Denna video protokoll visar isolering och utbyggnad av stamceller som celler från kirurgiskt avlägsnade mänskliga glioblastom mutliforme (GBM) tumörvävnad med hjälp av neurosphere metoden analys kultur.
Stem-liknande celler som har isolerats i tumörer, såsom bröst-, lung-, tjocktarms-, prostata och hjärna. En kritisk fråga i alla dessa tumörer, särskilt i glioblastom mutliforme (GBM) är att identifiera och isolera tumörer cellpopulation (s) för att undersöka deras roll i tumörbildning, progression och upprepning. Förstå tumörer cellpopulationer ger ledtrådar till att finna effektiva behandlingsmetoder för dessa tumörer. Den neurosphere analys (NSA) på grund av sin enkelhet och reproducerbarhet har använts som metod i valet för isolering och förökning av många av denna tumörceller. Detta protokoll visar neurosphere kultur metod för att isolera och expandera stamceller-liknande celler i kirurgiskt avlägsnade mänskliga GBM tumörvävnad. De förfaranden inkluderar en inledande kemisk nedbrytning och mekanisk dissociation av tumörvävnad, och därefter plätering den resulterande enskild cell suspension i NSA kultur. Efter 7-10 dagar, primär neurospheres på 150-200 mikrometer i diameter kan observeras och är redo för ytterligare passaging och expansion.
Att isolera neurala stamceller och progenitorceller från normala vuxna och foster hjärnor 1, 2, 3, 4 och också tumör stamceller-liknande celler från cancer vävnader såsom lungor 5, prostata-6, bröst 7 och hjärna 8, 9 av neurosphere analysen har ofta som den metod som föredras. Med denna enkla och reproducerbara analys, kan man skapa ett oändligt antal celler från opererande tumörvävnad som visar liknande egenskaper som somatiska stamceller, ex vivo multipotency, förmågan att skapa nya tumörer efter implantation, och självförnyelse. Dessa celler kan användas för att studera grundläggande biologi cancercellen inklusive cell till cell interaktioner, och differentiering, migration, invasion och celldöd. Dessutom isolerad tumör stamceller-liknande celler ger ett ovärderligt verktyg för att studera hur tumörer form, framsteg och återfall och även att riva upp de bakomliggande härrör cellulära mekanismer som så småningom skulle kunna ge insikter till terapeutiskalternativ.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Florida Centrum för hjärntumör forskning, Preston A. Wells Jr Centrum för hjärntumör terapi.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.