Summary
अग्रानुक्रम संबंध शुद्धीकरण प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण है. अवधारणा का सबूत के रूप में अच्छी तरह से विशेषता अनुवाद दीक्षा कारक सह वेग eIF4E मेजबान सेल कारकों अनुवाद दीक्षा में शामिल करने के लिए इस पद्धति लागू किया गया था. इस विधि को आसानी से किसी भी सेलुलर या वायरल प्रोटीन के लिए अनुकूल है.
Protocol
1. सेल लाइनों की पीढ़ी: में अभिकर्मक pMEP4 / अभिव्यक्ति
- Transfect pMEP4 अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ कोशिकाओं और hygromycin B / एमएल (Roche) 100 μg के साथ चयन करें जब तक सब नकली ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से मारे जा चुके हैं. pMEP4 प्लाज्मिड episomally बनाए रखा है वहाँ कोई विशिष्ट क्लोन को अलग करने के लिए की जरूरत है.
- युक्त कोशिकाओं pMEP4 वेक्टर 16 घंटे के लिए 10 माइक्रोन CdCl 2 के साथ इलाज के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. अभिव्यक्ति और inducibility सेल लाइनों के प्रवर्धन से पहले एक छोटे पैमाने पर पुष्टि की जानी चाहिए. प्रोटीन नल टैग आसानी से हो सकता है के रूप में प्रोटीन जी डोमेन लगभग सभी प्रजातियों में से एंटीबॉडी के लिए बाध्य पता लगाया जा सकता है. Purifications के लिए बड़े पैमाने पर आमतौर पर 10 सहधारा कक्षों की 175 सेमी 2 बोतल की आवश्यकता है. यह लगभग 2 X10 8 व्यक्त की कोशिकाओं के लिए equates.
2. सेल lysate तैयारी
- पीबीएस में कोशिकाओं परिमार्जन और एक एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में गठबंधन. 1200X gf के स्पिनया 5 मिनट (इस पैक कोशिकाओं के 2-3 मिलीग्राम में परिणाम के साथ शुरू करने के लिए, जो धोने के बाद के बारे में 1.5 मिलीग्राम को कम कर देता है)
- कोशिकाओं को बहुत ठंडा पीबीएस (50 mls हर समय) में तीन बार धो लें.
- 5 मिलीलीटर lysis बफर (में कोशिकाओं Lyse 50 मिमी Tris - एचसीएल (7.5 पीएच), 125 मिमी NaCl, ग्लिसरॉल 5%, 0.2% एनपी-40, 1.5 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी NAF, 1 मिमी ना 3 4 VO और protease अवरोध करनेवाला ). नोट: NAF, ना 3 4 VO और protease inhibitors के ताजा जोड़ा जाना चाहिए. विंदुक ऊपर और नीचे बर्फ पर 5 मिनट के लिए रवाना होने से पहले 10 बार. सिरिंज और नीचे 5-10 बार बर्फ पर बर्फ पर 5 मिनट के लिए फिर से जाने से पहले एक मुँहफट सुई का उपयोग. Syringing दोहराएँ और बर्फ पर एक और 5 मिनट के लिए छोड़ दें.
- Lysate दो बार रुक - गल (तरल N 2 / या शुष्क बर्फ और इथेनॉल). नमूना से अधिक 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए अनुमति न दें नोट: आप -80 में इस नमूने की दुकान डिग्री सेल्सियस तक आप प्रक्रिया के लिए समय हो सकता है.
- 1.5 मिलीग्राम ट्यूबों में नमूना अशेष भाजक और हटाने unlysed कोशिकाओं और घcentrifugation (4 बजे 10 मिनट डिग्री सेल्सियस, 16,000 एक्स जी) के द्वारा ebris.
- सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में गठबंधन और (वैकल्पिक) प्रोटीन उपज मात्रा का ठहराव के लिए एक 20 μl नमूना लेने से पहले एक .45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. बाद के विश्लेषण (1 नमूना) के लिए एक और आगे 50 μl अशेष भाजक निकालें.
3. , आईजीजी - agarose खरगोश के लिए बाध्य
(नोट: 1200X जी पर सभी spins के बाहर किया जाना चाहिए एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में डिग्री सेल्सियस 4 में 1 मिनट के लिए, जब तक अन्यथा न कहा गया है)
- धीरे बोतल घूमता से खरगोश आईजीजी agarose समाधान (सिग्मा Aldrich) resuspend. आईजीजी agarose (एक कट 1ml विंदुक टिप का उपयोग करके) 380 μl ले लो और 1 मिनट के लिए centrifugation द्वारा शिपिंग / परिरक्षक समाधान निकालने. Agarose ठंडा lysis बफर (4 डिग्री सेल्सियस) centrifugation का उपयोग करने के लिए स्पष्ट है. में तीन बार धोयें. agarose की अंतिम उपज पैक मोतियों के बारे में 250 μl होना चाहिए.
- 2.6 (15 मिलीलीटर बाज़ टब में से मंजूरी दे दी सेल lysate जोड़ेंई) धोया खरगोश आईजीजी agarose और सेते हैं 4 में 3 घंटे के लिए (या रातोंरात) डिग्री सेल्सियस एक घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर.
- डिग्री सेल्सियस 4 में 5 मिनट के लिए नीचे agarose माला और स्पिन बाद विश्लेषण (नमूना 2) के लिए सतह पर तैरनेवाला हटाने. नोट: प्रोटीन टैग नल अब मोती के साथ जुड़ा होना चाहिए.
4. TEV प्रोटीज दरार
(ध्यान दें: सभी spins के 1200X जी पर बाहर किया जाना चाहिए 4oC एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 1 मिनट के लिए, जब तक अन्यथा न कहा गया है)
- खरगोश आईजीजी agarose मनकों ठंडा lysis बफर में तीन बार धो (4 डिग्री सेल्सियस) centrifugation का उपयोग स्पष्ट करने के लिए (ध्यान दें: lysis बफर protease inhibitors नहीं शामिल करना चाहिए). देखभाल के लिए नहीं निकाल या धोने चरणों के दौरान किसी भी मोती खो करने के लिए लिया जाना चाहिए.
- मोती TEV प्रोटीज दरार (10 मिमी Tris - एचसीएल (7.5 पीएच), 100 मिमी NaCl, और 0.2% एनपी 40) बफर centrifugation का उपयोग स्पष्ट करने के साथ एक और दो बार धो लें. पिछले धोने के बाद ध्यान से सब ली निकालेंमोती से फंकी.
- TEV प्रोटीज दरार मिश्रण तैयार करें, प्रत्येक नमूना के लिए 467.5 μl एच 2 हे, 25 μl TEV 20x बफर (Invitrogen), 5 μl 0.1M डीटीटी और 2.5 (25 यू) μl TEV Protease (Invitrogen) शामिल हैं. पैक मोतियों की प्रत्येक नमूना के लिए इस TEV दरार मिश्रण के 500 μl जोड़ें और एक 1.7 मिलीग्राम ट्यूब पूर्व चिकनाई (costar) पूरे मिश्रण हस्तांतरण. पूर्व ऊष्मायन बाद विश्लेषण (3 नमूना) के लिए एक 30 μl अशेष भाजक को दूर करने के लिए.
- TEV प्रोटीज प्रतिक्रिया 4 बजे रात सेते हैं डिग्री सेल्सियस एक घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर. नोट करें कि कम incubations बार चारा प्रोटीन और TEV प्रोटीज दरार साइट है, लेकिन कम से कम ऊष्मायन समय की पहुँच की प्रकृति पर निर्भर करता है empirically का इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित किया जाना चाहिए.
5. के स्थिर streptavidin प्लस मोती Ultralink बाध्यकारी
(नोट: 1200X जी पर सभी spins के बाहर किया जाना चाहिए एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में डिग्री सेल्सियस 4 में 1 मिनट के लिए, जब तक अन्यथा न कहा गया है)
6. Streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड और चारा प्रोटीन बायोटिन क्षालन
(नोट: 1200X जी पर सभी spins के बाहर किया जाना चाहिए एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में डिग्री सेल्सियस 4 में 1 मिनट के लिए, जब तक अन्यथा न कहा गया है)
- बायोटिन (1 मिमी डी - बायोटिन) और 3 (या रातोंरात) घंटे एक घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में incubating के पीबीएस की 500 μl जोड़ने streptavidin मोतियों से टैग प्रोटीन Elute के.
- 4 ° सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए streptavidin मोतियों नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटाने के एक 1.5 मिलीलीटर पूर्व चिकनाई (ट्यूब नोट: यह अपने अंतिम नमूना / क्षालन (7 नमूना) है.
- शेष streptavidin मोती पीबीएस और 2-3 (या रातोंरात) घंटे एक घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं: एक और 500 μl बायोटिन जोड़ें.
- फिर सेपीट 6.2 कदम और दो elutions (7 नमूना) गठबंधन. इस अंतिम क्षालन -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
- बायोटिन क्षालन की दक्षता का आकलन करने के लिए, शेष streptavidin मोती स्थिर और फोड़ा एसडीएस नमूना बफर (8 नमूना) (सिफारिशें: LaneMarker 5x कम फिशर से नमूना बफर) में बाद में.
7. प्रोटीन एकाग्रता
- अंतिम प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक (7 नमूना) विश्लेषण करने से पहले कम प्रोटीन एकाग्रता और अपेक्षाकृत उच्च मात्रा की वजह से ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. यह कम आणविक वजन (<5 केडीए) Vivaspin स्पिन कॉलम (Vivascience) का प्रयोग कर प्राप्त कर सकते हैं. उद्देश्य के लिए कम से कम 100 μl मात्रा नीचे ध्यान केंद्रित. इस अंतिम नमूना और उबला हुआ जा सकता है प्रोटीन नमूना बफर में संग्रहीत (सिफारिशों: LaneMarker 5x कम फिशर से नमूना बफर).
8. विश्लेषण
- 1-8 नमूने पश्चिमी धब्बा विश्लेषण नीचे खींचने की दक्षता का निर्धारण किया जा सकता है. नोट: अधिकांश माध्यमिक एंटीबॉडीसंलयन प्रोटीन प्रोटीन जी डोमेन के साथ पार प्रतिक्रिया लेकिन इस TEV protease दरार के बाद हटा दिया जाता है.
- 7 नमूना 1D या 2D एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया जा सकता है. धुंधला हो जाना चांदी या Coomassie (SilverQuest रजत धुंधला और सिफारिशों के कोलाइडयन Invitrogen से ब्लू Coomassie धुंधला किट) का उपयोग किया जा सकता है. प्रोटीन की पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग किया जा सकता है.
9. प्रतिनिधि परिणाम
इस प्रोटोकॉल से अंतिम (7 नमूना) क्षालन नल टैग eIF4E के बंधन भागीदारों की पहचान की 1D एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 में प्रदान की जाती है. इस प्रतिनिधि जेल सेल में अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत eIF4E के जटिल और प्रचुर मात्रा में प्रकृति को दर्शाता है. नकारात्मक नियंत्रण भी चित्रा 2 में दिखाया गया है, एक सेल केवल नल टैग व्यक्त लाइन से उत्पन्न के साथ तुलना, इस पुल के नीचे baited eIF4E की विशिष्टता को दिखाता है. केंद्रित अंतिम क्षालन के इस उदाहरण के 15% में (नमूना7) 1D Invitrogen से Silverquest चांदी धुंधला किट का उपयोग किया जा रहा दाग से पहले का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व डाली ढाल जैल एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया था.
शेष केंद्रित अंतिम क्षालन (7 नमूना) आमतौर पर 50-85% कोलाइडयन Coomassie दाग (Invitrogen) के साथ विश्लेषण किया है. पूरे लेन से नमूने (जेल स्लाइस / बैंड) और फिर निकाले जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया.
पुल से नीचे eIF4E में पहचान प्रोटीन नकारात्मक नियंत्रण के लिए गैर विशिष्ट बंधन भागीदारों की पहचान से बाध्यकारी भागीदारों के खिलाफ फ़िल्टर थे. अंतिम पहचान प्रोटीन नल टैगिंग eIF4E की इस प्रक्रिया का उपयोग कर चित्रा 2, जो इस तकनीक का उपयोग पहचान प्रोटीन की प्रतिनिधि है में देखा जा सकता है. इसके अलावा, eIF3 सब यूनिटों की संख्या भी (नहीं दिखाया डेटा) की पहचान की गई.
आकृति 1. के योजनाबद्धमिलकर आत्मीयता शोधन प्रक्रिया छह कदम मिलकर संबंध शुद्धीकरण प्रोटोकॉल (नल) सेल लाइन पीढ़ी, सेल, खरगोश आईजीजी इम्युनो - तेज़ी agarose, TEV प्रोटीज दरार, streptavidin मनका संबंध शुद्धीकरण और अंत में बायोटिन क्षालन शामिल है.
चित्रा 2. अग्रानुक्रम murine eIF4E प्रोटीन के संबंध शुद्धीकरण एन के भागीदारों बातचीत टर्मिनली टैग नल eIF4E यूकेरियोटिक HEK293 संलग्न प्रोटोकॉल का उपयोग कर कक्षों से शुद्ध किया गया. अंतिम प्रोद्धावन (7 नमूना) के एक 20% अंश एसडीएस पृष्ठ से एक पूर्व डाली 4-12% ढाल जेल (eIF4E - लेन नल) पर विश्लेषण किया गया था. एक बराबर विश्लेषण अकेले टैग (नल लेन) के लिए किया गया था. चांदी धुंधला का उपयोग कर प्रोटीन की पहचान की गई. बाद में एक ही नमूना के मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की प्रोटीन इस जेल पर डाला जाता है.
लघुरूप: eIF4G, यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा चअभिनेता 4 गामा, PABP की, Pólya बंधनकारी प्रोटीन, eIF4A: यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक अल्फा 4, एसबीपी - eIF4e, बाध्यकारी यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4E, शेष नल चारा streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4E इनकार, 4EBPs है युक्त प्रोटीन प्रोटीन, eIF4eNiF1l यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4E परमाणु आयात फैक्टर 1, एसबीपी, TEV unfused नल पेप्टाइड से शेष streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड.
Discussion
नल टैगिंग यहाँ सचित्र तकनीक का यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन चारा के बंधन भागीदारों को अलग करने के लिए एक अत्यंत विशिष्ट और कड़े विधि दर्शाता है. इस दृष्टिकोण दोनों सेलुलर और वायरल प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. हमारे ज्ञान करने के लिए, यह पहली बार एक ऐसी तकनीक अनुवाद दीक्षा कारक eIF4E को लागू किया गया है. ज्ञात eIF4E बंधनकारी प्रोटीन eIF4G और 4EBPs इस तकनीक का उपयोग कर की पहचान इस तरह के एक दृष्टिकोण की वैधता की पुष्टि करता है. इसके अलावा, शेष घटक eIF4F जटिल की पहचान, अर्थात् eIF4A, और PABP के पुष्टि की है कि अप्रत्यक्ष बातचीत और तृतीयक परिसरों शोधन प्रक्रिया के दौरान बरकरार रहेगा. विहित eIF4e बंधनकारी प्रोटीन के कई isoforms की पहचान भी स्पष्ट था. चित्रा 2 में और अधिक विस्तार में वर्णित हैं.
दृष्टिकोण की सीमाओं के साथ संबंध है, कुछ देखभाल के साथ संबंध चुनाव के लिए ले जाया जाना चाहिएचारा प्रोटीन और चाहे या नहीं करने के लिए एन या सी - टर्मिनस पर टैग टैग जगह है. यह उचित हो सकता है एक कार्यात्मक परख करने या संलयन प्रोटीन का स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्ण पैमाने पर शुद्धि के लिए पहले की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें टैग व्युत्पन्न कार्यात्मक है हो सकता है. अभिन्न झिल्ली या परमाणु प्रोटीन जरूरी अपेक्षाकृत हल्के साबुन lysis कदम में वर्णित शर्तों के द्वारा नहीं जारी किया जा सकता है. सभी immunoprecipitations और इसी तरह पुल से नीचे assays के साथ के रूप में, और lysis बफर सेल की क्षमता वृद्धि में प्रकृति और डिटर्जेंट की सांद्रता के रूपांतरण किया जा सकता है. lysis और धोने buffers की ईओण एकाग्रता को बढ़ाने या शुद्धि की तंगी कम करने के लिए संशोधित की जा सकती है. यह भी मानक हल्के शर्तों (ऊपर वर्णित) के तहत प्रारंभिक शुद्धि करने के लिए संभव है, लेकिन बाद में 4-5 aliquots में streptavidin (5.8 अनुभाग) मोती, जो बाद में बढ़ती ईओण चुनाव के तहत धोया जा सकता है विभाजितditions. इस उपयोगकर्ता इष्टतम स्थिति है कि गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत को हटाने की पहचान करने के लिए सक्षम हो सकता है. पूरी प्रक्रिया को भी क्षणिक अभिकर्मक जहां बातचीत भागीदारों में जाना जाता है और उनकी उपस्थिति या अनुपस्थिति के बाद पश्चिमी धब्बा केवल द्वारा निर्धारित का उपयोग किया जा सकता है. इस मामले में हम दो कोशिकाओं प्रत्येक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के 8 μg से के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की 100cm 2 व्यंजन सुझाव देना चाहूँगा. इस संशोधित प्रक्रिया विशेष रूप से उपयोग की है जब नल - संलयन के लिए जाना जाता है बंधन भागीदारों के साथ बातचीत प्रोटीन की उत्परिवर्ती डेरिवेटिव की क्षमता की जांच.
1 चांदी दाग एसडीएस पृष्ठ जैल (या पश्चिमी धब्बा द्वारा अगर एक एंटीबॉडी उपलब्ध है) पर 8 के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण समस्या निवारण का एक शानदार तरीका है, तकनीक के लिए स्वीकार्य परिणाम उत्पन्न विफल करना चाहिए. प्रत्येक संबंध आधारित तेज़ी और विशिष्ट क्षालन की दक्षता इस व्यवस्थित नमूने दृष्टिकोण का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. आठ नमूने OPTIM दौरान लिया जाना चाहिएप्रत्येक नए चारा के लिए प्रोटोकॉल के ization.
नल टैगिंग तकनीक जीएसटी के रूप में अन्य तरीकों पुल चढ़ाव, दो संकर assays के खमीर डबल संबंध शुद्धीकरण और विशिष्ट क्षालन कदम (TEV दरार और बायोटिन क्षालन) के आदि विशिष्टता और कठोरता प्रदान करने के लिए एक पर बनाए रखा जा करने के लिए एक शक्तिशाली और मजबूत विकल्प प्रदान करता है शोधन प्रक्रिया के दौरान उच्च स्तर है. गंभीर किसी भी प्रोटीन के लिए इस तकनीक को लागू किया जा सकता है और इसलिए ब्याज की एक प्रोटीन लक्ष्य के लिए बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए एक शानदार तरीका का प्रतिनिधित्व करता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध वेलकम ट्रस्ट वरिष्ठ डॉ. इयान गूड के लिए सम्मानित किया गया फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 | |
| Rabbit IgG Agarose | Sigma-Aldrich | A2909 | |
| AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce, Thermo Scientific | 53116 | |
| Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 | |
| SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| Microcapillary pipette tips | VWR international | 37001-150 | |
| NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX | |
| CdCl2 | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| 5x SDS Sample Buffer | Fisher Scientific | PN39000 |
References
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