Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.
-Come le cellule staminali sono state isolate nei tumori come mammella, polmone, colon, prostata e cervello. Un problema critico in tutti questi tumori, soprattutto in mutliforme glioblastoma (GBM), è quello di identificare e isolare popolazione di cellule tumorali di iniziare (s) per studiare il loro ruolo nella formazione del tumore, la progressione e le recidive. Tumore comprensione iniziare popolazioni di cellule fornirà gli indizi per trovare approcci terapeutici efficaci per questi tumori. Il test neurosfere (NSA) per la sua semplicità e la riproducibilità è stata utilizzata come metodo di scelta per l'isolamento e la propagazione di molte di queste cellule tumorali. Questo protocollo viene illustrato il metodo neurosfere cultura per isolare ed espandere cellule staminali, come in chirurgicamente asportato tessuto tumorale umano GBM. Le procedure comprendono una digestione iniziale dissociazione chimica e meccanica del tessuto tumorale e, successivamente, placcatura la sospensione risultante singola cellula in coltura NSA. Dopo 7-10 giorni, neurosfere primarie del 150-200 micron di diametro può essere osservato e sono pronti per un ulteriore passaging ed espansione.
Per isolare staminali neurali e cellule progenitrici da adulto normale e il cervello del feto 1, 2, 3, 4 e anche tumore-come le cellule staminali dai tessuti tumorali come il polmone 5, 6 della prostata, della mammella e del cervello 7 8, 9 il test neurosfere è stato frequentemente utilizzati come metodo di scelta. Da questo test semplice e riproducibile, si può generare un numero indefinito di cellule dal tessuto tumorale asportato che mostrano caratteristiche simili a quelle delle cellule staminali somatiche; multipotenza ex vivo, la possibilità di creare nuovi tumori al momento dell'impianto, e di auto-rinnovamento. Queste cellule potrebbero essere usate per studiare la biologia di base delle cellule tumorali tra cui cellula-cellula interazioni, e la differenziazione, migrazione, invasione e morte cellulare. Inoltre, isolato tumore-come le cellule staminali di fornire uno strumento prezioso per studiare come si formano i tumori, il progresso, e la ricaduta e anche per svelare i meccanismi alla base derivanti cellulari che alla fine potrebbe fornire spunti per terapeuticoopzioni.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Centro per la ricerca della Florida Brain Tumor; Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.