Summary
האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו מגדירים
Abstract
האוזן הפנימית יונקים יש 6 epithelia חושית ייחודית: 3 cristae ב ampullae של תעלות בצורת חצי עיגול, maculae ב utricle ו שקיק, ואת האיבר של קורטי ב שבלול מפותל. Cristae ו maculae מכילים תאים שיער וסטיבולריות כי transduce גירויים מכניים כדי subserve תחושה מיוחדת של איזון, בעוד שיער השמיעה התאים איבר של קורטי הם מתמרים העיקריות לשמוע 1. גורל התא הפירוט epithelia אלה המורפוגנזה חושית של התעלות ושל בצורת חצי עיגול שבלול להתקיים בשבוע השני של ההריון של העכבר הושלמו בעיקר לפני הלידה 2,3. מחקרים התפתחותיים של האוזן הפנימית העכבר נעשות באופן שגרתי על ידי איסוף עוברים מהונדס בשלבים עובריים או לאחר לידה שונים כדי לקבל תובנה על הבסיס המולקולרי של הסלולרי ו / או פנוטיפים מורפולוגי 4,5. אנו משערים כי העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח הפנימי ברחם < / Em> בהקשר של רווח והפסד של תפקודי מחקרים מייצג גישה חינם ל transgenesis העכבר המסורתי לחקירה של המנגנונים הגנטיים העומדים בבסיס האוזן יונקים הפיתוח הפנימי 6.
פרדיגמה ניסויית לנהל misexpression מחקרים גנים באוזן העכבר פיתוח פנימי הוכיח כאן פותר לשלושה שלבים כלליים: 1) laparotomy הגחון; 2) microinjection transuterine, ו 3) ב electroporation vivo. Laparotomy הגחון הוא ההישרדות העכבר טכניקה כירורגית המאפשר החצנה של הרחם כדי לקבל גישה ניסויית על העוברים המושתלים 7. Microinjection Transuterine הוא השימוש, micropipettes משופעים זכוכית נימי להציג את הביטוי הפלסמיד לתוך לומן של שלפוחית otocyst otic או. בחי electroporation הוא יישום של גל מרובע, קטניות השוטפות הניתנות באופן ישיר לנהוג ביטוי הפלסמיד לתוך 8-10 ובתאים.
התחת = "jove_content"> אנחנו קודם לכן תיאר את electroporation מבוססת טכניקת העברת גנים כלל הערות מפורטות על כל צעד של פרוטוקול 11. טכניקות עכבר העוברית הניסוי יכול להיות קשה ללמוד פרוזה תמונות סטילס בלבד. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את 3 השלבים בהליך העברת גנים. הכי קריטי, אנחנו לפרוס מיקרוסקופיה וידאו דיגיטלי להראות בדיוק איך: 1) לזהות את האוריינטציה העובר ברחם; 2) לארגון מחדש של עוברים למיקוד זריקות כדי otocyst; 3) microinject DNA מעורבב עם פתרון צבע נותב אל otocyst על ימים עובריים 11.5 12.5: 4) electroporate otocyst מוזרק, ו 5) עוברים תווית electroporated לבחירה לאחר הלידה בלידה. אנו מספקים דוגמאות מייצגות של האוזניים הפנימיות transfected בהצלחה: מדריך מצולם על הסיבות השכיחות ביותר של Mistargeting otocyst, לדון כיצד ניתן למנוע טעויות מתודולוגיות משותפות וכן הנחיות לכתיבת הנוכחיים ברחם גרםטיפול בבעלי חיים מז העברת הפרוטוקול.
Protocol
1. הגחון laparotomy
- להרדים סכר אשר עוברים נמצאים היום העוברית 11.5 (E11.5: בצהרי היום תוסף הנרתיק הוא מזוהה היום 0.5 של ההתפתחות העוברית) בזריקה intraperitoneal של פתרון pentobarbital נתרן הרדמה (7.5 μL לכל גרם משקל גוף). עבודה ההרדמה: 180 μL של 50 מ"ג / מ"ל נתרן פתרון pentobarbital: 100 μL של אתנול מוחלט; 320 μL של 65 מ"ג / מ"ל מגנזיום סולפט מימית (מודולציה הטון הרחם), ו 400 μL של פרופילן גליקול (בליל רכב עם מימית ואורגנית רכיבים).
- להעריך את השלמות של הרדמה על ידי ביצוע בדיקות גירויים רעילים: לסחוט כפה, קמצוץ הזנב, והוא כהרף בתגובה למגע הלחי vibrissae. החל משחת עיניים סטרילית את קרניות.
- לגלח את הפרווה מאזור הבטן suprapubic אל כלוב הצלעות עם המזמרה ולהב בסדר (אוסטר # 40 להב). לחטא את הבטן עם אתנול 70%, יוד povidone 10% (בבטאדין),ND אתנול 70%, ברצף. במקום העכבר הבטן בצד על וילון סטרילית ולאחר מכן הגדר על כרית חימום או צלחת חמה (37 מעלות צלזיוס) במשך 2-5 דקות.
- לחתוך את העור בטן קו האמצע הגחון עם הכדור שקצהו מספריים. להרחיב את החתך של 10-14 מ"מ. זהה את Linea alba, avascular, רקמת חיבור פס לבן לאורך קו האמצע הגחון של דופן הבטן. לחרות Linea alba עם הכדור היטה מספריים ולהרחיב מ"מ 10-14 החתך. מיד להשקות את הבטן עם prewarmed (37 ° C) פתרון של לקטט רינגר.
- מחצינים את שתי קרני הרחם עם מלקחיים הטבעת בלי הפעלת לחץ מופרז על אתרי ההשתלה. להשקות את קרני הרחם מוחצנים עם פתרון, prewarmed לקטט רינגר.
2. Transuterine Microinjection
- לפברק עבה קירות, זכוכית בורוסיליקט נימי microinjection פיפטה עם המאפיינים הבאים: 12-16 μמ 'קוטר חיצוני ו שפוע 20 מעלות. על חולץ P-97 פיפטה סאטר עם נימה קופסה קטנה, השתמש בתוכנית הבאה: חום = מבחן כבש בתוספת 3 יחידות, לחץ = 200; למשוך = 0; מהירות = 46; זמן = 100). עם beveler סאטר BV-10, השתמש בדיסק 104C (זהב) שוחקים עבור בטפי להחדרת נוזלים בקוטר גדול. הביטוי Resuspend פלסמיד ב מיקרוגרם μL 3-4 / ב סידן פוספט חינם שנאגרו מלוחים (pH 7.2-7.4). הוסף ירוק מהיר גבישי מערבולת ריכוז ה-DNA, בעדינות למשך 30 שניות, מסתובבים גרם 10,000 למשך 10 שניות. כמות מינימום של ירוק מהיר נדרש חזותית לעקוב אחר היעילות של הזרקת נקבע באופן אמפירי. לגבות את פיפטה beveled עם ה-DNA / פתרון ירוק ומהירה. חבר את הצינורית microinjection טעון לבעל פיפטה של לחץ ההזרקה (Picospritzer באמצעות> חנקן טהור 99% כגז מקור).
- Transilluminate הרחם בעוצמה נמוכה, אור הלוגן לדמיין את העובר בתוך אתר ההשתלה שלה. זהה את ביהטינג לב, שלפוחית המוח, ניצנים הגפיים, החדר המתהווה 4 של ה למוח האחורי, והעין. להשקות את הרחם כל 2 דקות עם prewarmed, לקטט הפתרון של רינגר לשמור על הידרציה. להפעיל לחץ עדין על הרחם לארגון מחדש של העובר ולזהות את ציוני דרך אנטומיים שצוין לעיל.
- אוריינט העובר לזהות את הווריד ראש העיקרית אשר הקדמי ואת האחורי האגף סניפים בשטח mesenchymal שבו otocyst מתגורר. Otocyst נכונה לא ניתן לראות על ידי שקוף של הרחם. Otocyst ממוקם באמצע הדרך בין הענפים הקדמי וגם האחורי של עורק הראש העיקרי שבו, יחד עם המטען הראשי של הווריד, יוצרים את הצורה של הזקפים או עמודי השער במגרש הכדורגל האמריקאי. Otocyst הוא באמצע הדרך בין הניצבים.
- הכנס פיפטה הזרקת דרך הרחם במסלול בקנה אחד עם מיקום משוער של otocyst. הדופק microinjector פעם אחת לאחר שעברו דרך uterלנו לדמיין את צבע נותב ואת המיקום המשוער של קצה פיפטה. לקדם את פיפטה בשליטת מיקרומטר והדופק שוב כדי להעריך לעומק. לקדם את פיפטה לתוך mesenchyme ראש הדופק לרוחב שוב ושוב. מיקוד otocyst מוצלח יגלה את הצורה של צינור קוני endolymphatic dorsally ו צדפות קרב הצורה של הכניסה. לשחרר את הלחץ על הרחם, הסר פיפטה מעובר / רחם בתנועה אחת, ומיד להשקות את הרחם עם prewarmed, לקטט בתמיסת רינגר.
3. ב electroporation vivo
- להשקות את הרחם בתמיסת רינגר של לקטט. פתרון רינגר לקטט של יישומי טרי יש כמה חשמלית את המשוט בסגנון אלקטרודות אל הרחם. להרטיב את פני השטח של אלקטרודות טונגסטן עם לקטט רינגר של. מרכז otocyst מוזרק בדרך של האלקטרודות. בעדינות לדחוס את הרחם עם הרשות הפלסטינית electroporationddles. הקתודה היא במגע עם דופן הרחם לרוחב כדי otocyst הזריק האנודה נמצא בקשר עם דופן הרחם סמוך otocyst uninjected. לעורר גל מרובע הדופק הרכבת עם הבורר דוושת רגל על electroporator. פרמטרים electroporation הם: 5, 50 msec פעימות ב 43 וולט בכל הדופק ואת עיכוב 950 msec interpulse. מיד להשקות את הרחם לאחר הרכבת הדופק מועבר. הרשומה הנוכחית נמסר רקמות: 60-100 mAmps די transfect אבות אפיתל otic. מזריקים ו electroporate 4-6, עוברים E11.5 לכל הסכר.
- בצע microinjection 2, transuterine עצמאית של מימית ניאון dextran (Alexa פלואוריד 488 אם הביטוי פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי אדום או אלכס פלואוריד 594 אם הביטוי פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק) אל החדר 4 ה של עוברים אלה שאוזניו הפנימי הם מוזרק בצורה מדויקת לפחות 60 mAmps של זרם לכל הדופק היה דהlivered במהלך electroporation. Dextran ניאון יהיה להבחין בלידה בשנים למוח האחורי ולאפשר מבחר גורים אשר האוזניים הפנימי שניצלו אותם במהלך embryogenesis (ראה 3.5).
- להשקות את קרני הרחם עם לקטט רינגר של. הכנס מחדש את קרני הרחם לתוך חלל הבטן. לרוקן את חלל הרחם עם 2-4 מ"ל של פתרון, prewarmed לקטט רינגר ולאפשר גלישה לניקוז מחוץ לאתר את החתך על וילון סטרילית. החלף כורכת חומר יבש סטרילית. לתפור את דופן הבטן עם מחט ללא חיתוך ו תפר 6-0 resorbable. אנחנו מעדיפים לתפור ריצה, נעילת כל בגד אחר, על הקיר הן לעור הבטן.
- לייבש פרווה של האימהות ולנהל שאינם סטרואידים נגד דלקת כגון Meloxicam בזריקה תת עורית. להחזיר את הסכר לכלוב התאוששות prewarmed על וילון סטרילית. לנטר ולהקליט הנשימה של סכרים, אתר patency החתך, והנרתיק להזרמת דם. הדימום הוא דלקת מפרקים שגרוניתמחדש, אבל אם ההווה ללא הפוגה, להרדים את הסכר בזמן שהיא עדיין תחת הרדמה. שים לב פעם שהיא חוזר להכרה ומנסה ambulate. להחזיר את הסכר למושבה העכבר כאשר היא מראה סימנים של אכילה ושתייה החלה לקנן לבנות. בדרך כלל, זה קורה תוך 12 שעות.
- בעת הלידה (יום לאחר הלידה 0), קבע פלאש באזור למוח האחורי של כל גור באפריון לזהות dextran ניאון באמצעות מיקרוסקופ לנתח stereofluorescence עם GFP או טקסס האדום מסנן על פי הצורך. חזור אל הסכר מניקות רק את הגורים המוצגים תיוג למוח האחורי.
4. נציג תוצאות
באיור 1. בתיווך electroporation גן העברה שבלול המתפתח. Otocyst E11.5 הזריקו חלבון פלסמיד ביטוי משופרת קידוד פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ו electroporated (הדופק traבכל הפרמטרים: 5, 43 וולט פולסים של 50 אלפיות השניה / 950 דופק איחור msec interpulse). א) האוזן הפנימית נציג מיום הלידה 6 (P6) גור, אשר הוזרק otocyst ו electroporated ב E11.5 הוכחת ביטוי EGFP מהבסיס דרך בתורו באמצע שבלול. קיר לרוחב של שבלול הוסר בתורו איפקס התיכון בלבד. אבות E11.5 שיוצרים איפקס לא transfected. ב) הר שלם immunostaining של שבלול ב (א) עם סמן את התא שיער, 7 א שרירן (Myo7a), עולה כי הביטוי EGFP בעקבות המסלול של האיבר של קורטי ו מותאמת גסה את האפיתל שיער תא נושאת חושית. ג) האוזן הפנימית נציג מעובר E18.5 אשר otocyst שהוזרק ו electroporated ב E11.5. הקרנת לייזר confocal מדגים ביטוי EGFP ב Myo7a חיובי תאים שיער חושיות. D) הקרנת לייזר confocal של האפיתל חושית שבלול מאיבר E18.5 של קורטי המציין EGFP expression בתאי השיער הפנימיים (IHC), בתאי השיער החיצוניים (OHC), תאים phalangial הפנימיים (IPC), תאים עמודים (PC), ותאים של Deiters (DC). בר לגודל (ב ') חל על (א').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח פנימי: האוזן הפנימית העכבר מתפתחת placode otic בשבוע הראשון של פיתוח postimplantation 12,13. ביום העוברית 9.5 (E9.5), placode יש invaginated ו morphed לתוך שלפוחית מלא נוזלים הנקרא otocyst 2. מבשרי Otic ב שלפוחית להצמיח תאים תחושתיים nonsensory בתוך האוזן הפנימית בוגרת כמו גם נוירונים innervate תאים שיער רגישים מכני epithelia חושית שיווי המשקל ואת השמיעה. בשלבים עובריים המאוחרות, מורכב, 3 ממדי המורפולוגיה של מבוך קרומי של האוזן הפנימית היא הוקמה 3,12. רווח, והפסד של תפקודי שיטות ניסיוניות מבוצעות בדרך כלל על ידי transgenesis העכבר כדי לקבל תובנות לגבי רגולציה הגנטי של תהליכים התפתחותיים כגון מפרט התא גורל היווצרות דפוס. מניפולציה גנטית דינמי של האוזן הפנימית העכבר פיתוחברחם מייצג גישה חינם ל transgenesis העכבר שזוגות העברת טכניקות גנטיות עם העכבר ניסיוני אמבריולוגיה 6,11.
וירוס-and electroporation בתיווך העברת טכניקות גנטיות פותחו כדי לתפעל ביטוי גנים האוזן הפנימית פיתוח 6,11,14,15. Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) וקטורים להדביק אבות otic כי להצמיח סוגי תאים תחושתיים nonsensory ו שימשו כדי לחקור את הבסיס המולקולרי של exocytosis סידן תלוי בשיער בתאי עכבר 16. וקטורים AAV לייצר titers גבוהה המאפשרים ביטוי רחב באוזן הפנימית קפסיד ויראליים שונים להציג זיקה ייחודי עשוי להיות יתרון עבור ביטוי הסלולר ההפרש. החסרונות כוללים יכולת דחיסת קבועה שמגבילה את גודל הגן שניתן misexpressed ואת הדרישה המומחיות virological לעשות, לטהר, ולא כייל את הוירוסים. Electroporation בתיווך גן TRansfer נעשה שימוש כדי לבחון את התפקיד של גורם הסליל לולאה בצורת סליל בסיסית שעתוק של ציון גורל חושית תא שיער in vivo 6. פלסמידים ביטוי המותאמים לטכנולוגיה subcloning Gateway לאפשר בנייה מהירה ויעילה של וקטורים עם מקדמי ייחודיים נהיגה הבעת עניין של גנים לבין חלבון סמן פלואורסצנטי מתוך רצף IRES 17. גנים של עניין יכולים לבוא לידי ביטוי מבשרי otic תוך 24 שעות של electroporation והביטוי יכול להימשך באוזן הפנימית לאחר הלידה בהתאם למקדם בשימוש. הבנייה טיהור פלסמיד, ריכוז, quantitation דורשים תקן רק מיומנויות ביולוגיים מולקולריים. החסרונות כוללים ירידה ביעילות transfection vivo עם העלייה בגודל פלסמיד מעל 8KB ~ ושיעור גבוה יותר של עוברי הקטלניות בהשוואה וקטורים ויראליים ביותר. שניהם electroporation ו בתיווך וירוסים הגן טכניקות העברת דורשים שליטה בעכבר ניסיוני העוברית טקniques: ניתוח הישרדות, במניפולציה של עוברים ברחם, ולאחר microinjection transuterine. מטרתו של כתב היד הזה הוא להתייחס לנושא האחרון על ידי הוכחת כל צעד מתודולוגית ביקורתית על ידי מיקרוסקופ וידאו דיגיטלי.
הערות מתודולוגיות על וידאו: אנחנו בכוונה בחר שלא לעטוף את אתר החתך עם השדה הסטרילי בזמן הצילומים כל כך הצופה יכול לראות את מיקומו של קו האמצע הגחון ביחס האנטומיה ברוטו של הסכר, כלומר, ראש (מטושטש בכוונה ביותר מסגרות אבל מוכרת), גפיים, והזנב. כורכת את האתר חתך חוסם ביעילות את הדעה הזאת יכולה לבלבל המאמצים להעריך יחסים אנטומיים רלוונטיים מרחבית במהלך laparotomy הגחון ועל רצף ההזרקה. עם זאת, מומלץ לכרוך את הבטן של הסכר, כך שאר הקרניים מוחצן הרחם במגרש סטרילי לשמור asepsis כירורגית. בנוסף, אנחנו בכוונה לא ניסו השדיםtrate של תפירת חתכים כירורגיים בקיר עור הבטן כי שיטות אלה יש ללמוד על ידי הדרכה מקצועית של וטרינר או טכנאי מוסמך כירורגית. ד"ר מרסל א Perret-ג'נטיל (אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו), מציג דיון מעולה של נושא זה, יחד עם ייצוגים ציוריים, בכל דפי המידע שלו, "עקרונות תפירת וטרינרית". 18
המלצות פרוצדוראליות: העברת גנים לאוזן העכבר פיתוח פנימי הוא מאתגר מבחינה טכנית. יש שורה של נהלים מומלצים אשר לחסל כמות משמעותית של השונות ולהבטיח תוצאות טובות. אנחנו עושים את המלצות ספציפיות שלהלן כדי להקל על למידה זו גישה ניסויית.
התייעץ עם צוות וטרינרי לפתח הישרדות העכבר ניתוח חיים פרוטוקול טיפול: טיפול בבעלי חיים פרוטוקול לניתוח הישרדות יונקים דורשת לייצר מאזהטיפול, הרדמה שיכוך כאבים, ו perioperative יש להגדיר ומתואם. לדיון מפורט של פיתוח פרוטוקול טיפול בבעלי חיים, כולל שפה שעשויה להוות את גרעין פרוטוקול של המבקש, ניתן כמידע משלים (ראה " טיפול בבעלי חיים פיתוח פרוטוקול "). בנוסף, טיפול בבעלי חיים במוסדות הביתה 'שלך ועדת שימוש (IACUC) וצוות וטרינרי יהיה ללא ספק לספק הדרכה נוספת על ניסוח של פרוטוקול מתאים על פי דרישה.
להקים עכבר ייעודי הישרדות באזור ניתוח של העברת גנים ברחם: laparotomy הגחון הוא מסווג ניתוח גדול, כי זה פוגע חלל הגוף. רוב IACUCs לא ידרוש סטרילית, סביבת הכיתה 100 לניתוח העכבר גדול הישרדות. במקום זאת, באזור ייעודי הכולל תאורה ראויה, וונטירח, חימום משלים, וקשה, שאינו נקבובי, משטחים disinfectable סביר להניח שיהיה צורך. אנחנו מעדיפים לבצע ניתוח ההישרדות שלנו מכסה המנוע זרימה למינרית אופקי המגן על העכבר מפני זיהום, מפחיתה מתח פיזיולוגי, ובכך מתקני התאוששות לאחר הניתוח. הגדרנו סדרה של שינויים מותאמים אישית כדי תנודה, דיכא, מכסה מנוע אופקי זרימת למינרית (630 Envirco LF) הכוללים כיוונית, זרם חשמלי נמוך הלוגן תאורה מסלול: מעגלי חשמל מורחבת לציוד הגן העברת הכוח, ואת שקעי חשמל הפסקה עם מגזרות העליון הספסל למעבר כבל. סכמטי מפורט של שינויים אלה הוא כאמור מידע משלים (ראה " זרימה למינרית הוד העברת גנים ברחם "). להתייעץ IACUC שלך כמו שאתה לפתח טיפול בעל החיים שלכם פרוטוקול להגדיר מיקום מתאים זה מוקדש אך ורק העכבר survival הניתוח.
לשקול את הסכר גרם 0.1 הקרוב ביותר לפני מתן הרדמה נתרן pentobarbital: נתרן pentobarbital היא הרדמה יעילה יספק לפחות 105 דקות של זמן עבודה כאשר לוח הזמנים של המינון המומלץ אחריו. קביעת משקל גוף מדויק של סכר זה לפני חישוב המינון של תערובת להזריק חומר הרדמה. אף פעם לא מעריכים משקל גוף הסכר. להשתמש במזרק אלרגיה מגש מחט המזרק מתוך בקטון Dikison: שפוע intradermal האדם הוא אידיאלי עבור זריקות intraperitoneal atraumatic לעכברים בהריון. יתר על כן, מזרק זה יש נפח נמוך מאוד שטח מת הוא מכויל למגוון של כרכים הרדמה הדרושה בדרך כלל סכרים אשר עוברים נמצאים E11.5 או E12.5.
לפרוס כאבים מניעתי לתמוך הישרדות העוברית: ניהול הרדמה מקומית על קו תפר, כגוןBupivicaine, ו מערכתית, ללא סטרואידים נגד דלקת התרופה, כגון Meloxicam, לקראת הצבת סכר בכלוב התאוששות כך משככי כאבים כי הם על הלוח כאשר הסכר מתאושש מן ההרדמה. צמצום אי נוחות הסכר מקלה על ההחלמה לאחר הניתוח ותחזוקה של הריון בריא.
Microinjection שפוע בטפי להחדרת נוזלים בחוזקה להגביל את קוטר חיצוני: הסיבה השכיחה ביותר של הקטלניות העוברית היא רקמה ו / או נזק בכלי הדם של בטפי להחדרת נוזלים microinjection שנבנו בצורה גרועה. Microinjection Transuterine לתוך העכבר E11.5 otocyst נושא אילוצים שונים מאשר זריקה לתוך איברים גדולים יותר עוברים מבוגרים (כלומר, שלפוחית מוח, עיניים, גפיים וכו '). Unbeveled, משופעים גרוע, או בלתי הולם בטפי להחדרת נוזלים גדולות קוטר חיצוני יגרום דימום מכלי ברחם, שק חלמון הקרביים בכלי הדם, ו / או העובר על E11.5, אשר להפחית הישרדות העוברית. אפשרלמסור, לשבור בטפי להחדרת נוזלים עמידים של קוטר קטן שנושאים שיפוע מתאים, אבל קשה לעשות זאת באופן שגרתי. עובר העכבר E11.5, אשר זעיר otocyst הוא היעד, תהיה סלחנית. להתייעץ P-1000 P-97 Cookbook פיפטה 2011 ממכשירים סאטר לשיח מלא על פיפטה העיצוב ואת ייצור 19. פרמטרים עבור בטפי להחדרת נוזלים המשמשים בעבודה זו הם כאמור ייצור שלהם נדונה באופן מלא קודם לכן 11. הביאורים פרוצדורליים במדריך של הבעלים של beveler מכשירים BV-10 סאטר גם משאב מצוין.
להבין מדוע Mistargeting otocyst ידי microinjection transuterine מתרחשת: וידאו מציג את התוצאה האידיאלית microinjection transuterine אל E11.5 ו E12.5 otocyst. Mistargeting otocyst בדרך כלל תוצאה של הזרקה שטחית מדי, עמוק מדי, או מפוברק בטפי להחדרת נוזלים כהלכה. איור 2 מדגים תנאים אלו. לוחמראה נוף לרוחב של הצד השמאלי של העובר E12.5 צילמו ידי שקוף לאחר microinjection transuterine מוצלחת של פתרון ירוק מהר לתוך otocyst. למוח האחורי (HB) מופיעה הגב בצורת טריז חריץ כדי otocyst. העין (ה) יש annulus של פיגמנט יחד הפריפריה שלה forelimb שמאל בולט. המטען העיקרי של וריד בראש הראשי (phv) הוא מתחת otocyst. Otocyst מלא ירוק מהר המופיע שחור: הגב, צינור endolymphatic (ED) ואת המבוא של otocyst (OC) ניתן להבחין. מיקוד מוצלח של otocyst E11.5-12.5 תמיד להציג צינור endolymphatic להבחין בבירור הפרוזדור. לוח "מראה את התמונה זהה ללא סימון לבן כדי להקל על סקירה ביקורתית של otocyst מוזרק.
איור 2. מדריך מצולם ל Mistargeting otocyst ידי transuterine microinjection. לוחות כל להציג את התצוגה לרוחב השמאלי של העובר E12.5 עם המוח התיכון מעלה המוח הקדמי השמאלי, מלבד לוח H, שהוא צפה הגב האזור למוח האחורי, המוח התיכון. לוחות בכל שורה מייצגים תמונות של העובר אותו. ראה את הדיון להסבר מפורט של הגורמים Mistargeting otocyst. קיצורים: דואר, עינו השמאלית; אד, endolymphatic צינור; מהשדה, מהיר ירוק, HB, למוח האחורי;, lb איבר ניצן; OC, otocyst: OT, בשטח otic, p, פיפטה, phv, הוריד את הראש העיקרי, PT, בקצה הצינורית.
הזרקה שטחית היא גורם שכיח Mistargeting. לוחות להיות להפגין הזרקת שטחית לתוך E12.5 conceptus. (HB) למוח האחורי חריץ והשטח otic (OT, עיגול) ניכרים בתצוגה זו, שמאלה לרוחב. פיפטה microinjection (p) הוא בקדמת הבמה. מהיר ירוק (FG) מתחיל להוציא מן הקצה פיפטה (ב '), עם פולסים עוקבים של לחץ ההזרקה (CD), מפזרת את צבע לתוך צורה סגלגלה. חלוקת הדואר צבע מצביע על כך זה הוצג בין דופן הרחם ואת חלמון שק הקרביים, extraembryonic קרום העוטף את חלל exocoelomic. הניסוי לא צריך לנסות מחדש למקד otocyst העובר הזה, אבל צריך לעבור את העובר הבא. זריקות מרובות לתאם עם הישרדות עובריים ירד, למעשה, כי הוא חמור יותר מאשר E11.5 E12.5.
הזרקת עמוק הוא הסיבה השכיחה יותר של Mistargeting. לוחות FH להפגין מסלול הזרקת שעובר דרך טריטוריה otic לתוך למוח האחורי. הוריד את הראש הראשי (phv), עינו השמאלית (ה), ו פיפטה (p) ניכרים בתצוגה זו רוחבי של העובר E12.5. פליטה מהירה ראשונית של ירוק (FG) מוחלפת dorsally לגבי וריד בראש העיקרית / שטח otic. עם פולסים עוקבים, למוח האחורי בצורת טריז (HB) היה מלא לחלוטין עם ירוק מהיר (לוח ז). סיבוב של 90 מעלות העובר הזריק המאפשרת איתור מהיר של ירוק בתוך hindbraבחלל מהעין הגבי (לוח ג). גם זריקות שטחי ועמוק מכך מחוסר היכולת לתפוס את עומק פיפטה microinjection אחרי שהוא יוצר מגע עם הרחם. גישה מעשית שעובדת גם היא לקדם את הצינורית דרך הרחם ומיד הדופק פעם לחפש עלים ירוק מהיר: מיקומו של עלים מציין את המיקום המשוער של קצה פיפטה. התאמת עומק מבוסס על הדופק טווח ממצא זה.
בטפי להחדרת נוזלים מפוברק כראוי הם הגורם השכיח ביותר של Mistargeting. ניסיון זריקה שמוצג לוחות IK נערך עם קצה פיפטה כי נשבר באופן ידני, אבל לא משופעים. מבט רוחבי של העובר E12.5 מראה למוח האחורי (HB), עינו השמאלית (ה), ו פיפטה microinjection (P). ראוי לציין, כי קצה פיפטה (PT) הוא מורכן בחדות לא הצליחה לחדור את הרחם (לוח א '). הפעלה של כוח נוסף של המספריים קצה פיפטה (לוח י ', חץ), והשאיר את ה-PIPette עצה מוטבע ברחם. כמות קטנה של מהירות ירוק (FG) נפלט מן טפטפת שבורה והוא זיהה את פני השטח של הרחם. פיפטה משובץ עצה (לוח K) יש להסיר, עם מלקחיים עדינים סטריליים ו מושלך כפסולת מכשירים חדים. אם קצה פיפטה שלא ניתן לאתר או אף להסיר בהצלחה, להרדים את הסכר תחת הרדמה.
לתעד את התצפיות פרוצדורליים על גיליון הישרדות העכבר ניתוח נתונים: מרכיב חיוני ללמוד שיטות אלה הוא לתעד את התצפיות ולבצע התאמות על סמך תצפיות אלה. לייצר ההישרדות העכבר ניתוח גיליון הנתונים וציין מידע לפני הניתוח, הניתוח, ולאחר הניתוח. הנתונים כוללים במשקל לפני הניתוח הסכר, מנה של חומר הרדמה נמסר, מוזרק פלסמיד ועוד נתונים תפעוליים כוללים המוזרק העובר (כלומר, R2 הוא עובר 2 מהשחלה בקרן הרחם מימין), איכות הזריקה (כלומר, לא endolymphatic צינור מזוהה, צבע ב 4
השימוש הנוכחי נמסר לכל הדופק כדי לייעל את נצילות transfection: הרכבת בכיכר הדופק גל מורכב, 5 43volt, 50msec פולסים עם בין 950msecעיכוב הדופק. פלטינה 5 מ"מ, סגנון אלקטרודות ההנעה להבטיח כי השטח otic כולו בתוך השדה החשמלי. יעילות transfection דומים ניתן להשיג עם משוטים 3 מ"מ, אם כי קשה יותר למקם במדויק. הפרדיגמה הדופק היה מותאם על ידי הערכת הנוכחי הועבר העובר במהלך הדופק של דבר, לא על ידי גורף באמצעות מתח והערכת יעילות transfection. הרציונל הוא כי נמסר הנוכחי לכל הדופק משתנה במתח מתמיד בהתאם patency של צימוד חשמלי בין הרחם אלקטרודות פלטינה. בהנחה כי הרחם הוא שלחין טרי עם פתרון של רינגר לקטט מיד לפני הנחת המשוטים, דמי הספק קיים עודף, המשתנה העיקרי הוא כמות הלחץ "צימוד" להחיל את הרחם עם המשוטים. לחץ עדין על תוצאות 43volts ב 60mAmps <של transfection נמסר סדירה הנוכחי במקרה הטוב. לחץ מתון על 43vOLTs תוצאות 60-100mAmps נמסר transfection היעילה ביותר. לחץ כבד על תוצאות 43volts ב> 100mAmps נמסר וקושרת עם קצב הלב משתנה בהתמדה גדל הקטלניות העוברית. לחץ מוגזם נקרע שק חלמון הקרביים ("פופ" ניתן היה באמצעות המשוטים) וגורם הקטלניות העוברית. סביר להניח כי הלחץ משתנה להחיל משנה את העכבה בין אלקטרודות אשר משפיע על הנוכחי נמסר. תדירות הדופק של 1Hz (1 50 msec הדופק לשנייה) הוגדר משבש לפחות למחזור הלב של העובר, שהוא חיובי לקשר בין הישרדות העוברית. אנו מסיקים כי הפרמטר החשוב ביותר כדי לפקח על הקמת יעיל הפרדיגמה electroporation vivo הוא הנוכחי נמסר לכל הדופק. שינוי פרדיגמה בכל הדופק צריכה לכלול מעקב צמוד של זרם נמסר לכל הדופק.
לאמץ גישה מודולרית ללימוד הטכניקת ה ': מודול 1: תרגול ניתוח דמה עם החצנה הרחם, אבל לא להזריק או electroporate. סכרים לסבול laparotomy הגחון טוב מאוד ואף פעם לא צריך לחוות סיבוכים אחרי ניתוח הקשורות טכניקה כירורגית. הישרדות עכבר מיומנויות כירורגיות הם ללא ספק תושב במוסד הביתה כדי להמשיך הכשרה מתאימה. להגיע לשליטה במיומנויות כירורגיות לפני שתמשיך. מודול 2: microinjection עיסוק transuterine אל otocyst על הסכר הרדים ללא ציפייה השלמת ניתוח הישרדות: להרדים את הסכר תחת הרדמה, לבודד את העוברים מוזרק, ולהעריך את איכות זריקות otocyst. מודול 3: רק 2 היעד otocysts ב 2 עוברים שונים עם ירוק מהיר, לא electroporate, להשלים את הניתוח, ולאמת הישרדות עובריים במורד הזרם. מודול 4: רק 2 היעד עוברים עם ה-DNA / ירוק פתרון מהיר, electroporate, לאמת הישרדות עובריים במורד הזרם, ולברר transfection EFficiency. מודול 5: רק 2 היעד עוברים עם ה-DNA / ירוק פתרון מהיר, electroporate, להזריק Alexa פלואוריד לתוך החדר 4 ה לתייג עובר מניפולציות, בחר עוברים המסומנים ב P0, וכן לקבוע יעילות transfection.
עקומת למידה פרוצדורלית: שליטה של הישרדות טכניקות העכבר ניתוח, עם הדרכה מתאימה מצוות וטרינרית כירורגית של המוסד בביתו של אחד, היא מהירה למדי, צריך רק דורשים 3-5 סכרים בשווי של אימון למתחילים כדי לקבל מומחיות. Microinjection Transuterine וב electroporation vivo ליצירת האוזניים הפנימיות transfected מועילה ידרוש 10-50 סכרים, שווה מאמץ, בהנחה שיש 6 עוברים עביד בכל ההריון לבין גישה מודולרית אחריו. אותם סטודנטים אשר נהנים מפעילויות הדורשות מוטוריקה עדינה (כלומר, נגינה, תפירה, בניית דגמים, או אתלטיקה תחרותיים) יש תקופות אימונים קצרים יותר מאשר אףSE שלא. את וקושרת קריטיים עבור שליטה מוצלח של שיטות אלו תשומת לב קפדנית לכל פרט (כלומר, microinjection פיפטה ייצור, האנטומיה של כלי דם, לב מפורשת נטילת) ועל התנהגות רגועה למדי.
זרימת עבודה: מומחיות פעם הוא זכה, ניתן לצפות הזרקת ו electroporating 4-6 עוברים בכל הסכר, 3-5 עוברים יהיה לשרוד; ו 2-4 ועוברים יהיה מועיל transfected האוזניים הפנימיות לצורך ניתוח. Alexa למוח האחורי פלואוריד טכניקה תיוג כדי תווית עוברים למיון בלידה דורש הזרקה למוח האחורי נוסף עובר כל electroporated, אבל זה נסבל היטב אינה משפיעה לרעה על היעילות הדיונית. לפיכך, קצב ההתאוששות של האוזניים הפנימיות transfected מועילה מ ב electroporation vivo משווה בחיוב קצב ההתאוששות של עכברים שעברו מוטציה הומוזיגוטים מן הפרדיגמה גידול heterogygous. עם ניסיון, 2-3 סכרים בכל הנסיין בכל יום היא עבודה סבירהזרימה: 1.5 שעות לכל סכר על ניתוח כולל של 1.5-2 שעות לניטור שלאחר הניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים לחץ הומנה רשות לפרסם פיפטה microinjection ייצור דמות אשר הופיע במקור בעמוד 130 התייחסות 11, לארי Dlugas וסטיבן וונג, OHSU החוג לתקשורת חינוך, על videography, לארי Dlugas לעיצוב וידיאו ועריכה: אדם מ O "קווין, מעצב בכיר, Trion / Envirco לעיצוב מותאם אישית זרימת אופקי שלנו למינרית מכסה המנוע Les גולדסמית למתן סכמטי טכני; ויקטור Monterroso, MV, MS, PhD וטום Chatkupt, DVM, OHSU המחלקה לרפואה השוואתי, עם הדרכה שלנו בעלי חיים פרוטוקול טיפול, טכניקות כירורגיות, ו מניעתי כאבים משטר, מרסל Perret-ג'נטיל, DVM, MS, לשיתוף דף מידע על טכניקות תפירת וטרינריים, אדוארד מפורסוב, MS, לעיצוב Adobe Premiere שלנו במיקרוסקופ Pro תחנת עבודה וידאו במחשב, ולאה הלבן ג'ונאס הינקלי של LNS captioning (פורטלנד, או). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות otheR-להפרעות בתקשורת: DC ו DC R01 008595 008595 R01-04S2 (כדי JB) ו - p30 DC005983 (אורגון שמיעה מרכז המחקר Core גרנט, פיטר גילספי, החוקר הראשי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
