El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Summary

Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.

Abstract

Como las células madre han sido aislados en los tumores, como mama, pulmón, colon, próstata y cerebro. Una cuestión fundamental en todos estos tumores, especialmente en mutliforme glioblastoma (GBM), es el de identificar y aislar células tumorales de la población de iniciar (s) para investigar su papel en la formación del tumor, la progresión y la recurrencia. Tumor comprensión de iniciar las poblaciones de células proporcionará pistas para encontrar enfoques terapéuticos efectivos para estos tumores. El ensayo neuroesfera (NSA), debido a su sencillez y reproducibilidad ha sido utilizado como el método de elección para el aislamiento y la propagación de muchas de estas células tumorales. Este protocolo demuestra el método de cultivo neuroesfera para aislar y expandir madre-como las células en el tejido resecado quirúrgicamente de tumores humanos GBM. Los procedimientos incluyen una digestión química inicial y disociación mecánica del tejido del tumor y, posteriormente, chapado a la suspensión celular resultante único de la cultura NSA. Después de 7-10 días, primaria neuroesferas de 150-200 micras de diámetro pueden ser observados y están listos para más pases y expansión.

Protocol

1. La acumulación de tejido GBM primaria

1. Un glioblastoma mutliforme (GBM) del tumor se obtiene de un paciente diagnosticado con el cáncer y someterse a una cirugía.
2. Se deben hacer arreglos con el equipo de neurocirugía. El neurocirujano lugar del tumor resecado GBM en un tubo de tamaño adecuado que contiene células madre neurales (NSC) medio basal suplementado con antibióticos 10-15% (Peniciline / estreptomicina). Medio frío se debe proporcionar a la sala de operaciones de laboratorio. Por otra parte, el frío HEPES buffer medio esencial mínimo (HEM) o tampón fosfato salino (PBS) con alta concentración de antibióticos también se pueden utilizar para este propósito.
3. El tejido del tumor resecado se entrega al laboratorio en hielo y se coloca bajo el capó.

2. La disociación de un tumor primario en una sola suspensión celular

1. El exceso del medio original / PBS se retira el tubo de halcón y la muestra se lava 2-3 veces con 5-10ml de PBS / NSC medio de base para extraer la sangre y los escombros. El PBS / medio se elimina y el tejido tumoral GBM se coloca en una placa de Petri.
2. El tejido se corta en trozos pequeños y picados con una hoja de bisturí N º 10 en pequeños pedazos para aumentar la superficie para el proceso de tripsina. Picado puede tomar de 1-3 minutos, dependiendo del tamaño del tumor.
3. El tejido picado se trypsinized en 3-5ml de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA durante 10-15 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Una pipeta electrónica se utiliza para transferir las piezas tumor pequeño y tripsina en un tubo de 15 ml Falcon.
4. Un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se agrega para detener la reacción enzimática con tripsina después del período de incubación.
5. Inactivación de la tripsina se garantiza con la pipeta de la suspensión hacia arriba y abajo varias veces. Luego, la suspensión se sedimentan por centrifugación a 800rpm (110 g) durante 5 minutos.
6. El sobrenadante se descarta y las piezas de tejido se resuspendió en 1 ml de agua estéril NSC basal media. Los grupos se disocian pipeteando suavemente arriba y abajo (3-7 veces) hasta que una suave suspensión lechosa sola célula se logra. El número de pasos de pipeteo depende directamente del tamaño de las partículas en el tejido picado. Disociación mecánica prolongada y vigorosa se debe evitar, ya que podría resultar en la muerte celular y una reducción en la formación de la esfera.
7. Para eliminar sin disociar las piezas y los escombros, 10-15 ml de medio basal se añade al tubo y la suspensión celular se filtra a través de un colador 40 micras de células en un tubo de 50 ml.
8. Se filtró la suspensión se centrifuga a 800rpm (110 g) durante 5 minutos. El sobrenadante se descarta después.
9. Pastillas de células son luego resuspendido en 1-2 ml de medio completo NSC para el recuento de células.

3. Recuento de células y Revestimiento

1. 10 l de la suspensión celular se añade a 90 L de Trypan 0,04% azul en un tubo eppendorf 1 ml.
   Nota: otras células apropiadas diluciónciones también se puede utilizar.
2. Pipeta de arriba y abajo para mezclar la suspensión. 10 l de las células / mezcla de azul tripán se transfiere a hemocitómetro con el fin de contar con la densidad celular.
3. Las células se sembraron en medio completo NSC (una mezcla de medio basal NSC NSC y complementar la proliferación en una proporción de 9:01), complementado con 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml y 1μl/ml del 0,2% con heparina (2μg/ml) en apropiado vasos de cultivo de tejidos. 5 ml, 20 y 40 de medio se utiliza para frascos T25, T80 y T175, respectivamente. Los antibióticos pueden ser añadidos al medio a una concentración de 1:100 para disminuir la posibilidad de contaminación.
4. El matraz se coloca en una incubadora a 37 ° C y 5% CO _2.

4. Pases y ampliación de las esferas GBM derivados:

1. Cuando las neuroesferas alcanzado un tamaño promedio de 150 a 200 micras de diámetro, la cultura está listo para la subcultura. El contenido de cada matraz se retira y se coloca en un TISS tamaño estéril apropiadatubo ue la cultura, y se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Se elimina el sobrenadante y el sedimento se resuspende en 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA.
3. Para lograr un óptimo tripsinización, la suspensión de células se incubaron a 37 º C en un baño de agua durante 2-3 min. Para detener la actividad de la tripsina un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade a la suspensión celular y la suspensión celular es ligeramente pipeta hacia arriba y abajo.
4. La suspensión celular se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min. Luego, se retira el sobrenadante y las células se resuspenden en 1 ml de medio de NSC.
5. El recuento celular se realizó como se describió anteriormente.
6. Las células se sembraron a una concentración de 5x10 ⁴ células / ml en medio completo NSC complementado con factores de crecimiento y se colocaron en recipientes de tamaño apropiado de cultivo de tejidos como se describe en la parte anterior.
7. Neuroesferas secundaria se forman en 7-10 días cuando se incuban a 37 ° C en un ambiente húmedoficados incubadora con 5% de CO _2.

5. Los resultados representativos:

Después de la siembra de las células individuales cosechados a partir de tejido del tumor GBM, tumor, como las células madre proliferan y se generan pequeños grupos de células compone de unas pocas células en 3-4 días (ver el video y la Figura 1). A medida que estos grupos crecen, adquieren una forma más esférica, para que por 7-8 días, propias esferas fase brillante, con un diámetro promedio de 150 a 200 micrones forma (Vea el video y la Figura 2). A mayor aumento, las esferas de salud por lo general demuestran microspikes en su periferia. Tener gran esfera como racimos de 1-2 días después del inicio de la cultura se debe a la existencia de grupos no disociada de la borrachera de la cultura y no debe ser confundido con las esferas verdad. La cantidad de desechos en cultivo primario esfera tumor varía en función de la fuente inicial de los tejidos y si es o no incluye cualquier tejido cerebral circundante. Técnicas adecuadas de preparación de tejidosincluyendo la disociación enzimática y mecánica, y la posterior filtración de la muestra con una cantidad suficiente de medio puede resultar en menos residuos en la cultura.

Figura 1. Cultivo primario esfera GBM cuatro días después de la siembra. Madre tumorales-como las células proliferan y generan pequeños grupos de células en 3-4 días. Original de ampliación; 20x.

Figura 2. Paso una cultura de ámbito GBM ocho días después de la siembra. Original de ampliación; 20x.

Discussion

Para aislar madre neurales y células progenitoras de adulto normal y el cerebro fetal ^{1, 2, 3, 4} y también madre tumorales-como las células de cáncer de los tejidos como el pulmón ^{5, 6} de próstata, mama y cerebro ^{7 8 9,} el ensayo ha sido neuroesfera utiliza con frecuencia como el método de elección. El uso de este ensayo simple y reproducible, se puede generar un número indefinido de las células del tejido del tumor resecado que muestran características similares a las células madre somáticas; multipotencia ex vivo, la capacidad de crear nuevos tumores tras la implantación, y auto-renovación. Estas células podrían utilizarse para estudiar la biología de las células cancerosas básicas, incluyendo las interacciones de célula a célula, y la diferenciación, la migración de la invasión, y la muerte celular. Además, tumorales aisladas como células madre constituyen una herramienta valiosa para estudiar cómo se forman los tumores, el progreso, y la recaída, y también para desentrañar los mecanismos celulares subyacentes derivados que eventualmente podría aportar información a la terapéuticaopciones.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche Group	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD Biosciences	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Biosciences	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.