Это видео демонстрирует протокол изоляции и расширения стволовые клетки, как из хирургически удаленных человеческих mutliforme глиобластомы (GBM) опухолевой ткани использованием метода культуры neurosphere анализа.
Стволовые-подобных клеток были выделены в опухолей, таких как рак молочной железы, легких, толстой кишки, предстательной железы и мозга. Важным вопросом во всех этих опухолей, особенно в глиобластомы mutliforme (GBM), заключается в выявлении и изоляции опухоль начала клеточной популяции (ы), чтобы исследовать их роль в образовании опухоли, прогрессирование и повторения. Понимание опухоль начала клеточных популяций предоставят ключи к поиску эффективных терапевтических подходов для этих опухолей. Neurosphere анализа (NSA), благодаря своей простоте и воспроизводимости была использована в качестве метода выбора для изоляции и распространения многих из этого опухолевые клетки. Этот протокол демонстрирует neurosphere метод культуры, чтобы изолировать и расширить стволовых клеток, как хирургически удаленных человеческих тканей опухоли GBM. Процедуры включают в себя начальное переваривание химической и механической диссоциации опухолевой ткани, а затем покрытие в результате суспензии отдельных клеток в культуре АНБ. Через 7-10 дней, первичные нейросферы из 150-200 мкм в диаметре может наблюдаться и готовы к дальнейшему пассажей и расширения.
Чтобы изолировать нейронных стволовых и прогениторных клеток из нормальных взрослых и плода мозг 1, 2, 3, 4, а также опухолевые стволовые клетки, как от рака тканей, таких как рак легких 5, 6 простаты, молочной железы 7 и 8 мозг, 9 neurosphere анализа была часто используется как метод выбора. С помощью этой простой и воспроизводимый анализ, можно генерировать неограниченное число клеток из ткани удаленной опухоли, которые показывают, что аналогичные характеристики, как соматические стволовые клетки, экс multipotency живом организме, способность создавать новые опухоли при имплантации, и самообновлению. Эти клетки могут быть использованы для изучения фундаментальной биологии раковых клеток, включая клетки к межклеточных взаимодействий и дифференциации, миграции, вторжения и гибели клеток. Кроме того, изолированные опухолевые стволовые клетки обеспечивают как бесценным инструментом для изучения того, как опухоль формы, прогресс, и рецидивов, а также раскрыть основные вытекающие клеточные механизмы, которые в конечном итоге может дать ответ на терапевтическиеварианты.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от центра Флориды для исследований мозга опухоли; Престон А. Уэллс Центр терапии опухолей мозга.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.