseia-se em infecção direta de córneas explantados com vírus exógeno, modela aguda HSV-1 infecção da córnea e não a doença reativação. Por estas razões, o modelo aqui apresentado não é apropriada para a compreensão da patologia global da doença, mas sim should ser utilizado para estudar a replicação viral e interacções vírus-hospedeiro estritamente no epitélio da córnea.
- Os herpes ex vivo ceratite modelo produz resultados com maior variabilidade do que o em experimentos de cultura in vitro de tecidos. Isto é provavelmente devido ao facto de que cada córnea é recolhida a partir de um coelho diferente e pode ser processada de forma ligeiramente diferente. Córneas humanas mostram uma variabilidade ainda maior de resultados do que as córneas de coelho, porque eles se originam de doadores de idade variável, raça e estado de saúde, e são preservados para diferentes quantidades de postmortem tempo. No entanto, com o uso de pelo menos cinco córneas por tratamento experimental, que foram capazes de gerar dados estatisticamente fiáveis.
- O método tradicional de cultivo explantado córneas 4-5 sugere o uso de meio de cultura apenas o suficiente para cobrir o limbo da córnea. Nós descobrimos que o aumento da quantidade de meio para cobrir completamente o epitélio produz resultados mais consistentes,provavelmente devido a minimizar as diferenças entre as córneas individuais acesso às drogas médio e experimental neles contidos.
- Quando se utiliza córneas de coelhos para qualquer aplicação que utiliza anticorpos, é importante ter em mente que os anticorpos tradicionais, com especificidades para o ser humano, ratinho, rato, etc não são susceptíveis de reagir de forma cruzada contra os antigénios de coelho. Além disso, secundárias de anticorpos anti-coelho de curso não podem ser usados nestas aplicações. Por estas razões, usamos córneas humanas em experiências envolvendo coloração de anticorpos de alvos celulares.
- Ao recolher as células epiteliais para a análise de citometria de fluxo, o experimentador deve ser cauteloso sobre os efeitos da tripsina sobre proteínas ligadas à membrana. Assim, para a detecção de proteínas de superfície, pode ser benéfico usar outros meios de desalojar as células, tais como colagenases ou não-tripsina proteases.
- Os modelos animais de ceratite herpética dependem escarificação córnea antes da inoculação como vírus. Temos sido capazes de alcançar níveis consistentes de infecção sem escarificar as córneas explantados. Isto é provavelmente devido à ausência do filme lacrimal e piscar rapidamente que eliminar o vírus a partir da superfície da córnea em um animal vivo.
Potenciais alterações da ex-modelo ceratite vivo herpes não explorado neste artigo vídeo:
- A modificação genética das células epiteliais da córnea antes da infecção por HSV-1, utilizando métodos de ADN de entrega utilizados na cultura de células e em pesquisa de terapia génica, tais como a transfecção, a entrega viral, e gunning gene 6.
- Utilização de GFP-expressando HSV-1 7-8 ou FITC-conjugado anti-HSV anticorpos 9-10 para avaliar visualmente o grau de infecção.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O apoio do Banco de Olhos do Lions de Delaware Valley foi inestimável para este trabalho. Anticorpo monoclonal contra o principal do mouse ICP8 foi um presente tipo de Dr. David Knipe (Harvard Medical School). Agradecemos também o Dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) e Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) para discussões úteis e conhecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
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