Summary
Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.
Abstract
Stem-like Zellen in Tumoren wie Brust-, Lungen-, Darm-, Prostata und Gehirn isoliert worden. Ein kritischer Punkt bei all diesen Tumoren, insbesondere in Glioblastom mutliforme (GBM), zu identifizieren und zu isolieren tumorauslösende Zellpopulation (s), um ihre Rolle in der Tumorentstehung, Progression, und ein erneutes Auftreten zu untersuchen. Understanding tumorauslösende Zellpopulationen werden Hinweise auf der Suche nach wirksamen Therapien für diese Tumoren liefern. Die Neurosphäre Assay (NSA) aufgrund seiner Einfachheit und Reproduzierbarkeit als die Methode der Wahl für die Isolierung und Vermehrung von vielen dieser Tumorzellen eingesetzt. Dieses Protokoll zeigt die Neurosphäre Kultur-Methode zu isolieren und zu erweitern Stamm-ähnliche Zellen in operativ entfernt menschlichen GBM Tumorgewebe. Die Verfahren beinhalten eine erste chemische Verdauung und mechanische Dissoziation von Tumorgewebe und anschließend plating die daraus resultierenden einzigen Zellsuspension in NSA Kultur. Nach 7-10 Tagen, primäre Neurosphären von 150-200 um im Durchmesser beobachtet werden und sind für die weitere Passage und Expansion bereit.
Protocol
1. Erhebung von Primärdaten GBM Tissue
- Ein Glioblastom mutliforme (GBM) Tumor ist von einem Patienten mit der Diagnose Krebs und Chirurgie erhalten.
- Arrangements muss mit der Neurochirurgie Team vorgenommen werden. Der Neurochirurg wird der resezierten GBM Tumor in einer angemessenen Größe Röhrchen mit neuralen Stammzellen (NSC) Basalmedium mit 10-15% Antibiotika (Peniciline / Streptomycin) ergänzt Platz. Kalte Medium muss auf OP-Saal durch Labor zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kalten HEPES-gepufferte Minimum Essential Medium (HEM) oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer hohen Konzentration von Antibiotika kann auch für diesen Zweck verwendet werden.
- Die resezierten Tumorgewebes ist das Labor auf Eis angeliefert und unter der Haube.
2. Dissoziation des Primärtumors in Single-Cell Suspension
- Excess der ursprünglichen Medium / PBS wird aus der Falcon-Röhrchen abgenommen und die Probe wird 2-3 mal mit 5-10m gewaschenl PBS / NSC Basalmedium zu entfernen Blut und Schmutz. Die PBS / Medium wird entfernt und die GBM Tumorgewebe wird in einer Petrischale.
- Das Gewebe wird in kleine Stücke geschnitten und gehackt mit einem Nr. 10 Skalpell in kleine Stücke, um die Oberfläche für Trypsinierung zu erhöhen. Wiegemesser kann 1-3 Minuten je nach Größe des Tumors.
- Das zerkleinerte Gewebe wird in 3-5ml vorgewärmtes% 0,05 Trypsin-EDTA für 10-15 Minuten bei 37 ° C Wasserbad trypsiniert. Eine elektronische Pipette wird verwendet, um die winzigen Tumor Stücke und Trypsin in ein 15ml Falcon-Röhrchen übertragen.
- Ein gleiches Volumen von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zugesetzt wird, um die enzymatische Reaktion Trypsin nach der Inkubationszeit zu stoppen.
- Trypsin Inaktivierung durch Pipettieren der Suspension nach oben und unten mehrfach gesichert. Dann wird die Suspension pelletiert unten durch Zentrifugation bei 800rpm (110g) für 5min.
- Der Überstand wird verworfen und die Gewebestücke werden in 1 ml steriler NSC ba resuspendiertsal Medium. Die Klumpen sind durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren (3-7 mal), bis eine glatte milchig einzigen Zellsuspension erreicht dissoziiert. Die Zahl der Pipettierschritte direkt abhängig von der Größe der Partikel in der zerkleinerte Gewebe. Lange und kräftige mechanische Dissoziation sollte vermieden werden, da es in Zelltod und eine Reduktion in der Sphäre Bildung könnte Folge sein.
- Um un-dissoziierte Teile und Trümmer zu entfernen, ist 10-15 ml Basismedium in das Röhrchen gegeben und die Zellsuspension durch ein 40 Mikron Zelle Sieb in eine 50ml Tube gefiltert.
- Die filtrierte Suspension wird bei 800rpm (110g) für 5min zentrifugiert. Der Überstand wird anschließend verworfen.
- Pelletiert Zellen werden dann in 1-2ml komplette NSC Medium zur Zellzählung resuspendiert.
3. Zellzahl und Plating
- 10 l der Zellsuspension auf 90 ul von 0,04% Trypanblau in einer 1ml Eppendorf-Röhrchen aufgenommen.
Hinweis: andere geeignete Zelle Verdünnunggen können ebenfalls verwendet werden. - Pipette auf und ab, um die Aussetzung zu mischen. 10 ul der Zellen / Trypanblau Mischung auf Zählkammer überführt, um die Zelldichte zu zählen.
- Die Zellen werden in kompletten NSC Medium (eine Mischung aus NSC Basalmedium und NSC Verbreitung Ergänzung zu einem 9:1-Verhältnis) mit 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF und 1μl/ml von 0,2% Heparin (2μg/ml) ergänzt in verchromt geeigneten Zellkultur Gefäße. 5, 20 und 40 ml Medium für T25, T80 und T175-Kolben verwendet werden, bzw.. Antibiotika können das Medium bei einer Konzentration von 1:100 hinzugefügt werden, um Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern.
- Der Kolben wird in einem Inkubator eingestellt bei 37 ° C und 5% CO 2 platziert.
4. Passagieren und Ausbau der GBM abgeleitet Kugeln:
- Wenn die Neurosphären einer durchschnittlichen Größe von 150-200 &mgr; m im Durchmesser erreicht, wird die Kultur bereit für Subkultur. Der Inhalt jeder Flasche entnommen und in eine geeignete Größe sterile tiss platziertue Kultur Rohr, und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur.
- Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in 1 ml% 0,05 Trypsin-EDTA resuspendiert.
- Um eine optimale Trypsinierung, wird die Zellsuspension bei 37 ° C im Wasserbad für 2-3 min inkubiert. Zum Stoppen der Trypsin-Aktivität ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zur Zellsuspension gegeben und die Zellsuspension vorsichtig und pipettiert nach unten.
- Die Zellsuspension wird bei 800 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgenommen und die Zellen werden in 1 ml der NSC-Medium resuspendiert.
- Eine Zellzahl erfolgt wie oben beschrieben.
- Die Zellen werden in einer Konzentration von 5x10 4 Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit Wachstumsfaktoren und vernickelt in entsprechender Größe Gewebekultur Schiffe wie in den vorangegangenen Teil beschrieben ausplattiert.
- Sekundäre Neurosphären werden in ca. 7-10 Tagen entsteht, wenn bei 37 ° C in einer feuchtenified Inkubator mit 5% CO 2.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Nach dem Ausstreichen der einzelnen Zellen von GBM Tumorgewebe entnommen, vermehren sich Tumorstammzellen-ähnliche Zellen und erzeugen kleine Cluster von Zellen wenige Zellen in 3-4 Tagen zusammen (siehe Video und Bild 1). Wie diese Cluster wachsen, erhalten sie eine Kugelform, so dass von 7-8 Tagen, korrekten Phase helle Kugeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 150-200 Mikrometern (Sehen Sie das Video und Abbildung 2). Bei höherer Vergrößerung, gesunde Bereiche in der Regel zeigen microspikes an ihrer Peripherie. Nachdem große Kugel wie Trauben in 1-2 Tagen nach Einleitung Kultur ist durch die Existenz von nicht-dissoziierten Klumpen an der binging der Kultur und sollte nicht als echte Kugeln verwechselt werden. Die Menge der Ablagerungen in Primärtumor Bereich Kultur hängt von der ursprünglichen Quelle des Gewebes abhängig und ob es umfasst alle umliegenden Hirngewebe. Proper Gewebe Präparationstechnikeneinschließlich enzymatischer und mechanischer Dissoziation und anschließender Filtration der Probe mit einer ausreichenden Menge Medium kann in weniger Geröll in der Kultur führen.
Abbildung 1. Primary GBM Bereich Kultur 4 Tage nach dem Ausplattieren. Tumorstammzellen-ähnlichen Zellen vermehren sich und erzeugen kleine Gruppen von Zellen in 3-4 Tagen. Original-Vergrößerung, 20x.
Abbildung 2. Gang sind GBM Bereich Kultur 8 Tage nach dem Ausplattieren. Original-Vergrößerung, 20x.
Discussion
Um neuralen Stamm-und Vorläuferzellen aus normalen Erwachsenen und fetale Gehirn 1, 2, 3, 4 zu isolieren und auch Tumorstammzellen-ähnliche Zellen aus Krebsgewebe wie Lungen-5, Prostata-6, 7 und Brust Gehirn 8, 9 der Neurosphäre Assay wurde häufig als die Methode der Wahl eingesetzt. Mit diesem einfachen und reproduzierbaren Test kann man erzeugen, eine unbestimmte Anzahl von Zellen aus resezierten Tumorgewebes, die ähnliche Merkmale wie somatische Stammzellen zeigen, ex vivo Multipotenz, die Fähigkeit, neue Tumoren nach der Implantation zu schaffen und sich selbst zu erneuern. Diese Zellen könnten verwendet werden, um die grundlegenden Krebs Zellbiologie einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, und die Differenzierung, Migration, Invasion und Zelltod zu untersuchen. Darüber hinaus bieten isoliert Tumorstammzellen-ähnlichen Zellen ein unschätzbares Werkzeug zu untersuchen, wie Tumore zu bilden, Fortschritt und Rückfall und auch auf die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen ableiten, die schließlich Erkenntnisse zu therapeutischen könnte entwirrenOptionen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Florida-Zentrum für Hirntumor Forschung gefördert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
- Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
