Summary
De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren een
Abstract
De zoogdieren binnenoor heeft 6 verschillende sensorische epitheel: 3 cristae in de ampullen van de halfcirkelvormige kanalen, maculae in de utricle en sacculus, en het orgaan van Corti in de opgerolde slakkenhuis. De cristae en maculae bevatten vestibulaire haarcellen die transduceren mechanische stimuli om de speciale gevoel van evenwicht dienstig zijn, terwijl de auditieve haarcellen in het orgaan van Corti zijn de primaire transducers voor het horen van 1. Lot van de cel specificatie in deze sensorische epitheel en morfogenese van de halfcirkelvormige kanalen en het slakkenhuis vindt plaats tijdens de tweede week van de zwangerschap in de muis en zijn grotendeels voltooid voor de geboorte 2,3. Ontwikkelings-studies van de muis binnenoor worden routinematig uitgevoerd door het oogsten van transgene embryo's op verschillende embryonale of postnatale fase inzicht te krijgen in de moleculaire basis van cellulaire en / of morfologische fenotypes 4,5. Onze hypothese is dat genoverdracht naar de ontwikkelingslanden muis binnenoor in de baarmoeder </ Em> in het kader van de winst-en verlies-van-functie studies is een gratis benadering van de traditionele muis transgenese voor de ondervraging van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdieren binnenoor ontwikkeling 6.
De experimentele paradigma om gen-misexpression studies uit te voeren in de ontwikkelingslanden muis binnenoor aangetoond hier is opgelost in drie algemene stappen: 1) ventrale laparotomie, 2) transuterine micro-injectie, en 3) in vivo elektroporatie. Ventrale laparotomie is een muis te overleven chirurgische techniek die uitbesteding van de baarmoeder toelaat te krijgen experimentele toegang tot de geïmplanteerde embryo's 7. Transuterine micro-injectie is het gebruik van schuine, glazen capillaire micropipetten tot expressie plasmide in het lumen van het otic blaasje of otocyst te introduceren. In vivo elektroporatie is de toepassing van blokgolf, gelijkstroom pulsen om de expressie plasmide rijden progenitorcellen 8-10.
11. Muis experimentele embryologische technieken kan het moeilijk zijn om te leren van proza en foto's alleen. In dit werk, tonen we de 3 stappen in de genoverdracht procedure. De meeste kritisch, zetten we digitale video-microscopie om precies te laten zien hoe je: 1) het identificeren embryo oriëntatie in de baarmoeder; 2) embryo's te heroriënteren voor het richten van injecties langs de otocyst; 3) microinject DNA gemengd met kleurstof tracer oplossing in de otocyst op embryonale dag 11.5 en 12,5; 4) electroporate de ingespoten otocyst, en 5) label geëlektroporeerd embryo's voor postnatale selectie bij de geboorte. Wij bieden representatieve voorbeelden van succesvol getransfecteerd innerlijke oren, een geïllustreerde gids voor de meest voorkomende oorzaken van otocyst mistargeting, bespreken hoe de gemeenschappelijke methodologische fouten te vermijden, en de huidige richtlijnen voor het schrijven van een in de baarmoeder gENE overdracht verzorging van dieren protocol.
Protocol
1. Ventrale Laparotomie
- Verdoof een dam die als embryo in embryonale dag 11,5 (E11.5; uur op de dag een vaginale plug wordt gedetecteerd is dag 0.5 van de embryonale ontwikkeling) door intraperitoneale injectie van natrium-pentobarbital anestheticum (7,5 ul per gram lichaamsgewicht). Werken anestheticum: 180 pi van 50 mg / ml natriumpentobarbital oplossing, 100 pi absolute ethanol 320 pi van 65 mg / ml waterige magnesiumsulfaat (moduleert uterine toon) en 400 ul propyleenglycol (voertuig mengbaar met waterige en organische componenten).
- Beoordeel de volledigheid van de anesthesie door het uitvoeren van schadelijke stimuli tests: poot squeeze, staart knijpen, en knipperen antwoord op de wang en vibrissae touch. Breng een steriel oogzalf aan de hoornvliezen.
- Scheer de buik vacht van de suprapubische gebied om de ribbenkast met een schaar en een boete mes (Oster # 40 blad). Desinfecteren de buik met 70% ethanol, 10% povidonjood (Betadine), eennd 70% ethanol, na elkaar. Plaats de muis buik naar beneden op een steriel laken en vervolgens op een verwarmingselement of een warm bord (37 ° C) gedurende 2-5 minuten.
- Incisie de buikhuid in de ventrale middellijn met de bal-tip schaar. Verleng de incisie van 10-14 mm. Identificeer de linea alba, een avasculaire, wit bindweefsel band langs de ventrale middellijn van de buikwand. Incisie de linea alba met bal getipt schaar en uitbreiding van de incisie 10-14 mm. Onmiddellijk spoelen van de buik met voorverwarmde (37 ° C) Ringer's lactaat-oplossing.
- Externaliseren van de twee horens van de baarmoeder met ring pincet zonder te veel druk op de implantatie sites. Spoel de geëxternaliseerde baarmoederhoorns met voorverwarmde, lactaat Ringer's.
2. Micro-injectie Transuterine
- Vervaardig een dikwandige, borosilicaatglas capillaire micro-injectie pipet met de volgende kenmerken: 12-16 μm diameter en een 20 graden schuine kant. Op een Sutter P-97-pipet trekker met kleine doos filament, gebruikt u de volgende programma: warmte = helling-test plus 3 eenheden; druk = 200; trekken = 0; snelheid = 46; tijd = 100). Met de Sutter BV-10 beveler, gebruik maken van de 104C (goud) schuur schijf voor een grote diameter pipetten. Hersuspenderen expressieplasmide van 3-4 ng / ul in kalkvrij fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,2-7,4). Voeg kristallijne snel groen naar de geconcentreerde DNA, vortex gedurende 30 seconden voorzichtig, en draaien op 10.000 g gedurende 10 seconden. De minimale hoeveelheid snel groene nodig visueel volgen de werkzaamheid van de injectie wordt empirisch bepaald. Plantgat de schuine pipet met het DNA / snel groene oplossing. Sluit de geladen micro-injectie pipet om de pipet houder van de druk injector (Picospritzer met behulp van> 99% zuivere stikstof als bron gas).
- Transilluminate de baarmoeder met een lage intensiteit, halogeen licht om de embryo in de plaats van implantatie te visualiseren. Identificeer de beaTing hart, hersenen blaasjes, ledematen, ontluikende 4 e ventrikel van de achterhersenen, en in het oog. Spoel de baarmoeder om de 2 minuten met voorverwarmde, Ringer-Lactaat oplossing voor hydratatie te behouden. Pas lichte druk op de baarmoeder het embryo te heroriënteren en identificeren van de anatomische oriëntatiepunten zoals hierboven vermeld.
- Orient het embryo naar de primaire hoofd ader die anterieure en posterieure takken flank van de mesenchymale grondgebied waarop de otocyst woont te identificeren. De otocyst juiste kan niet gezien worden door transilluminatie van de baarmoeder. De otocyst ligt halverwege tussen de voorste en achterste takken van de schoolleiders in het primair ader, die samen met de belangrijkste stam van de ader, vormen de vorm van de staanders of doelpalen op een American football veld. De otocyst houdt het midden tussen de staanders.
- Plaats de injectie pipet door de baarmoeder in een traject in lijn met de vermoedelijke locatie van de otocyst. Een keer Pulse de microinjector na het passeren van de Uterons naar de tracer kleurstof en de onderlinge aanpassing van de locatie van de pipetpunt te visualiseren. Advance de pipet onder micrometer controle en pulseren weer de diepte te beoordelen. Verder is de pipet herhaaldelijk vooruit in de laterale kop mesenchym en pols. Succesvolle otocyst targeting zal onthullen de conische vorm van de endolymfatische kanaal dorsaal en de schelp-vorm van de vestibule. Laat de druk op de baarmoeder, de pipet uit het embryo / de baarmoeder in een beweging, en meteen de baarmoeder spoelen met een voorverwarmde, Ringer-oplossing.
3. In vivo elektroporatie
- Spoel de baarmoeder met Ringer's lactaat. Vers aangebrachte lactaatbevattende Ringer-oplossing nodig is om elektrisch koppelen van de paddle-style elektroden naar de baarmoeder. Bevochtigen wolfraam oppervlakken van de elektroden met Ringerlactaat. Center de geïnjecteerde otocyst in de baan van de elektroden. Voorzichtig te comprimeren de baarmoeder met de elektroporatie paddles. De kathode in contact met de uteruswand dwars op de geïnjecteerde otocyst en de anode in aanraking met de uteruswand naast de geïnjecteerde otocyst. Activeer een blokgolf trein met het voetpedaal schakelaar op de electroporator. Elektroporatie parameters zijn: 5, 50 msec pulsen op 43 volt per impuls en een 950 msec interpuls vertraging. Onmiddellijk spoelen de baarmoeder na de puls trein wordt geleverd. Noteer de stroom geleverd aan het weefsel: 60-100 mAmps is voldoende om otic epitheliale voorlopercellen transfecteren. Injecteer en electroporate 4-6, E11.5 embryo's per dam.
- Voer een tweede onafhankelijke transuterine microinjectie waterige fluorescerende dextran (Alexa Fluor 488 als de expressie plasmide codeert voor een rood fluorescent eiwit of Alex Fluor 594 als de expressie plasmide codeert voor een groen fluorescent eiwit) in de 4e ventrikel van de embryo's die binnen oren nauwkeurig geïnjecteerd en ten minste 60 mAmps van stroom per puls was deovergegeven tijdens elektroporatie. De fluorescerende dextran zal detecteerbaar zijn bij de geboorte in de achterhersenen en maken de selectie van pups waarvan de innerlijke oren waren gemanipuleerd tijdens de embryogenese (zie 3.5).
- Spoel de baarmoederhoorns met Ringer's lactaat. Plaats de baarmoederhoorns in de buikholte. Spoel de baarmoederholte met 2-4 ml voorverwarmde, lactaat Ringer's en laat de overloop uit de afvoer van de incisie op het steriele laken. Vervang de draperen met droge, steriele materiaal. Hecht de buikwand met een niet-snijdende naald en een 6-0 resorbeerbaar hechtdraad. Wij geven de voorkeur een lopende steek, blokkeren elke andere steek, voor zowel de buikwand en de huid.
- Droog de dammen 'bont en het beheer van een niet-steroïdale anti-inflammatoire, zoals Meloxicam via subcutane injectie. Zet de moeder van de voorverwarmde herstel kooi op een steriel laken. Controleren en vastleggen van de dammen 'ademhaling, incisie doorgankelijkheid, en de vagina voor de bloederige afscheiding. Bloeding is raopnieuw, maar indien aanwezig en onverminderd door, euthanaseren de dam, terwijl ze nog onder narcose. Let op de tijd dat ze terug bij bewustzijn en pogingen om ambulate. Zet de dam om de muis te kolonie toen ze tekenen van eten en drinken en is begonnen met nest te bouwen. Meestal gebeurt dit binnen 12 uur.
- Bij de geboorte (postnatale dag 0), flitser van de achterhersenen gebied van elke pup in het nest om de tl-dextran met een stereofluorescence stereomicroscoop met een GFP of Texas Red-filter te detecteren, wordt voldaan. Terug naar de zogende moeder alleen die pups die achterhersenen etikettering weer te geven.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1. Elektroporatie-gemedieerde genoverdracht ontwikkeling slakkenhuis. De E11.5 otocyst werd geïnjecteerd met een expressieplasmide dat codeert versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en geëlektroporeerd (puls train de parameters: vijf, 43 volt pulsen op 50 msec / puls en 950 msec interpuls vertraging). A) Een vertegenwoordiger binnenoor van een postnatale dag 6 (P6) pup die otocyst werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd op E11.5 demonstreren EGFP expressie van de basis door het midden begin van het slakkenhuis. De zijwand van het slakkenhuis werd uit het midden turn en apex alleen. E11.5 voorlopercellen die aanleiding geven tot de top niet getransfecteerd. B) Het hele mount immunokleuring van het slakkenhuis in (A) met de haarcel marker, myosine 7a (Myo7a), geeft aan dat EGFP expressie volgt het traject van het orgaan van Corti en is schromelijk gelokaliseerd om het haar cel-dragende sensorische epitheel. C) Een vertegenwoordiger binnenoor van een E18.5 embryo waarvan otocyst werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd op E11.5. De laser confocale projectie toont EGFP expressie in Myo7a-positieve haarcellen. D) Laser confocale projectie van het cochleair sensorische epitheel van de E18.5 orgaan van Corti met vermelding van EGFP expression in de binnenste haarcellen (IHC), buitenste haarcellen (OHC), innerlijke phalangial cellen (IPC), pijler cellen (pc), en Deiters 'cellen (DC). De schaalstaaf in (B) geldt (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gene transfer naar de ontwikkeling van de muis binnenoor: De muis binnenoor ontwikkelt zich vanaf de otic placode tijdens de eerste week van postimplantatie ontwikkeling 12,13. Door embryonale dag 9.5 (E9.5), heeft de placode geïnvagineerde en veranderd in een met vloeistof gevulde blaasjes genoemd otocyst 2. Otic voorlopers in het blaasje aanleiding geven tot de zintuiglijke en nonsensory cellen in het volwassen binnenoor en de neuronen die mechanisch gevoelige haarcellen innerveren in de vestibulaire en auditieve zintuiglijke epitheel. Tegen het einde van embryonale stadia, wordt het complex, 3-dimensionale morfologie van het membraneuze labyrint van het binnenoor opgericht 3,12. Winst-en verlies-van-functie experimentele modaliteiten worden doorgaans uitgevoerd door de muis transgenese om inzicht te krijgen in de genetische regulatie van ontwikkelingsprocessen, zoals lot van de cel specificatie en patroonvorming. Dynamische genetische manipulatie van de ontwikkeling van de muis in het binnenoorutero is een gratis benadering van de muis transgenese dat paren genoverdracht technieken met de muis experimentele embryologie 6,11.
Virus-en elektroporatie-gemedieerde genoverdracht technieken ontwikkeld om genexpressie te manipuleren in ontwikkelingslanden binnenoor 6,11,14,15. Adeno-geassocieerde virus (AAV) vector infecteren otic voorlopercellen die aanleiding geven tot sensorische nonsensory celtypes en zijn gebruikt om de moleculaire basis van calcium-afhankelijke exocytose in muizen haarcellen 16 ondervragen. AAV-vectoren van hoge titers dat een brede expressie mogelijk maakt in het binnenoor en de verschillende virale serotypen weer te geven unieke tropisme dat kan voordelig zijn voor differentiële cellulaire expressie. Nadelen zijn een vaste vulling capaciteit die de grootte van het gen kan worden misexpressed de vereiste kennis virologische maken, zuiveren en titer de virussen beperkt. Elektroporatie-gemedieerde gen transfer is gebruikt om de rol van een basic helix-loop-helix transcriptiefactor te evalueren in het specificeren van zintuiglijke haar lot van de cel in vivo 6. Expressieplasmiden aangepast Gateway subklonering technologie kan snel en efficiënt constructie van vectoren met unieke promoters besturen expressie van een gen van belang en een fluorescerende merker eiwit van een IRES sequentie 17. Genen van belang kan worden uitgedrukt in otic voorlopers binnen de 24 uur van elektroporatie en expressie kan blijven bestaan in de postnatale binnenoor afhankelijk van de gebruikte promotor. Plasmide bouw, zuivering, concentratie, en kwantificering vereisen slechts standaard moleculair-biologische vaardigheden. Nadelen zijn een lagere in vivo transfectie-efficiëntie als plasmide wordt groter dan 8kb ~ en een hogere mate van embryonale letaliteit vergelijking met de meeste virale vectoren. Zowel elektroporatie-en virus-gemedieerde genoverdracht technieken vereisen beheersing van de muis experimentele embryologische techtechnieken: overleven chirurgie, in utero manipulatie van embryo's en transuterine micro-injectie. Het doel van dit manuscript is om het laatste probleem aan te pakken door aan te tonen elke kritische methodologische stap voor digitale video-microscopie.
Methodologische toelichting op de video: We hebben er bewust voor gekozen niet de incisie website draperen met steriel veld tijdens het filmen, zodat de kijker kan de positie van de ventrale middellijn in relatie te zien aan de anatomie van de dam, dat wil zeggen, het hoofd (met opzet vaag in de meeste frames, maar herkenbare), ledematen en staart. Draperen de incisieplaats effectief blokkeert dit standpunt en kan verwarren inspanningen om ruimtelijk relevante anatomische relaties waarderen tijdens de ventrale laparotomie en een injectie volgorde. Toch raden wij draperen de buik van de dam, zodat de geëxternaliseerde baarmoederhoorns rusten op een steriel veld om chirurgische asepsis te behouden. Daarnaast hebben we bewust geen poging om demonenconcentreren hechten van de chirurgische incisies in de buikwand en de huid, omdat deze methoden moeten worden geleerd door de deskundige begeleiding van een dierenarts of een bevoegde chirurgische technicus. Dr Marcel I. Perret-Gentil (Universiteit van Texas in San Antonio), presenteert een uitstekende bespreking van dit onderwerp, compleet met illustraties voorkomen, in zijn hand-out, "Principles of Veterinary hechten." 18
Procedurele aanbevelingen: Gene transfer naar de ontwikkeling van de muis binnenoor is technisch uitdagend. Er zijn een aantal best practices die een aanzienlijke hoeveelheid variabiliteit een einde zal maken en zorgen voor succesvolle resultaten. Wij maken specifieke aanbevelingen hieronder om het leren deze experimentele aanpak.
Neem contact op veterinair personeel om de muis te overleven operatie verzorging van dieren protocol te ontwikkelen: de verzorging van dieren protocol voor zoogdieren overleven operatie vraagt om te produceren, omdatanesthesie, analgesie, en peri-operatieve zorg moet worden gedefinieerd en gecoördineerd. Een gedetailleerde bespreking van dierverzorging protocol ontwikkeling, met inbegrip taal die de kern van het protocol van een aanvrager kunnen vormen, wordt verstrekt als aanvullende informatie (zie " Animal Care Protocol Development "). Daarnaast zal uw huis instellingen Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en veterinair personeel ongetwijfeld zorgen voor extra begeleiding bij het formuleren van een geschikt protocol op aanvraag.
Opzetten van een speciale muis overleven operatie gebied voor in de baarmoeder genoverdracht: Ventraal laparotomie is een geklasseerd als een grote operatie, omdat het gevaar brengt een lichaamsholte. De meeste IACUCs zal niet nodig een steriele, klasse 100 omgeving voor grote muis te overleven operatie. Integendeel, een speciale gebied dat onder goede verlichting, ventining, aanvullende verwarming, en hard, zullen niet-poreuze en te desinfecteren oppervlakken vertonen die nodig zijn. Wij geven de voorkeur om te overleven een operatie uit te voeren in een horizontale laminaire stroming kap die de muis beschermt tegen infecties, vermindert de fysiologische stress, en daarmee faciliteiten postoperatief herstel. We hebben bepaald een reeks van op maat wijzigingen aan een oscillatie-gedempte, horizontale laminaire stroming kap (Envirco LF 630) dat directionele, laag wattage halogeen verlichting spoor op te nemen; uitgebreide elektrische circuits aan de macht genoverdracht apparatuur, en verzonken stopcontacten met bank boven uitsparingen voor doorgang koord. Een gedetailleerd schema van deze wijzigingen wordt verstrekt als aanvullende informatie (zie " Laminar Flow Hood In Utero Gene Transfer "). Raadpleeg uw IACUC als je de ontwikkeling van uw dier zorgprotocol naar een geschikte locatie die uitsluitend is gewijd aan de muis zo te definiërenrvival chirurgie.
Weeg de dam tot op 0,1 gram vóór de toediening van natrium-pentobarbital anesthesie: Natrium pentobarbital is een effectieve verdoving en zal ten minste 105 minuten van de arbeidstijd bij de aanbevolen doseringsschema wordt gevolgd. Bepaal een juiste lichaamsgewicht voor elke dam voor het berekenen van de dosis van het verdovingsmiddel mengsel om te injecteren. Nooit schatten dam lichaamsgewicht. Gebruik de Anti Spuit lade naald en spuit van Becton Dikison: de menselijke intradermale schuine is ideaal voor atraumatische intraperitoneale injecties in zwangere muizen. Bovendien heeft deze spuit heeft een extreem laag dode ruimte volume en is gekalibreerd voor het bereik van de narcose volumes dat normaliter nodig is voor dammen die als embryo in E11.5 of E12.5.
Implementeer profylactische analgesie om embryonale overleving te ondersteunen: Dien een plaatselijke verdoving op de hechting, zoalsBupivicaine, en een systemische, niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, zoals Meloxicam, voorafgaand aan het plaatsen van de dam in het herstel kooi, zodat pijnstillers aan boord zijn tegen de tijd dat de dam herstelt van anesthesie. Vermindering van ongemak in de dam vergemakkelijkt postoperatief herstel en behoud van een gezonde zwangerschap.
Bevel van de micro-injectie pipetten en strak belemmerend werken voor de buitendiameter: De meest voorkomende oorzaak van embryonale letaliteit is weefsel en / of vasculaire schade als gevolg van slecht gebouwde micro-injectie pipetten. Transuterine micro-injectie in de E11.5 muis otocyst draagt verschillende beperkingen dan een injectie in een grotere organen bij oudere embryo's (dat wil zeggen, de hersenen blaasjes, oog, ledematen, enz.). Unbeveled, slecht afgeschuind, of ongepast grote buitendiameter pipetten zal bloeden van schepen in de baarmoeder, de viscerale dooierzak vaatstelsel, en / of het embryo op E11.5, die embryonale overleving zal afnemen. Het is mogelijkaan handrem duurzame pipetten kleine diameter dat een passende afschuining dragen, maar het is moeilijk te routinematig doen. De E11.5 muis embryo, waarvan de kleine otocyst het doelwit is, zal zijn meedogenloos. Raadpleeg de P-1000 P-97 Pipetteer kookboek 2011 van Sutter Instrumenten voor een volledige verhandeling over pipet ontwerp en fabricage 19. Parameters voor de pipetten in dit werk gezegd en fabricage is volledig eerder 11 beschreven. De procedurele aanwijzingen in de handleiding voor de Sutter Instruments BV-10 beveler zijn ook een uitstekend middel.
Begrijpen waarom mistargeting de otocyst door transuterine micro-injectie plaatsvindt: De video is de ideale uitkomst voor transuterine micro-injectie in de E11.5 en E12.5 otocyst. Mistargeting de otocyst meestal het gevolg is van het injecteren van te oppervlakkig, te diep, of van onvoldoende verzonnen pipetten. Figuur 2 toont deze voorwaarden. PaneelA toont een zijaanzicht van de linkerkant van een E12.5 embryo afgebeeld door transilluminatie na succesvolle transuterine microinjectie snelle groene oplossing in het otocyst. De achterhersenen (HB) verschijnt als een wigvormige inkeping dorsaal van de otocyst. Het oog (e) heeft een ring van pigment langs de omtrek en de linker voorpoot op de voorgrond. De belangrijkste stam van de schoolleiders in het primair ader (PHV) is net onder de otocyst. De otocyst is gevuld met een snelle groen is, wat zwart is: de rug-, endolymfatische kanaal (ed) en het voorportaal van de otocyst (oc) zijn te onderscheiden. Succesvolle targeting van de E11.5-12.5 otocyst zal altijd vormen een duidelijk te onderscheiden endolymfatische buis en vestibule. Panel A 'toont hetzelfde beeld als in A, zonder de witte etikettering kritische beschouwing van de geïnjecteerde otocyst te vergemakkelijken.
Figuur 2. Een geïllustreerde gids tot mistargeting de otocyst door transuterine microinjecTION. Alle panelen tonen de linker zijaanzicht van een E12.5 embryo middenhersenen en de voorhersenen links behalve Panel H, een dorsaal aanzicht van de achterhersenen-middenhersenen gebied. Panelen in elke rij vertegenwoordigen beelden van hetzelfde embryo. Zie de discussie voor een gedetailleerde uitleg van de oorzaken van otocyst mistargeting. Afkortingen: e, linkeroog, ed., endolymfatische kanaal; fg, snel groen, hb, achterhersenen, pond, de lichamelijke integriteit knop, oc, otocyst, ot, otic grondgebied; p, pipet, PHV, schoolleiders in het primair ader, pt, pipetpunt.
Oppervlakkige injectie is een veel voorkomende oorzaak van mistargeting. Panelen tonen een oppervlakkige injectie in de E12.5 foetus. De achterhersenen (HB) inkeping en de otic grondgebied (OT, cirkel) zijn duidelijk in deze links, zijaanzicht. De micro-injectie pipet (p) op de voorgrond. Fast Green (fg) begint te verwijderen uit de pipet (B), en met latere pulsen van de druk injector (CD), de kleurstof diffundeert in een ovale vorm. De verdeling van the kleurstof suggereert dat het werd ingevoerd tussen de baarmoederwand en de viscerale dooierzak, een membraan dat de extra-embryonale exocoelomic holte omhult. De experimentator moet niet proberen opnieuw te richten op de otocyst in dit embryo, maar moet op naar de volgende embryo. Meerdere injecties correleren met een verminderde embryonale overleving, een effect dat is meer acuut op E11.5 dan E12.5.
Injectie in de diepe is een meer voorkomende oorzaak van mistargeting. Panelen FH tonen een injectie traject dat door het otic gebied in de achterhersenen. De primaire kop ader (PHV) linkeroog (e) en pipet (p) zijn duidelijk in dit zijaanzicht van een E12.5 embryo. De eerste uitwerpen van een snelle groen (fg) wordt dorsaal verplaatst ten opzichte van de schoolleiders in het primair ader / otic grondgebied. Met verdere pulsen is de wigvormige achterhersenen (h) geheel gevuld met snelle groen (G paneel). Een 90 graden rotatie van de geïnjecteerde embryo maakt de ontdekking van een snelle groen binnen de hindbrain de holte van het ruggedeelte weergave (panel H). Zowel oppervlakkig en diep injecties gevolg van het onvermogen om de diepte van de micro-injectie pipet zien na het contact met de baarmoeder. Een praktische aanpak die goed werkt is om de pipet te verbeteren door de baarmoeder en dan meteen een keer pulseren op zoek naar een trekje van snelle groen: de locatie van het bladerdeeg geeft de globale positie van de pipet tip. Stel diepte op basis van deze verkennende pols.
Onvoldoende gefabriceerd pipetten zijn de meest voorkomende oorzaak van mistargeting. De injectie poging getoond in Panels IK werd uitgevoerd met een pipet tip die handmatig gebroken was, maar niet afgeschuind. De zijaanzicht van de E12.5 embryo toont achterhersenen (h), linkeroog (e) en de microinjectie pipet (p). Merk op dat de pipetpunt (pt) is sterk gebogen en niet heeft voldaan aan de baarmoeder binnen te dringen (panel I). De toepassing van extra kracht schaar het puntje van de pipet (Panel J, pijl), het verlaten van de pipette tip ingebed in de baarmoeder. Een kleine hoeveelheid van een snelle groen (fg) werd uitgeworpen uit de gebroken pipet en heeft gezien de oppervlakte van de baarmoeder. De ingebouwde pipetpunt (Panel K) moet worden verwijderd met fijne, steriele pincet en weggegooid als scherpe voorwerpen afval. Als de pipetpunt niet kan worden gevonden of met succes verwijderd, euthanaseren de dam onder narcose.
Document procedurele opmerkingen over een muis te overleven operatie productbeschrijving: Een cruciaal element is om het leren van deze methoden is om opmerkingen te documenteren en aanpassingen op basis van deze opmerkingen te maken. Maak een muis te overleven operatie informatieblad en noteer preoperatieve, operatieve en postoperatieve informatie. Preoperatieve gegevens omvatten dam gewicht, de dosis verdoving geleverd, plasmide ingespoten, etc. Operatieve gegevens omvatten het embryo geïnjecteerd (dat wil zeggen, R2 is de tweede embryo uit de eierstok in de rechter baarmoeder hoorn), de kwaliteit van de injectie (dat wil zeggen, geen endolymfatische duct gedetecteerd kleurstof in 4
Gebruik stroom geleverd per puls naar transfectie-efficiëntie te optimaliseren: De blokgolf trein bestaat uit 5, 43volt, 50msec pulsen met een 950msec onderpulsvertraging. De 5mm platina, paddle stijl elektroden ervoor te zorgen dat het hele otic grondgebied is opgenomen in het elektrisch veld. Soortgelijke transfectie efficiëntie kan worden bereikt met 3 mm schoepen, maar zijn ze moeilijk nauwkeurig positioneren. De puls paradigma werd geoptimaliseerd door de evaluatie van de huidige overgebracht naar het embryo tijdens de laatste puls, niet door vegen door middel van spanningen en het beoordelen van transfectie-efficiëntie. De reden is dat de stroom geleverd per puls is bij constante spanning afhankelijk vrijhouden van elektrische koppeling tussen de uterus en de platina elektroden. Ervan uitgaande dat de baarmoeder vers wordt geïrrigeerd met Ringer's lactaat onmiddellijk voorafgaand aan het plaatsen van de paddles en ladingsdragers in overmaat aanwezig is, de belangrijkste variabele is de hoeveelheid "koppeling" druk uitgeoefend op de baarmoeder met de peddels. Zachte druk op 43volts resulteert in <60mAmps van stroom geleverd en sporadische transfectie op zijn best. Matige druk op 43volts resultaten 60 100mAmps geleverd en de meest efficiënte transfectie. Zware druk op 43volts resulteert in> 100mAmps geleverd en correleert met aanhoudende veranderde hartslag en verhoogde embryonale letaliteit. Overmatige druk scheurt de viscerale dooierzak (een "pop" kan worden gevoeld door middel van de paddles) en veroorzaakt embryonale letaliteit. Het is waarschijnlijk dat de toegepaste variabele druk van de impedantie tussen de elektroden die geleverde stroom beïnvloedt verandert. De pulsfrequentie van 1Hz (een 50 msec puls per seconde) werd gedefinieerd als de minst storend cardiale het embryo cyclus, die een positieve correlatie voor embryonale overleving. We concluderen dat de meest cruciale parameter om toezicht te houden bij het vaststellen van een efficiënte in-vivo elektroporatie paradigma is de stroom geleverd per puls. Wijziging van een puls paradigma moet ook een zorgvuldige controle van de stroom geleverd per puls.
Adopteer een modulaire benadering van het leren ee techniek: Module 1: Oefen een schijnvertoning chirurgie met baarmoeder uitbesteding, maar niet of electroporate injecteren. Dams tolereren ventrale laparotomie zeer goed en mag nooit ervaren postsurgical complicaties met betrekking tot chirurgische techniek. Muis survival chirurgische vaardigheden zijn ongetwijfeld woonachtig zijn in de eigen instelling na te streven, zodat een adequate opleiding. Bereik beheersing van chirurgische vaardigheden voordat u verder gaat. Module 2: Praktijk transuterine micro-injectie in de otocyst op een verdoofd dam, zonder de verwachting van de voltooiing van het voortbestaan chirurgie: euthanaseren de dam onder narcose, de oorzaak van het geïnjecteerde embryo's, en evalueren de kwaliteit van de otocyst injecties. Module 3: Target slechts 2 otocysts in 2 verschillende embryo's met snelle groen, niet electroporate, vul dan de operatie, en valideren stroomafwaarts embryonale overleving. Module 4: Target slechts 2 embryo's met DNA / snel groene oplossing, electroporate, te valideren stroomafwaarts embryonale overleving, en gaat na de transfectie efficiency. Module 5: Target slechts 2 embryo's met DNA / snel groene oplossing, electroporate, injecteren Alexa Fluor in de 4 e ventrikel naar de gemanipuleerde embryo te labelen, selecteert u het label embryo's op P0, en gaat na de transfectie-efficiëntie.
Procedurele leercurve: beheersing van de muis te overleven chirurgische technieken, met de nodige begeleiding van de veterinaire en de chirurgische staf van zijn eigen instelling, is behoorlijk snel en vereist alleen 3-5 dammen-waarde van de praktijk voor de beginnende tot de expertise te krijgen. Transuterine micro-injectie en in vivo elektroporatie om nuttig getransfecteerd innerlijke oren te genereren zal 10-50 dammen-waarde van inspanning, in de veronderstelling zijn er 6 werkbare embryo's per zwangerschap en de modulaire aanpak wordt gevolgd. De studenten die genieten van activiteiten die de fijne motoriek nodig (dat wil zeggen, het spelen van een muziekinstrument, naaien, modelbouw, of concurrerende atletiek) hebben een kortere stages dan those dat niet doen. De kritische correlaten voor een succesvolle beheersing van deze methoden zijn nauwgezette aandacht voor detail (dat wil zeggen, micro-injectie pipet fabricage, vasculaire anatomie, expliciete aantekeningen maken) en een redelijk kalme houding.
Workflow: Zodra expertise wordt opgedaan, kan men anticiperen op injecteren en electroporating 4-6 embryo's per dam, 3-5 embryo's zullen overleven; en 2-4 embryo's zal een nuttige hebben getransfecteerd innerlijke oren voor analyse. De achterhersenen Alexa Fluor etikettering techniek om embryo's label voor het sorteren van bij de geboorte moet de extra achterhersenen injectie in elk geëlektroporeerde embryo, maar dit wordt goed verdragen en heeft geen nadelige invloed efficiëntie van de procedures. Zo is de opbrengst van een nuttige getransfecteerd innerlijke oren van in vivo elektroporatie steekt gunstig af bij de opbrengst van homozygote mutante muizen uit een heterogygous fokkerij paradigma. Met ervaring, 2-3 dammen per onderzoeker per dag is een redelijke werkflow: 1,5 uur per dam voor een operatie en een totaal van 1,5-2 uur voor post-operatieve monitoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Humana Press om toestemming om de micro-injectie pipet fabricage cijfer dat oorspronkelijk verscheen op pagina 130 van referentie 11 te publiceren; Larry Dlugas en Steven Wong, OHSU Department of Educational Communications, voor videografie, Larry Dlugas voor video-ontwerp en-bewerking; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco voor het ontwerpen van onze op maat horizontale laminaire stroming kap en Les Goldsmith voor het verstrekken van de technische schema, Victor Monterroso, MV, MS, PhD en Tom Chatkupt, DVM, OHSU Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde, voor informatie met onze verzorging van dieren protocol, chirurgische technieken, en profylactische analgesie regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, voor het delen van zijn hand-out inzake veterinaire hechten technieken; Edward Porsov, MS, voor het ontwerpen van onze Adobe Premiere Pro video-microscopie computerwerkplek, en Leah Wit en Jonas Hinckley van LNS Captioning (Portland, OR). Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Doofheid en Other Communicatie aandoeningen: DC R01 008595 en DC R01 008595-04S2 (naar JB) en P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
