Summary
Bu video protokolü neurosphere tahlil kültürü yöntemi kullanılarak insan glioblastoma mutliforme cerrahi rezeksiyon (GBM) tümör dokusu hücreleri gibi izolasyon ve kök genişlemesi göstermektedir.
Abstract
Kök-benzeri hücrelerin tümörleri, meme, akciğer, kolon, prostat ve beyin gibi izole edilmiştir. Kritik bir konu, özellikle glioblastoma mutliforme (GBM), tüm bu tümörler, tümör oluşumu, ilerleme ve nüks rollerini araştırmak için tümör başlatarak hücre popülasyonu (lar) belirlemek ve yalıtmak için. Anlama tümör hücre popülasyonlarının başlatarak bu tümörler için etkili tedavi yaklaşımları bulmak için ipuçları sağlayacaktır. Sadeliği ve tekrarlanabilirlik nedeniyle neurosphere assay (NSA), bu tümör hücrelerinin birçok izolasyon ve yayılması için tercih edilen bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, cerrahi rezeksiyon insan GBM tümör dokusu kök benzeri hücreler izole etmek ve genişletmek için neurosphere kültür yöntemi göstermektedir. Prosedürleri bir başlangıç kimyasal sindirim ve tümör dokusu mekanik ayrılma, ve daha sonra NSA kültürü ortaya çıkan tek bir hücre süspansiyonu kaplama içerir. 150-2, 7-10 gün sonra birincil neurospheresÇapı 00 mikron gözlenen ve daha Pasajlanması ve genişleme için hazır olabilir.
Protocol
1. Temel GBM Doku toplanması
- Glioblastoma mutliforme (GBM), tümör, kanser tanısı ve ameliyatı geçiren bir hastanın elde edilir.
- Nöroşirürji takım düzenlemeler yapılmalıdır. Beyin cerrahı, nöral kök hücre (MGK),% 10-15 antibiyotikler (Peniciline / Streptomisin) ile desteklenmiş bazal orta içeren uygun bir boyut tüp rezeke GBM tümör koyacaktır. Soğuk ortamda laboratuarı tarafından ameliyathaneye sağlanmalıdır. Alternatif olarak, soğuk Hepes-tamponlu minimum esansiyel orta (HEM) ve fosfat tamponlu salin (PBS) yüksek antibiyotik konsantrasyonu ile de bu amaçla kullanılabilir.
- Rezeke edilen tümör dokusu buz üzerinde laboratuara teslim edilir ve kaputun altında yerleştirilir.
2. Tek Hücre Süspansiyon içine Primer Tümör Disosiyasyon
- Orijinal orta / PBS Aşırı şahin tüp çıkarılır ve örnek 5-10m ile 2-3 defa yıkanır.PBS / MGK bazal orta l kan ve enkaz kaldırmak için. PBS / Orta kaldırılır ve GBM tümör dokusu bir Petri kabı yerleştirilir.
- Dokusu küçük parçalar halinde kesilir ve trypsinization işlemi için yüzey alanını artırmak için küçük parçalar halinde 10 numaralı neşter bıçağı ile kıyılmış. Kıyma tümörün büyüklüğüne bağlı olarak 1-3 dakika sürebilir.
- Kıyılmış doku önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA az 10-15 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda 3-5ml tripsinize. Bir elektronik pipet 15 ml Falcon tüp içine küçük tümör parçaları ve tripsin aktarmak için kullanılır.
- Inkübasyon döneminden sonra enzimatik tripsin reaksiyonu durdurmak için eşit miktarda soya tripsin inhibitörü eklenir.
- Birkaç kez aşağı süspansiyon pipetleme ve tripsin inaktivasyon tarafından sağlanmaktadır. Sonra, süspansiyon 5min için 800rpm (110g) santrifüj pelet.
- Süpernatant atılır ve doku parçaları steril MGK ba 1ml yeniden süspansesal orta. Kümeleri hafifçe düzgün bir sütlü tek hücre süspansiyonu elde edilene kadar (3-7 kat) aşağı yukarı pipetleme ve ayrışmış. Pipetleme adımların sayısı kıyılmış doku parçacıklarının büyüklüğü doğrudan bağlıdır. Uzun ve güçlü mekanik ayrılma, hücre ölümü ve kürenin oluşumunda bir azalma meydana gelebilir kaçınılmalıdır.
- Un-ayrışmış parçaları ve enkaz kaldırmak için, 10-15 ml bazal orta tüp eklenir ve hücre süspansiyonu 50ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek süzülür.
- Süzülmüş süspansiyon 5min 800rpm (110g) santrifüj edilir. Süpernatant daha sonra atılır.
- Pelletted hücreler daha sonra yeniden süspanse hücre sayımı için tam MGK orta 1-2ml.
3. Hücre Sayımı ve Kaplama
- Hücre süspansiyonu 10 mcL 0.04% Tripan mavi bir 1ml Eppendorf tüp içinde 90 mcL eklenir.
Not: diğer uygun hücre dilüsyonuAfin grup de kullanılıyor olabilir. - Süspansiyonu karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Hücre yoğunluğu saymak için 10 hücre / tripan mavi karışımı mcL hemasitometre aktarılır.
- Hücreler,% 0.2 heparin (2μg/ml) 20ng/ml EGF, 10 ng bFGF ve 1μl/ml ile desteklenmiş tam MGK orta (MGK bazal, orta ve MGK proliferasyon takviyesi 09:01 oranında bir karışımı) kaplama. uygun doku kültürü gemiler. Orta, 5, 20 ve 40 ml, T25, T80 ve T175 şişeler için kullanılır. Antibiyotikler, kontaminasyon olasılığını azaltmak için 1:100 konsantrasyonda orta eklenebilir.
- Balon, 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübatör sette yer almaktadır .
4. GBM elde edilen küre Pasajlanması ve genişleme:
- Neurospheres ortalama büyüklüğü 150-200 mikron çapında ulaştığında, kültür altkültürü için hazırdır. Her balonun içeriği uygun bir boyut steril Tiss kaldırılır ve yerleştirilirue kültür tüp ve 800 rpm (110 gr) oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj.
- Süpernatant kaldırılır ve pelet 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA yeniden süspanse.
- Optimal bir trypsinization ulaşmak için, hücre süspansiyonu, 37 ° C'de 2-3 dakika süreyle su banyosunda inkübe edilir. Tripsin faaliyeti durdurmak için soya tripsin inhibitörü eşit hacimli hücre süspansiyonu ilave edilir ve hücre süspansiyonu hafifçe aşağı yukarı pipetlenir ve.
- Hücre süspansiyonu için 800 rpm (110g) 5 dakika santrifüj edilir. Sonra, süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin MGK orta 1 ml yeniden süspanse.
- Daha önce açıklandığı gibi bir hücre sayımı yapılır.
- Hücrelerinin büyüme faktörleri ve uygun büyüklükte doku kültürü damarlarda önceki bölümde açıklandığı gibi kaplama ile takviye tam MGK orta 5x10 4 hücre / ml konsantrasyonda kaplanmıştır.
- Nemli bir 37 ° C inkübe Ortaöğretim neurospheres 7-10 gün içinde oluşur% 5 CO 2 ified inkübatör.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
GBM tümör dokusu hasat tek hücre kaplama sonra, tümör kök hücrelerinin hızla çoğalmasına ve (video ve bkz. Şekil 1), 3-4 gün içinde birkaç hücreden oluşan küçük hücre kümeleri oluşturmak. Bu kümeler büyüdükçe, onlar 150-200 mikron formu (video ve Bakınız Şekil 2) ortalama çapı 7-8 gün böylece daha küresel bir şekil, uygun faz parlak küreler kazanır. Yüksek büyütme, sağlıklı küreler genellikle çevre microspikes göstermektedir. Kültür başlatılması, kültür binging olmayan ayrışmış kümeleri varlığı nedeniyle ve gerçek bir küre gibi karıştırılmamalıdır sonra 1-2 gün içinde kümeler gibi büyük bir küre olması. Primer tümörün küre kültür enkaz miktarı ilk doku kaynağı bağlı olarak değişir ve çevresindeki beyin dokusu içerir olsun ya da olmasın. Uygun doku hazırlama tekniklerienzimatik ve mekanik ayrılma ve örnek sonraki filtrasyon dahil olmak üzere yeterli miktarda orta kültür az enkaz neden olabilir.
Şekil 1. Primer GBM küre kaplama 4 gün sonra kültür. Tümör kök benzeri hücreler çoğalmaya başlar ve 3-4 gün içinde küçük hücre kümeleri oluşturmak. Orijinal büyütme, 20x.
Şekil 2 Passage kaplama 8 gün sonra bir GBM kültür alanında. Orijinal büyütme, 20x.
Discussion
Normal yetişkin ve fetal beyinleri 1, 2, 3, 4, nöral kök ve progenitör hücreler izole etmek için ve kök gibi, 5 akciğer, prostat 6 7, göğüs ve beyin 8, 9 gibi kanserli dokuların hücreleri neurosphere tahlil da tümör olmuştur sık tercih edilen yöntem olarak kullanılmaktadır. Ex vivo multipotency, implantasyon üzerine yeni tümörler oluşturmak için yeteneği ve kendini yenileme, bu basit ve tekrarlanabilir testi kullanılarak, bir somatik kök hücreler olarak benzer özellikler göstermektedir rezeke edilen tümör dokusu hücreleri belirsiz bir sayıda üretebilirsiniz. Bu hücreler, hücre-hücre etkileşimleri, ve farklılaşma, göç, istila ve hücre ölümü de dahil olmak üzere temel kanser hücre biyolojisi çalışma olabilir. Buna ek olarak, izole tümör kök hücrelerinin tümörleri, form, ilerleme ve nüks ve aynı zamanda çalışma sonunda tedavi için bilgi verebilir altta yatan kaynaklanan hücresel mekanizmaları aydınlatmak için paha biçilmez bir araç sağlar.seçenekleri.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Preston A. Wells Jr Merkezi Beyin Tümörü Tedavisi için; Bu çalışma Florida Beyin Tümörü Araştırma Merkezi Burslar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
- Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
