Summary
Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir tanımlamak
Abstract
; Kesecik ve kesecik içinde makulaları ve kıvrılmış kokleadaki Corti organı semisirküler kanalların ampullae 3 krista: memelilerin iç kulağının 6 farklı duyusal epitel vardır. Krista ve makulaları Corti organı işitsel saç hücreleri 1 işitme için birincil dönüştürücüler ise mekanik uyarıcılar, denge, özel anlamda hizmet etmek için transdüksiyonu vestibüler saç hücreleri içerir. Semisirküler kanallar ve koklea bu duyusal epitel ve morfonogenezi Hücre kaderi şartname fare gebeliğin ikinci haftasında gerçekleşecek ve büyük ölçüde doğumdan 2,3 önce tamamlanır. Fare iç kulak gelişim çalışmaları rutin hücresel ve / veya morfolojik fenotipleri 4,5 moleküler temelini anlamak için farklı embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında transgenik embriyolar hasat tarafından yürütülmektedir. Biz utero gelişmekte fare iç kulak veren gen transferi hipotez </ Em> kazanç ve kayıp fonksiyon-çalışmaları bağlamında memelilerin iç kulağının gelişimi 6 altında yatan genetik mekanizmalar sorgulama için geleneksel fare transgenesis için ücretsiz bir yaklaşımı temsil ediyor.
Ventral laparatomi) 1, 2) transuterine mikroenjeksiyon; ve in vivo elektroporasyon 3): Gelişmekte olan fare iç kulağa gen misexpression çalışmalar yapmak, deneysel paradigma burada gösterdiği üç genel adım içine giderir. Ventral laparotomi implante embriyo 7 deneysel erişmek için rahim dışsallaştırılmasını izin veren bir fare hayatta bir cerrahi tekniktir. Transuterine mikroenjeksiyon otik vezikül veya otocyst lümenine plazmid ifade tanıtmak Eğimli, cam kılcal mikropipetler kullanılmasıdır. Vivo elektroporasyon progenitör hücreler 8-10 içine plazmid ifade sürmek için kare dalga, akım darbeleri uygulamasıdır.
11 her adımla ilgili ayrıntılı notlar yer. Fare deneysel embriyolojik teknikleri nesir öğrenmek ve hareketsiz görüntüleri tek başına zor olabilir. Bu çalışmada, biz gen transferi prosedürü 3 adım göstermektedir. En önemlisi, biz nasıl tam olarak göstermek için dijital video mikroskopi dağıtmak: 1) anne karnında embriyo yönünü belirlemek; 2) otocyst için enjeksiyon hedefleme için embriyo edinenlerin; 3) embriyonik gün 11.5 olarak otocyst içine izleyici boya solüsyonu ile karıştırılarak DNA microinject ve 12.5; doğumda doğum sonrası seçim için ve 5) etiket electroporated embriyolar; 4) enjekte otocyst electroporate. Ortak metodolojik hataları önlemek için nasıl tartışmak;; otocyst mistargeting en sık nedenler resimsel bir kılavuz; başarıyla transfekte iç kulaklarında temsilcisi örnekler sağlamak ve utero g bir yazmak için mevcut esaslarıene transferi hayvan bakım protokolü.
Protocol
1. Ventral Laparotomi
- Sodyum pentobarbital anestezik solüsyonu (gram vücut ağırlığı başına 7.5 uL) intraperitoneal enjeksiyonu ile; olan embriyoların embriyonik günde 11.5 (vajinal fiş algılandığında gün öğleden embriyonik gelişimin günlük 0.5 E11.5) altındadır baraj uyutmak. Anestezik solüsyonu Çalışma; mutlak etanol, 100 uL, 65 mg / mL sulu magnezyum sülfat (uterin tonu modüle) arasında 320 uL, 50 mg / mL sodyum pentobarbital çözeltisinin 180 uL ve propilen glikol 400 uL (sahip araç karışabilir sulu ve organik bileşenleri).
- Ağrılı uyaranlara testleri yapılarak anestezi bütünlüğü değerlendirin: pençe sıkmak; kuyruk tutam, yanak ve burun kılı dokunma ve göz kırpma yanıtı. Kornealara steril oftalmik merhem uygulayın.
- Suprapubik bölgeden makası ile göğüs kafesi ve ince bir bıçak (Oster # 40 bıçak) için karın kürk Tıraş. % 70 etanol ile karın,% 10 povidon iyot (Betadine), bir dezenfektend% 70 etanol, sırayla. Yer steril bir örtü üzerine fare karın tarafı aşağı ve sonra 2-5 dakika için bir ısıtma yastığı veya sıcak plaka (37 ° C) ayarlanır.
- Top uçlu makasla ventral orta hat karın cildi sarın. 10-14 mm kesi uzatın. Linea alba, karın duvarının ventral orta hat boyunca bir avasküler, beyaz bağ dokusu bandı tanımlayın. Top uçlu makas ile linea alba kesilirken ve kesi 10-14 mm uzatmak. Hemen önceden ısıtılmış (37 ° C) Laktatlı Ringer solüsyonu ile karın sulanması.
- Implantasyon sitelerde aşırı basınç uygulamadan halka forseps ile rahmin iki boynuzu yansıtmak. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer solüsyonu ile dış kaynaklardan laparotomi sulayın.
2. Transuterine Mikroenjeksiyon
- 12-16 μ: aşağıdaki özelliklere sahip bir kalın duvarlı, borosilikat cam kapiller mikroenjeksiyon pipeti fabricatem dış çapı ve 20 derece eğimli. ; Basıncı = 200; hız = 46;; = 0 çekin zamanı = 100) ısı = rampa testi artı 3 ünite: küçük kutu filamanlı bir Sutter P-97 pipet çektirmenin, aşağıdaki programı kullanın. Sutter BV-10 beveler ile, geniş çaplı pipetler için 104C (altın) aşındırıcı disk kullanın. Kalsiyum fosfat 3-4 mikrogram / uL de plazmid Pastör pipetiyle ifade (pH 7,2-7,4) tamponlu tuz. 30 saniye boyunca yavaşça konsantre DNA, vortex ile kristal hızlı yeşil ekleyin ve 10 saniye boyunca 10.000 g dönerler. Görsel enjeksiyonunun etkinliğini izlemek için gerekli hızlı yeşil minimum tutar ampirik olarak belirlenir. DNA / hızlı yeşil çözümü ile eğimli pipet dolgu. Basınçlı enjektör (Picospritzer kaynak gazı olarak>% 99 saf azot kullanarak) pipet sahibine yüklü mikroenjeksiyon pipeti bağlayın.
- Düşük yoğunluklu, kendi implantasyon site içinde embriyo görselleştirmek için halojen ışık ile rahim Transillüminasyonda. Bea tanımlayınting kalp, beyin veziküller, bacak tomurcukları, arka beyin arasında doğmakta olan 4. ventrikül ve göz. Ön ısıtması ile her 2 dakika, hidrasyon korumak için Ringer çözeltisi laktatlı rahim sulayın. Embriyo yönlendirme ve anatomik yukarıda belirtildiği tanımlamak için rahim üzerinde hafif basınç uygulayın.
- Orient embriyo anterior ve posterior dalları kanadını otocyst bulunduğu mezenkimal toprakları birincil baş damarı tespit etmek. Uygun otocyst rahim transillüminasyon tarafından görülemez. Otocyst damarın ana gövde ile birlikte, bir Amerikan futbol sahası üzerinde dikey veya goalposts şekli oluşturan, primer baş venin anterior ve posterior dalları arasındaki ortasında bulunur. Otocyst sabitlenmesini ortasındadır.
- Otocyst ve olası konumu ile uyumlu bir yörünge içinde rahim yoluyla enjeksiyon pipeti yerleştirin. Uter geçtikten sonra bir kez mikroenjektör darbeliBizim izleyici boya ve pipet yaklaşık konumunu görselleştirmek için. Mikrometre kontrol altında pipet Advance ve derinlik değerlendirmek için tekrar darbe. Ayrıca sürekli yanal baş mezenşim ve nabız içine pipet ilerlemek. Başarılı otocyst hedefleme dorsale endolenfatik kanal ve tarak Vestibül kabuk şekli konik şekli ortaya çıkaracaktır. Rahim üzerinde baskı bırakın, tek hareketle embriyo / uterustan pipet çıkarın ve hemen ısıtması ile rahim sulanması, Ringer çözeltisi laktatlı.
3. Vivo olarak Elektroporasyon
- Laktatlı Ringer solüsyonu ile rahim sulayın. Taze uygulanmış laktatlı Ringer çözeltisi elektriksel çift kürek tarzı elektrotlara rahim gereklidir. Laktatlı Ringer ile elektrot tungsten yüzeyleri nemlendirin. Elektrotlar yolunda Merkezi enjekte otocyst. Yavaşça elektroporasyon pa rahim sıkıştırmakddles. Katod enjekte otocyst ve anot uninjected otocyst bitişik uterus duvarı ile temas halinde olduğu lateral uterus duvar ile temas halindedir. Elektroporatörün üzerine ayak pedalı anahtarı ile bir kare dalga darbe tetikler. Elektroporasyon parametreler şunlardır: puls başına 43 volt ve 950 msn interpulse gecikme az 5, 50 ms darbe. Puls teslim hemen sonra rahim sulanması. 60-100 mAmps Otik epitel ataları transferinde yeterlidir: doku teslim mevcut kaydedin. Enjekte edilir ve baraj başına 4-6, E11.5 embriyolar electroporate.
- Olan iç kulaklarında olan bu embriyoların 4. ventriküle sulu floresan dekstran (Alexa Fluor 488 plazmid ifade bir yeşil floresan proteini kodlayan eğer plazmid ifade bir kırmızı floresan proteini veya Alex Fluor 594 kodlar varsa) ikinci bir bağımsız transuterine mikroenjeksiyon gerçekleştirin doğru enjekte edilir ve puls başına akımının en az 60 mAmps de olduelektroporasyon sırasında yürekli. Floresan dekstran ardbeyin doğumda tespit edilebilir ve iç kulak (3.5) embriyogenez sırasında manipüle edildi yavrularının seçimi sağlayacaktır.
- Laktatlı Ringer ile laparotomi sulayın. Karın boşluğuna laparotomi yeniden takın. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer çözeltisi 2-4 ml ile rahim boşluğuna boşaltır ve taşma steril örtüyü üzerine kesi dışarı akmasını sağlar. Kuru, steril malzeme ile dökümlülüğü değiştirin. Olmayan bir kesici iğne ve bir 6-0 emilebilir sütür ile karın duvarı dikin. Biz karın duvarı hem de deri için, her dikiş kilitleme, çalışan bir dikiş tercih.
- Barajlar 'kürk kurulayın ve deri altı enjeksiyon yoluyla bir non-steroid anti-inflamatuar gibi Meloksikam gibi yönetmek. Steril bir örtü üzerinde önceden ısıtılmış kurtarma kafesine baraj dönün. Monitör ve kanlı akıntı için barajlar 'solunumda, yara yeri açıklığı ve vajina kaydedin. Kanama ra olduğunuyeniden ama mevcut ve hız kesmeden eğer o anestezi altında iken, baraj euthanize. O bilinç ve ambulasyon girişimleri kavuşur zaman unutmayın. O yeme ve içme belirtileri gösterir ve yuva inşa etmeye başlamıştır fare koloniye baraj dönün. Genellikle, bu 12 saat içinde gerçekleşir.
- Doğumda (postnatal gün 0), flaş bir GFP veya Texas Red filtresi ile stereofluorescence mikroskop kullanarak floresan dekstran algılamak için çöp her yavru ile arka beyin bölgesi uygun şekilde ayarlayın. Sadece emziren baraj ardbeyin etiketleme gösterilecek bu yavrulardan dönün.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1.. Gelişmekte cochlea'ya Elektroporasyon aracılı gen transferi. E11.5 otocyst (darbe tra bir ifade plazmid kodlama gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ve electroporated ile enjekte edildiparametreler: Beş, 50 msn / nabız ve 950 msn interpulse gecikme) az 43 volt bakliyat. Otocyst koklea ortasında açmak yoluyla tabanından EGFP ifade gösteren E11.5 enjekte edildi ve electroporated yavru postnatal günde 6 (P6) A) bir temsilci iç kulak. Koklea lateral duvarında orta dönüş ve apeks sadece çıkarıldı. Apeks doğuran E11.5 ataları transfekte değildi. B) koklea İmmünoboyama Tüm mount (A) saç hücre belirteci ile, miyozin 7a (Myo7a), bu EGFP ifade Corti organı yörüngesini takip eder ve fena halde saç hücresi taşıyan duyusal epitel yerleştiğini gösterir. Otocyst E11.5 enjekte edildi ve electroporated bir E18.5 embriyo C) bir temsilci iç kulak. Lazer konfokal projeksiyon Myo7a pozitif duyusal kıl hücrelerinin EGFP ifade gösterir. EGFP expressio belirten Corti E18.5 organ koklear duyu epiteli D) Lazer konfokal projeksiyonn iç saç hücrelerinde (IHC), dıştaki saç hücreleri (OHC), iç falankslarında hücreleri (IPC), ayak hücreleri (PC), ve Deiters 'hücreleri (dc). (B) 'de ölçekli çubuğu (A) için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelişmekte olan fare iç kulağa gen transferi: Fare iç kulak postimplantation gelişim 12,13 ilk haftasında kulak taslakları gelişir. Embriyonik günde 9.5 (E9.5) tarafından, taslakları invajine ve otocyst 2 adı verilen bir sıvı dolu vesikül dönüştü. Vezikül içinde kulak öncüleri olgun iç kulak içinde duyusal ve duyunun hücreleri gibi vestibüler ve işitsel epitelde mekanik hassas kıl hücreleri innerve nöronlar doğurur. Geç evrelerinde olarak, iç kulak membranöz labirent karmaşık, 3 boyutlu morfoloji 3,12 kurulmuştur. Kazanç ve kayıp fonksiyon-deneysel yöntemler genellikle, hücre kaderinin özellikleri ve oluşum gibi gelişimsel süreçlerinin genetik regülasyonu hakkında fikir edinmek için fare transgenesis tarafından yapılmaktadır. Gelişmekte olan fare iç kulak Dinamik genetik manipülasyonutero fare transgenesis için ücretsiz bir yaklaşımı temsil ettiğini fare deneysel embriyoloji 6,11 ile çiftler gen transfer teknikleri.
Virüs ve elektroporasyon aracılı gen transfer teknikleri gelişmekte olan iç kulak 6,11,14,15 gen ekspresyonu işlemek için geliştirilmiştir. Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörler duyusal ve duyunun hücre tipleri doğuran ve fare saç hücreleri 16 kalsiyum bağımlı ekzositoz moleküler temelini sorgulamak için kullanılmıştır otik ataları bulaşabilir. AAV vektörleri iç kulak geniş ifade etkinleştirmek ve farklı viral serotipleri diferansiyel hücresel ifade için avantajlı olabilir benzersiz tropizm gösterilecek yüksek titreleri üretmek. Dezavantajları misexpressed edilebilir gen ve virolojik uzmanlık yapmak arındırmak ve virüs titresi için gereksinimi boyutunu sınırlayan sabit bir doldurma kapasitesi bulunur. Elektroporasyon-aracılı gen transfer in vivo 6 duyusal saç hücre kaderinin belirlenmesinde temel bir helix-loop-helix transkripsiyon faktörünün rolünü değerlendirmek için kullanılmıştır. Ağ Geçidi on klonlama sonrasında teknoloji adapte İfade plazmidler eşsiz rehberleri bir gen-of-ilgi ve IRES dizisi 17 bir floresan işaretleyici protein ekspresyonu sürüş vektörlerinin hızlı ve verimli bir yapı sağlar. Ilgi Genler kullanılan promoter bağlı doğum sonrası iç kulak sürebilen elektroporasyon ve anlatım 24 saat içinde otik öncüleri olarak ifade edilebilir. Plazmid inşaat, arıtma, konsantrasyon ve kantitatif sadece standart moleküler biyolojik becerileri gerektirir. Dezavantajları ~ 8kb yukarıda plazmid boyutu artar ve en viral vektörlerin göre embriyonik öldürücülük oranı daha yüksek olarak in vivo transfeksiyon verimliliği azalmıştır içerir. Hem elektroporasyon-ve virüs aracılı gen transfer teknikleri fare deneysel embriyolojik teknoloji ustalık gerektirirniques: sağkalım cerrahi, rahim embriyo manipülasyonu ve transuterine mikroenjeksiyon içinde. Bu yazının amacı, dijital video mikroskobu ile her kritik metodolojik adım göstererek ikinci mesele hitap etmektir.
Video metodolojik notlar: görüntüleyici baraj, yani baş (kasıtlı çoğu bulanık gayrisafi anatomisine göre ventral orta hat pozisyonuna görebilsin diye filme ise bilerek steril alan ile kesi asmak için seçtim kare ama tanınabilir), uzuvlar ve kuyruk. Kesi Draping etkili bu görüşü engeller ve ventral laparatomi ve bir enjeksiyon dizisi sırasında mekansal ilgili anatomik ilişkileri takdir çabaları etkilemesi için. Ancak, steril bir alan üzerine dış kaynaklardan laparotomi kalanı cerrahi asepsi korumak için böylece barajın karın draping öneririz. Ayrıca, bilinçli iblisler teşebbüs etmediBu yöntemlerin bir veteriner veya deneyimli cerrahi teknisyen uzman rehberlik tarafından öğrenilen gerekir çünkü karın duvarı ve cilt cerrahi kesi dikiş trate. Dr Marcel I. Perret-Gentil (San Antonio Texas Üniversitesi), "Veteriner dikiş İlkeleri.", Onun bildiri de, resimsel sunumlar ile birlikte bu konuda mükemmel bir tartışma sunuyor 18
Usul öneriler: Gelişmekte olan fare iç kulağa gen transferi teknik olarak zordur. Değişkenliğin önemli bir miktar ortadan kaldırmak ve başarılı sonuçlar sağlayacak en iyi uygulamaları bir dizi vardır. Bu deneysel bir yaklaşım, öğrenmeyi kolaylaştırmak için aşağıdaki tavsiyelerde bulunmaktı.
Farenin sağ kalım cerrahi hayvan bakım protokolü geliştirmek için veteriner personel Consult: memeli sağkalım cerrahi için hayvan bakım protokolü üretmek için talep ediyor yanaanestezi, analjezi ve perioperatif bakım tanımlanmış ve koordine edilmelidir. Bir başvuru protokolünün temel oluşturabilir dil dahil olmak üzere hayvan bakımı protokol hazırlama, ayrıntılı bir tartışma tamamlayıcı bilgiler (bkz. "olarak verilmiştir Hayvan Bakım Protokol Geliştirme "). Ayrıca, ev kurumları 'Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve veteriner kadrosu şüphesiz istek üzerine uygun bir protokol oluşturulması ek rehberlik sağlayacaktır.
Utero gen transferi için özel bir fare hayatta cerrahi alan oluşturulması: bu bir vücut boşluğuna ihlal ettiğinden ventral laparatomi bir majör cerrahi olarak sınıflandırılmış olduğunu. En IACUCs büyük fare hayatta cerrahi steril, 100 sınıf ortamı gerektirmez. Aksine, bu özel bir alana doğru aydınlatma, havalandırma içerirmontajı için, ek ısıtma ve sert, gözeneksiz, dezenfekte yüzeyler olasılıkla gerekecektir. Biz, enfeksiyondan fareyi koruyan fizyolojik stresi azaltır yatay bir laminer akış kaput bizim hayatta ameliyat yapmak ve böylece tesisleri, ameliyat sonrası iyileşmenin tercih. Tezgah üstü Kesilmiş ve gömme priz; güç gen aktarım ekipmanları genişletilmiş elektrik devresi; Biz yönlü, düşük voltajlı halojen parça aydınlatma dahil salınım-sönümlü, yatay laminar akım kapağı (Envirco LF 630) için özel modifikasyonlar bir dizi tanımladık kablosu geçiş için. Bu değişiklikler ayrıntılı bir şematik tamamlayıcı bilgiler (bkz. "olarak verilmiştir Utero Gen Transferi Laminar Flow Hood "). Fare su adanmış olan uygun bir yeri tanımlamak için hayvan bakım protokolü geliştirmek gibi IACUC danışıncerrahi rvival.
Sodyum pentobarbital anestezi uygulamadan önce yakın 0.1 gram ağırlığında baraj: sodyum pentobarbital anestezi etkili olduğunu ve tavsiye edilen doz şeması takip edildiğinde çalışma süresi, en azından 105 dakika sağlayacaktır. Enjekte etmek için anestezik karışımı dozu hesaplanırken önce her baraj için doğru bir vücut ağırlığı belirlenir. Baraj vücut ağırlığının tahmin asla. Becton Dikison gelen Alerji Şırınga Tepsi iğne ve şırınga kullanın: insan intradermal konik gebe farelere atravmatik intraperitoneal için idealdir. Ayrıca, bu şırıngayı çok düşük ölü boşluk hacmine sahip ve tipik olan embriyolar E11.5 veya E12.5 altındadır barajlar için gerekli anestezik ciltlik aralığı için kalibre edilir.
Embriyonik hayatta desteklemek için profilaktik analjezi dağıtma: gibi, dikiş hattında bir topikal anestezik yönetmeBupivakain ve önceden bu analjezikler zaman tahtada böylece kurtarma kafesine baraj yerleştirerek böyle Meloksikam gibi sistemik, non-steroid anti-inflamatuar ilaç, baraj anestezi kurtarır. Baraj rahatsızlık azaltılması sağlıklı bir gebelik sonrası kurtarma ve bakımını kolaylaştırır.
Eğim mikroenjeksiyon pipetler ve sıkıca dış çapı sınırlamak: Embriyonik letalitesinin tek ve en sık nedeni doku ve / veya kötü oluşturulmuş mikroenjeksiyon pipetler gelen vasküler hasar olduğunu. E11.5 fare otocyst içine Transuterine mikroenjeksiyon eski embriyolar daha büyük organlar (örneğin beyin veziküller, göz, bacak, vb) içine enjeksiyon farklı kısıtlamalar taşır. Unbeveled, kötü eğimli ya da uygun olmayan büyük dış çapı pipetler embriyonik hayatta azalacak rahim içinde gemilerin, visseral yolk kesesi damarlar ve / veya E11.5 de embriyo, kanama neden olur. Mümkündüruygun bir eğim taşıyan küçük çaplı dayanıklı pipetler teslim-break, ancak bunu rutin yapmak zordur. Olan küçük otocyst hedef E11.5 fare embriyo, acımasız olacak. Pipet tasarım ve üretim 19 üzerinde tam bir söylem için Sutter Instruments P-1000 P-97 Pipet Cookbook 2011 danışın. Bu çalışmada kullanılan pipetler için Parametreler yukarıda belirtildiği ve bunların üretim tamamen daha önce 11 tartışıldı. Sutter Instruments BV-10 beveler için kitapçığındaki usul notları da mükemmel bir kaynaktır.
Transuterine mikroenjeksiyon tarafından otocyst mistargeting oluşur anlamak: Video E11.5 ve E12.5 otocyst içine transuterine mikroenjeksiyon için ideal bir sonuç sunuyor. Otocyst Mistargeting genellikle, çok derin, çok yüzeysel enjekte edilen veya yetersiz fabrikasyon pipetler kaynaklanır. Şekil 2 bu koşullar göstermektedir. PanelBir otocyst içine hızlıca yeşil çözümün başarılı transuterine mikroenjeksiyon sonrası transillüminasyon tarafından görüntülenmiştir bir E12.5 embriyonun sol yanal bir görünümdür. Arka beyin (hb) otocyst bir kama şeklindeki çentik dorsal olarak görünür. Göz (e), çevresini ve sol ön ayakları belirgin boyunca pigment bir halka vardır. Birincil baş ven (PHV) ana gövde sadece otocyst altında olduğunu. Otocyst siyah görünür hızlı yeşil doludur: dorsal, endolenfatik kanal (ed) ve otocyst (oc) vestibül ayırt edilebilir. E11.5-12.5 otocyst başarılı hedefleme her zaman pek belirgin endolenfatik kanal ve vestibül sunacak. Panel A 'enjekte otocyst kritik incelemesi kolaylaştırmak için beyaz olmayan bir etiket ile aynı görüntüsü gösterilmektedir.
Şekil 2. Transuterine microinjec tarafından otocyst mistargeting A resimsel kılavuzuTION. Tüm paneller arka beyin-orta beyin bölgesinin bir dorsal görünümüdür Paneli H hariç, orta beyin yukarı ve ön beyin sol bir E12.5 embriyonun sol lateral görünümü göstermek. Her satırda Paneller aynı embriyo görüntüleri temsil eder. Otocyst mistargeting nedenlerini ayrıntılı bir açıklama için açıklamalara bakınız. Kısaltmalar: e, sol göz; ed, endolenfatik kanal; fg hızlı, yeşil, sert kapak ciltli, arka beyin, lb, bacak tomurcuğu; oc, otocyst; ot, otik toprakları p, pipet, PHV, primer baş ven; punto, pipet.
Yüzeyel enjeksiyon mistargeting yaygın bir nedenidir. Paneller E12.5 konseptus içine yüzeysel bir enjeksiyon göstermek EDİLECEK. Arka beyin (hb) çentik ve kulak toprakları (ot, daire) bu sol, lateral görünümde belirgin. Mikroenjeksiyon pipeti (p) ön plandadır. Hızlı yeşil (fg) pipet (B) çıkartmak başlar ve basınç enjektörü (CD), boya yayılır den sonraki darbeleri ile bir oval şekil. Th dağılımıe boya onu rahim duvarı ve visseral yolk kesesi, exocoelomic boşluğu saran bir extraembryonic membranı arasındaki tanıtıldı olduğunu göstermektedir. Deneyci Bu embriyo otocyst yeniden hedef çalışmamalısınız ama sonraki embriyo geçmek gerekir. Çoklu enjeksiyonlar azalmış embriyonik hayatta kalma, E12.5 daha E11.5 daha akut bir etkiyle ilişkilidir.
Derine enjeksiyon mistargeting daha sık nedenidir. Paneller FH arka beyin içine kulak topraklarından geçtiğine bir enjeksiyon yörüngesini göstermektedir. Birincil baş ven (PHV), sol göz (e), Pipet ve (p) bir E12.5 embriyonun bu lateral görünümde belirgin. Hızlı yeşil (fg) başlangıç ejeksiyon birincil baş ven / otik topraklarına göre dorsale deplase olur. Sonraki darbeler ile, kama şeklindeki arka beyin (hb) tamamen hızlı yeşil (Panel G) ile doluydu. Enjekte embriyonun bir 90 derecelik bir dönüş hindbra içinde hızlı yeşil algılama sağlardorsal görünümü (Panel H) den boşluğunda. Bu rahim ile temas ettikten sonra mikroenjeksiyon pipeti derinliğini algılama yetersizliği ile hem yüzeyel hem de derin enjeksiyonları sonucu. Iyi çalışan bir pratik yaklaşım rahim yoluyla pipet ilerlemek ve hemen ardından hızlı bir yeşil puf aramak için bir kez nabızlamak için: puf yerini pipet yaklaşık konumunu gösterir. Bu mesafe ölçücü darbe dayalı derinliğini ayarlayın.
Yetersiz fabrikasyon pipetler mistargeting en sık nedenidir. Paneller gösterilen enjeksiyon denemesinde IK elle kırılmış ama eğimli olmayan bir pipet ile yapılmıştır. E12.5 embriyo yan görünümüdür ardbeyin (HB), sol gözün (e) ve mikroenjeksiyon pipetle (p) gösterir. Pipet (pt) keskin yaylı ve (panel I) rahim nüfuz başarısız olduğunu unutmayın. Ek kuvvet uygulaması pip bırakarak, pipet (Panel J, ok) ucu makasette ucu rahim içinde gömülü. Hızlı yeşil (fg) küçük bir miktar kırık pipetle çıkartıldığı ve rahim yüzeyi tespit etti. Gömülü pipet (Pano K) ince, steril forseps ile çıkarılır ve kavuz atık olarak atılmalıdır. Pipet ucu bulunan veya başarıyla kaldırıldı edilemezse, anestezi altında baraj euthanize.
Bir fare sağkalım cerrahi veri tablosunda prosedürel gözlemler Belge: Bu öğrenme yöntemleri için önemli bir unsur gözlemler belgelemek ve bu gözlemlere dayalı düzenlemeler yapmaktır. Bir fare sağkalım cerrahi bilgi formu üretin ve preoperatif operatif ve postoperatif bilgileri not edin. Ameliyat öncesi verileri baraj ağırlığı, anestezik getirilmeyen dozu, plazmid enjeksiyonlu, vb Operatif veriler (yani, R2 sağ uterin horn yumurtalıktan ikinci embriyo değildir) embriyo enjekte dahil, enjeksiyon kalitesi (yani, hiçbir endolenfatik dahil Kanal 4, boya tespit
Transfeksiyon verimliliği optimize etmek için puls başına gönderilen akım kullanın: Bir 950msec arası ile kare dalga darbe 5 oluşur, 43volt, 50 milisaniye darbeDarbe gecikme. 5mm platin, kürek stili elektrotları tüm kulak topraklarının elektrik alanı içinde bulunan emin olun. Onlar doğru konumlandırmak için daha zor olmasına rağmen Benzer transfeksiyon verimliliği, 3mm kürekler ile elde edilebilir. Darbe paradigma değil gerilimler üzerinden süpürme ve transfeksiyon verimliliği değerlendirerek, nihai darbe sırasında embriyo transfer güncel değerlendirerek optimize edilmiştir. Mantığı puls başına teslim mevcut rahim ve platin elektrot arasındaki elektriksel bağlantının açıklığını bağlı olarak sabit voltaj olarak değişir olmasıdır. Rahim taze hemen önce taşıyıcı aşan mevcut kürekler ve şarj yerleştirerek Laktatlı Ringer solüsyonu ile sulanan olduğunu varsayarsak, baş değişken kürekler ile rahim uygulanan "kaplin" basınç miktarıdır. En iyi güncel teslim ve sporadik aktarılmasının <60mAmps yılında 43volts sonuçlara hafif basınç. 43v az orta basınç60-in 100mAmps olts sonuçlar teslim edilir ve en verimli transfeksiyon. Yılında 43volts sonuçlara Ağır basıncı> 100mAmps teslim ve ısrarla değişmiş kalp hızı ile ilişkilidir ve embriyonik öldürücülüğü arttı. Aşırı basınç visseral yolk kesesi (bir "pop" kürekler vasıtasıyla hissedilebilir) yırtması ve embriyonik öldürücülüğü neden olur. Bu uygulanan değişken basınç teslim akımı etkiler elektrotlar arasındaki empedans değiştirir olasıdır. 1Hz (saniyede bir 50 milisaniye pulse) darbe frekansı embriyonik hayatta kalmak için pozitif bir korelasyon olduğunu embriyonun kalp döngüsü için en yıkıcı olarak tanımlandı. Biz vivo elektroporasyon paradigması etkin bir kurulmasında izlemek için en önemli parametre puls başına teslim mevcut olduğu sonucuna varıldı. Herhangi bir darbe paradigmanın Modifikasyonu puls başına teslim mevcut dikkatle izlenmesi içermelidir.
Inci öğrenme modüler bir yaklaşımı benimseyine tekniği: Modül 1: uterus dışsallaştırma ile sham Pratik, ama enjekte veya electroporate yok. Barajlar son derece iyi ventral laparatomi tahammül ve cerrahi tekniğe bağlı komplikasyonlardır yaşamaya asla. Fare sağ kalım cerrahi becerileri şüphesiz yeterli bir eğitim sürdürmeye ev kurumda ikamet ediyorsanız. Devam etmeden önce cerrahi beceri ustalık ulaşmak. Modül 2:, anestezi altında baraj euthanize enjekte edilen embriyolar izole ve otocyst enjeksiyon kalitesini değerlendirmek: sağkalım cerrahi tamamlanması beklentisi olmadan bir anestezi baraja otocyst içine Uygulama transuterine mikroenjeksiyon. Modül 3: Hızlı yeşil ile 2 farklı embriyolarda Hedef sadece 2 otocysts, electroporate değil, ameliyatı tamamlamak ve aşağı embriyonik hayatta doğrulamak. Modül 4: DNA / hızlı yeşil çözüm, electroporate aşağı embriyonik hayatta doğrulamak ve tespit transfeksiyon ef ile Hedef sadece 2 embriyoren ve kompakt eğirme. Modül 5: DNA / hızlı yeşil çözümü ile Hedef sadece 2 embriyo, manipüle embriyo etiketlemek için 4. ventriküle Alexa Fluor enjekte electroporate, P0 az etiketli embriyo seçin ve tespit transfeksiyon verimlilik.
Usul öğrenme eğrisi: fare hayatta cerrahi teknikleri Mastery, kişinin evi kurumun veteriner ve cerrahi personelden uygun rehberlik ile, oldukça hızlı ve sadece 3-5 barajlar-değer uzmanlık kazanmak için yeni başlayanlar için pratik gerektirir gerekir. Yararlı transfekte iç kulaklarında oluşturmak için Transuterine mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyon 6 çalışılabilir gebelik başına embriyo ve modüler yaklaşım izlenir vardır varsayarak, çaba 10-50 barajlar-değer gerektirecektir. Ince motor beceriler gerektiren aktiviteleri olan öğrenciler (yani, bir enstrüman çalmasını, dikiş, model alma, ya da rekabetçi atletizm) tho daha kısa eğitim süresi vardeğil mi se. Bu yöntemlerin başarılı ustalık kritik karşılıklarını detay (yani mikroenjeksiyon pipet imalat, vasküler anatomi, açık not alma) ve makul sakin kalma için titiz dikkat vardır.
İş Akışı: Bir kez uzmanlık kazanılıyor, bir 4-6 baraj başına embriyo enjekte electroporating tahmin edebilirsiniz; 3-5 embriyoların hayatta kalacaktır; ve 2-4 embriyo yararlı analizi için iç kulaklarında transfekte olacaktır. Doğumda sıralama için etiket embryolarının ardbeyin Alexa Fluor etiketleme tekniği her electroporated embriyo ek ardbeyin enjeksiyon gerektirir, ama bu iyi tolere edilir ve olumsuz usul verimliliği etkilemez. Böylece, in vivo elektroporasyon yılında gelen yararlı transfekte iç kulak iyileşme oranı bir heterogygous damızlık paradigma homozigot mutant farelerin iyileşme oranı ile karşılaştırıldığında olumlu. Deneyimi ile, günlük deneyci başına 2-3 baraj makul bir eserdirakış: 1.5 cerrahi için baraj başına saat ve ameliyat sonrası izleme için 1.5-2 saat olmak üzere toplam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz aslında başvuru 11 sayfa 130 çıktı mikroenjeksiyon pipeti üretim rakamı yayınlamak için izin Humana Basın teşekkür ederim; videografisi için Larry Dlugas ve Steven Wong, Eğitim İletişim OHSU Bölümü, video tasarım ve düzenleme için Larry Dlugas; Adam M. Ç 'Quinn, Kıdemli Tasarımcısı, teknik şematik sağlamak için özel yatay laminer akış kaput ve Les Goldsmith tasarımı için Trion / Envirco; Victor Monterroso, OG, Yüksek Lisans, Doktora ve Tom Chatkupt, DVM, Karşılaştırmalı Tıp OHSU Bölümü, rehberlik için bizim ile hayvan bakım protokolü, cerrahi teknikler ve profilaktik analjezi rejimi; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, veteriner dikiş teknikleri üzerine sadaka paylaşmak için; bizim Adobe Premiere Pro video mikroskopi bilgisayar iş istasyonu tasarımı için Edward Porsov, MS, ve Leah Beyaz ve LNS Jonas Hinckley (Portland, OR) Captioning. Bu çalışma Sağırlık ve Othe Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştirr İletişim Bozuklukları: DC R01 008.595 ve DC R01 008.595-04S2 (JB) ve P30 DC005983 (Oregon İşitme Araştırma Merkezi Çekirdek Grant, Peter Gillespie, Proje Yürütücüsü).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
