Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.
-Tronco como células foram isoladas em tumores como mama, pulmão, cólon, próstata e cérebro. Uma questão crítica em todos estes tumores, especialmente em mutliforme glioblastoma (GBM), é identificar e isolar a população de células tumorais iniciar (s) para investigar o seu papel na formação de tumores, progressão e recorrência. Tumor compreensão iniciar populações de células irá fornecer pistas para encontrar abordagens terapêuticas eficazes para estes tumores. O ensaio neurosphere (NSA), devido à sua simplicidade e reprodutibilidade tem sido utilizado como o método de escolha para isolamento e propagação de muitas das células tumorais isso. Este protocolo demonstra o método de cultura neurosphere para isolar e expandir-tronco como células no tecido humano ressecado cirurgicamente GBM tumor. Os procedimentos incluem uma digestão química inicial e dissociação mecânica do tecido tumoral e, posteriormente, chapeamento da suspensão de células resultantes único da cultura NSA. Após 70-10 dias, neurospheres primária de 150-200 m de diâmetro podem ser observadas e estão prontos para mais passaging e expansão.
Para isolar-tronco neurais e células progenitoras de adultos normais e cérebros fetal 1, 2, 3, 4 e também tumor-tronco como células dos tecidos do câncer, como pulmão 5, 6 de próstata, mama e cérebro 7 8, 9, o ensaio foi neurosphere freqüentemente usado como o método de escolha. Com este ensaio simples e reprodutível, pode-se gerar um número indefinido de células do tecido do tumor ressecado que mostram características similares como células-tronco somáticas; multipotency ex vivo, a capacidade de criar novos tumores após o implante, e auto-renovação. Essas células poderiam ser usadas para estudar a biologia celular básica, incluindo câncer de célula a célula-interações, e, a diferenciação de migração, invasão e morte celular. Além disso, isolado tumor-tronco como células fornecem uma ferramenta valiosa para estudar como os tumores de forma, o progresso ea recaída e também para desvendar os mecanismos celulares subjacentes decorrentes que, eventualmente, poderiam fornecer insights para terapêuticaopções.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações do Centro de Pesquisa Florida tumor cerebral; Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia tumor cerebral.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.