Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.
Stem-like Zellen in Tumoren wie Brust-, Lungen-, Darm-, Prostata und Gehirn isoliert worden. Ein kritischer Punkt bei all diesen Tumoren, insbesondere in Glioblastom mutliforme (GBM), zu identifizieren und zu isolieren tumorauslösende Zellpopulation (s), um ihre Rolle in der Tumorentstehung, Progression, und ein erneutes Auftreten zu untersuchen. Understanding tumorauslösende Zellpopulationen werden Hinweise auf der Suche nach wirksamen Therapien für diese Tumoren liefern. Die Neurosphäre Assay (NSA) aufgrund seiner Einfachheit und Reproduzierbarkeit als die Methode der Wahl für die Isolierung und Vermehrung von vielen dieser Tumorzellen eingesetzt. Dieses Protokoll zeigt die Neurosphäre Kultur-Methode zu isolieren und zu erweitern Stamm-ähnliche Zellen in operativ entfernt menschlichen GBM Tumorgewebe. Die Verfahren beinhalten eine erste chemische Verdauung und mechanische Dissoziation von Tumorgewebe und anschließend plating die daraus resultierenden einzigen Zellsuspension in NSA Kultur. Nach 7-10 Tagen, primäre Neurosphären von 150-200 um im Durchmesser beobachtet werden und sind für die weitere Passage und Expansion bereit.
Um neuralen Stamm-und Vorläuferzellen aus normalen Erwachsenen und fetale Gehirn 1, 2, 3, 4 zu isolieren und auch Tumorstammzellen-ähnliche Zellen aus Krebsgewebe wie Lungen-5, Prostata-6, 7 und Brust Gehirn 8, 9 der Neurosphäre Assay wurde häufig als die Methode der Wahl eingesetzt. Mit diesem einfachen und reproduzierbaren Test kann man erzeugen, eine unbestimmte Anzahl von Zellen aus resezierten Tumorgewebes, die ähnliche Merkmale wie somatische Stammzellen zeigen, ex vivo Multipotenz, die Fähigkeit, neue Tumoren nach der Implantation zu schaffen und sich selbst zu erneuern. Diese Zellen könnten verwendet werden, um die grundlegenden Krebs Zellbiologie einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, und die Differenzierung, Migration, Invasion und Zelltod zu untersuchen. Darüber hinaus bieten isoliert Tumorstammzellen-ähnlichen Zellen ein unschätzbares Werkzeug zu untersuchen, wie Tumore zu bilden, Fortschritt und Rückfall und auch auf die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen ableiten, die schließlich Erkenntnisse zu therapeutischen könnte entwirrenOptionen.
The authors have nothing to disclose.
Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Florida-Zentrum für Hirntumor Forschung gefördert.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.