Summary
هذا البروتوكول فيديو يدل على العزلة والتوسع في مثل الخلايا الجذعية من مقطوعة جراحيا mutliforme ورم أرومي دبقي الإنسان (GBM) نسيج الورم باستخدام مقايسة الثقافة neurosphere الأسلوب.
Abstract
وتم عزل الخلايا الجذعية مثل الأورام في مثل الثدي الرئة والبروستات والقولون والمخ. وثمة مسألة حاسمة في جميع هذه الأورام ، لا سيما في mutliforme ورم أرومي دبقي (GBM) ، هو تحديد وعزل الخلايا السرطانية السكان بدء (ق) للتحقيق في دورها في تشكيل الورم ، والتقدم ، وتكرار. والشروع في فهم ورم الخلية السكان توفر أدلة لإيجاد مناهج علاجية فعالة لهذه الاورام. وقد استخدمت مقايسة neurosphere (NSA) وذلك بسبب بساطته واستنساخ وطريقة اختيار العزلة ونشر العديد من هذه الخلايا السرطانية. هذا البروتوكول يوضح الأسلوب الثقافة neurosphere لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية في مثل مقطوعة جراحيا الإنسان GBM نسيج الورم. الإجراءات تشمل الهضم الكيميائية الأولية والتفكك الميكانيكية للأنسجة الورم ، وبعد ذلك الطلاء الناتج تعليق خلية واحدة في الثقافة وكالة الامن القومي. بعد 7-10 أيام ، neurospheres الأساسي 150-2ويمكن ملاحظة 00 ميكرومتر في القطر ونحن على استعداد لمواصلة الركض والتوسع.
Protocol
1. مجموعة من الأنسجة الابتدائية الخليج للحاسبات الآلية
- يتم الحصول على ورم أرومي دبقي mutliforme (GBM) ورم من مريض بمرض السرطان وخضوعه لعملية جراحية.
- يجب اتخاذ ترتيبات مع فريق جراحة المخ والأعصاب. سوف الاعصاب مكان الورم GBM مقطوعة في أنبوب حجم المناسبة التي تحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) القاعدية المتوسطة تستكمل مع المضادات الحيوية 10-15 ٪ (Peniciline / Streptomycine). يجب أن تقدم إلى الغرفة الباردة المتوسطة العاملة بواسطة المختبر. مخزنة بدلا من ذلك ، الباردة HEPES - مخزنة المتوسطة الأساسية الدنيا (HEM) ، أو الفوسفات ويمكن أيضا المالحة (PBS) مع نسبة عالية من المضادات الحيوية يمكن استخدامها لهذا الغرض.
- يتم تسليم نسيج الورم مقطوعة إلى المختبر على الجليد ووضعها تحت غطاء محرك السيارة.
2. تفارق من الورم الرئيسي في تعليق وحيد الخلية
- تتم إزالة الزائد من المتوسط الأصلي / برنامج تلفزيوني من أنبوب الصقر وتغسل العينة 2-3 مرات مع 10M - 5لتر من PBS / NSC المتوسطة القاعدية لإزالة الدم والحطام. تتم إزالة PBS / متوسطة ويوضع نسيج الورم الخليج للحاسبات الآلية في طبق بتري.
- يتم قطع الأنسجة الى قطع صغيرة ومفروم بشفرة مشرط رقم 10 الى قطع صغيرة لزيادة مساحة السطح لعملية trypsinization. ويمكن اتخاذ تنميق 1-3 دقائق اعتمادا على حجم الورم.
- هو trypsinized النسيج المفروم في 5ml - 3 من قبل تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لمدة 10-15 دقيقة في حمام ماء C ° 37. يتم استخدام ماصة الالكترونية لنقل قطع صغيرة وورم التربسين في أنبوب فالكون 15ml.
- إضافة حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا لمنع رد الفعل الأنزيمية التربسين بعد فترة الحضانة.
- ويكفل التربسين تعطيل بواسطة pipetting تعليق صعودا وهبوطا عدة مرات. ثم ، وتعليق ومكعبات بنسبة الطرد المركزي في 800rpm (110g) ل5min.
- يتم تجاهل طاف ومعلق في قطعة نسيج من 1ml العقيمة NSC باسال المتوسط. كتل يتم فصلها بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا (3-7 مرات) حتى يتم التوصل إلى سلسة حليبي تعليق خلية واحدة. عدد من الخطوات pipetting يعتمد بشكل مباشر على حجم الجزيئات في الأنسجة المفروم. وينبغي تجنب التفكك الميكانيكية طويلة وقوية لأنها قد تؤدي إلى موت الخلايا والحد من تشكيل المجال.
- لإزالة برنامج الأمم المتحدة للفصل القطع والحطام ، يضاف 10-15 مل من المتوسط القاعدية إلى أنبوب ، ويتم تصفية خلية تعليق من خلال مصفاة ميكرون 40 خلية في أنبوب 50ml.
- يتم طرد تعليق تصفيتها في 800rpm (110g) ل5min. يتم تجاهل طاف بعد ذلك.
- ثم يتم معلق الخلايا Pelletted 2ml - 1 في المتوسط كاملة لمجلس الأمن القومي العد الخلية.
3. عدد الخلايا والتصفيحات
- يضاف 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى 90 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان 0.04 ٪ في أنبوب إيبندورف 1ml.
ملاحظة : مناسبة أخرى dilu الخليةويمكن أيضا أن تستخدم ستعقد. - ماصة صعودا وهبوطا لخلط التعليق. يتم نقل 10 ميكروليتر من الخلايا / التريبان الزرقاء لمزيج عدادة الكريات كي يحسب كثافة الخلية.
- ومطلي الخلايا في مجلس الأمن القومي الشامل المتوسطة (خليط من المتوسطة ومجلس الأمن القومي NSC القاعدية استكمال الانتشار في نسبة 9:1) تستكمل مع EGF 20ng/ml ، bFGF 10ng/ml و1μl/ml الهيبارين 0.2 ٪ (2μg/ml) في المناسبة السفن الأنسجة الثقافة. يستخدم 5 و 20 و 40 مل من المتوسط لقوارير T25 ، T80 وT175 على التوالي. ويمكن إضافة المضادات الحيوية إلى متوسطة في تركيز 1:100 فرصة لتقليل التلوث.
- وضعت القارورة في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
4. الركض وتوسيع مجالات GBM المشتقة :
- عندما neurospheres التوصل الى متوسط حجم 150-200 ميكرون في القطر ، ومستعد لثقافة فرعية. إزالة محتوى كل قارورة وضعت في tiss الحجم المناسب العقيمةرق أنبوب الثقافة ، وطرد في الدقيقة 800 (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تتم إزالة وطاف بيليه معلق في 1 مل من 0.05 ٪ التربسين - EDTA.
- لتحقيق trypsinization الأمثل ، هو المحتضنة تعليق خلية عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 2-3 دقيقة. لوقف النشاط التربسين يتم إضافة حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا إلى تعليق الخلية وpipetted بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا.
- يتم طرد تعليق الخلية في 800 دورة في الدقيقة (110g) لمدة 5 دقائق. ثم يتم إزالة طاف ومعلق الخلايا في 1 مل من المتوسط مجلس الأمن القومي.
- يتم تنفيذ عدد الخلايا كما هو موضح سابقا.
- ومطلي الخلايا في تركيز خلايا 5x10 4 / مل في المتوسط NSC كاملة تستكمل مع عوامل النمو ومطلي المناسبة في حجم السفن زراعة الأنسجة كما هو موضح في الجزء السابق.
- تتشكل neurospheres الثانوية في 7-10 أيام عندما حضنت عند 37 درجة مئوية في الرطبةified الحاضنة مع 5 ٪ CO 2.
5. ممثل النتائج :
بعد طلاء الخلايا واحدة تحصد من نسيج الورم الخليج للحاسبات الآلية ، ورم الخلايا الجذعية مثل تتكاثر وتوليد مجموعات صغيرة من الخلايا تتكون من خلايا قليلة في أيام 3-4 (انظر الفيديو والشكل 1). وتنمو هذه المجموعات ، وهي الحصول على شكل أكثر كروية حتى قبل 7-8 أيام ، مجالات المرحلة المناسبة مشرق مع متوسط قطرها ميكرون شكل 150-200 (انظر الفيديو والشكل 2). في أعلى التكبير ، مجالات صحية تثبت عادة في محيط microspikes بهم. وجود تجمعات كبيرة مثل المجال في الأيام 1-2 بعد بدء الثقافة يرجع إلى وجود كتل غير فصلها في نهم من الثقافة ، وينبغي ألا يكون مخطئا في المجالات الحقيقية. كمية الحطام في مجال الثقافة الأولية الورم تختلف تبعا للمصدر الأولي من الأنسجة وعما إذا كانت أو لم تكن تتضمن أي أنسجة المخ المحيطة بها. تقنيات النسيج السليم إعدادبما يمكن أن تفارق الأنزيمية والميكانيكية ، والترشيح لاحقة من العينة مع كمية كافية من المتوسط نتيجة في أقل الحطام في الثقافة.
الشكل 1. الأولية ثقافة المجال GBM 4 أيام بعد الطلاء. ورم الخلايا الجذعية مثل تتكاثر وتوليد مجموعات صغيرة من الخلايا في 3-4 أيام. التكبير الأصلي ؛ 20X.
الشكل 2. الممر مجال ثقافة واحدة بعد 8 أيام GBM الطلاء. التكبير الأصلي ؛ 20X.
Discussion
لعزل الخلايا الجذعية العصبية والسلف من الكبار والعقول العادية الجنين 1 ، 2 ، 3 ، 4 وكذلك ورم الخلايا الجذعية من الأنسجة مثل سرطان الرئة مثل 5 ، 6 البروستات والثدي والمخ 7 8 و 9 للمقايسة neurosphere كانت ، كثيرا ما تستخدم كوسيلة للاختيار. باستخدام هذا الاختبار البسيط واستنساخه ، يمكن للمرء أن إنشاء عدد غير محدد من الخلايا من أنسجة الورم التي تظهر مقطوعة خصائص مشابهة لالخلايا الجذعية الجسدية ؛ السابقين multipotency فيفو ، والقدرة على خلق أورام جديدة على الزرع ، وتجديد الذات. ويمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة بيولوجيا الخلايا السرطانية الأساسية بما في ذلك الخلية الى خلية التفاعلات ، والتمايز ، والهجرة الغزو ، وموت الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، معزولة ورم الخلايا الجذعية مثل توفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة كيفية تشكيل الأورام والتقدم والانتكاس ، وكذلك لكشف الآليات الكامنة الخلوية الناشئة التي يمكن في نهاية المطاف إلى تقديم رؤى علاجيةالخيارات.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من مركز فلوريدا للبحوث استئصال ورم من الدماغ ؛ بريستون ألف ويلز الابن مركز لعلاج ورم في المخ.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
- Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
