Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.
Como las células madre han sido aislados en los tumores, como mama, pulmón, colon, próstata y cerebro. Una cuestión fundamental en todos estos tumores, especialmente en mutliforme glioblastoma (GBM), es el de identificar y aislar células tumorales de la población de iniciar (s) para investigar su papel en la formación del tumor, la progresión y la recurrencia. Tumor comprensión de iniciar las poblaciones de células proporcionará pistas para encontrar enfoques terapéuticos efectivos para estos tumores. El ensayo neuroesfera (NSA), debido a su sencillez y reproducibilidad ha sido utilizado como el método de elección para el aislamiento y la propagación de muchas de estas células tumorales. Este protocolo demuestra el método de cultivo neuroesfera para aislar y expandir madre-como las células en el tejido resecado quirúrgicamente de tumores humanos GBM. Los procedimientos incluyen una digestión química inicial y disociación mecánica del tejido del tumor y, posteriormente, chapado a la suspensión celular resultante único de la cultura NSA. Después de 7-10 días, primaria neuroesferas de 150-200 micras de diámetro pueden ser observados y están listos para más pases y expansión.
Para aislar madre neurales y células progenitoras de adulto normal y el cerebro fetal 1, 2, 3, 4 y también madre tumorales-como las células de cáncer de los tejidos como el pulmón 5, 6 de próstata, mama y cerebro 7 8 9, el ensayo ha sido neuroesfera utiliza con frecuencia como el método de elección. El uso de este ensayo simple y reproducible, se puede generar un número indefinido de las células del tejido del tumor resecado que muestran características similares a las células madre somáticas; multipotencia ex vivo, la capacidad de crear nuevos tumores tras la implantación, y auto-renovación. Estas células podrían utilizarse para estudiar la biología de las células cancerosas básicas, incluyendo las interacciones de célula a célula, y la diferenciación, la migración de la invasión, y la muerte celular. Además, tumorales aisladas como células madre constituyen una herramienta valiosa para estudiar cómo se forman los tumores, el progreso, y la recaída, y también para desentrañar los mecanismos celulares subyacentes derivados que eventualmente podría aportar información a la terapéuticaopciones.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas del Centro de Florida para la Investigación de Tumores Cerebrales, Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia tumor cerebral.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.