Évaluer les changements métaboliques hépatiques pendant la colonisation progressive des axéniques de souris par 1 H NMR Spectroscopy

Summary

Une procédure est décrite colonisation progressive pour mieux évaluer son impact sur le métabolisme hépatique hôte. La colonisation est surveillé non invasive, en évaluant l'excrétion urinaire de métabolites microbiens co-par RMN basée sur le profilage métabolique tandis métabolisme hépatique est évalué par la Haute Résolution angle magique (MAS RH) RMN de profilage intacte biopsie.

Abstract

Il est bien connu que les bactéries intestinales contribuent de manière significative à l'homéostasie hôte, offrant une gamme de prestations telles que la protection immunitaire et la synthèse de vitamine. Ils fournissent également l'hôte d'une quantité considérable de nutriments, ce qui rend cet écosystème un organe métabolique essentiel. Dans le contexte de plus en plus évident le lien entre la flore intestinale et le syndrome métabolique, la compréhension des interactions métaboliques entre l'hôte et sa microflore intestinale est devenue un enjeu important de la biologie moderne. ^1-4

Colonisation (appelé aussi processus de normalisation) désigne la création de micro-organismes dans une ancienne exempte de germes d'origine animale. S'il est un processus naturel survenant à la naissance, il est aussi utilisé chez les adultes sans germes animaux pour contrôler l'écosystème intestinal floraux et de mieux déterminer son impact sur le métabolisme de l'hôte. Une procédure commune pour contrôler le processus de colonisation est d'utiliser la méthode de gavage avec un single ou un mélange de micro-organismes. Cette méthode conduit à une colonisation très rapide et présente l'inconvénient d'être extrêmement stressant ^5. Il est donc utile de minimiser le stress et d'obtenir un processus plus lent de colonisation d'observer progressivement l'impact de la mise en place sur le métabolisme des bactéries hôtes.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une procédure pour évaluer la modification du métabolisme hépatique au cours d'un processus de colonisation progressive en utilisant une technique non destructive métaboliques profilage. Nous proposons de suivre la colonisation microbienne intestinale en évaluant l'activité métabolique microbienne intestinale reflétée par l'excrétion urinaire de métabolites microbiens co-par ^une profilage métabolique par RMN H-fondée. Cela permet une appréciation de la stabilité de l'activité microbienne intestinale delà de l'établissement stable de l'écosystème microbien intestinal généralement évaluée par le suivi des bactéries fécales par DGGE (électrophorèse sur gel dénaturant gradient). ⁶ Lela colonisation se déroule dans un environnement ouvert et conventionnelles est initiée par une litière sale souillés par des animaux conventionnels, qui serviront de témoins. Les rongeurs sont des animaux coprophages, ce qui assure une colonisation homogène, comme décrit précédemment. ⁷

Profilage métabolique hépatique est mesurée directement à partir d'une biopsie du foie intact en utilisant ¹ H High Angle magique Résolution Spinning spectroscopie RMN. Cette technique semi-quantitative offre un moyen rapide d'évaluer, sans endommager la structure cellulaire, les principaux métabolites tels que les triglycérides, de glucose et de glycogène afin de mieux estimer l'interaction complexe entre les processus de colonisation et le métabolisme hépatique ^7-10. Cette méthode peut également être appliqué à toute une biopsie tissulaire ^11,12.

Protocol

1. La colonisation du germe sans animaux et la collecte de l'échantillon Retirer les animaux sans germes d'isolateurs et de les héberger dans une salle de l'élevage dans des cages conventionnelles équipés d'un filtre à l'avant des animaux conventionnels qui servent de témoins (figure 1). Mélanger la moitié de la litière (3 jours) prises de la cage de commande classique avec la litière des animaux sans germes. Toujours garder un tiers de la litière sale conventionnels …

Discussion

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure de colonisation progressive dans un milieu ouvert aux autres d'étudier l'impact du microbiote intestinal sur le métabolisme hépatique évalué par ¹ H RMN HR MAS profilage des intacte biopsie. Diverses méthodes de la colonisation ont été décrits dans la littérature. Les méthodes les plus communes de coloniser les animaux avec un microbiote sont définis par gavage oral ou de l'eau potable contaminée ^19,20. L'inoculation …

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913