Summary
L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo uno
Abstract
L'orecchio interno dei mammiferi ha 6 epiteli sensoriali distinti: 3 creste in ampolle dei canali semicircolari, macule nel utricolo e sacculo, e l'organo del Corti nella coclea a spirale. Le creste e macule contengono cellule ciliate vestibolari che trasducono stimoli meccanici per la pongono al servizio della speciale senso di equilibrio, mentre le cellule uditive dei capelli in dell'organo del Corti sono i trasduttori primari per l'audizione 1. Il destino specifica cella in questi epiteli sensoriali e morfogenesi dei canali semicircolari e la coclea hanno luogo durante la seconda settimana di gestazione nel topo e sono in gran parte completati prima della nascita 2,3. Studi sullo sviluppo dell'orecchio interno del mouse sono regolarmente condotti da raccolta embrioni transgenici in diverse fasi embrionali o post-natale al fine di conoscere le basi molecolari di cellulare e / o morfologica fenotipi 4,5. Ipotizziamo che il trasferimento del gene per l'orecchio interno del mouse in via di sviluppo in utero </ Em> nel contesto di guadagno-e la perdita di funzione studi rappresenta un approccio complementare alla transgenesi mouse tradizionale per l'interrogatorio dei meccanismi genetici alla base dei mammiferi lo sviluppo dell'orecchio interno 6.
Il paradigma sperimentale per condurre studi misexpression gene nel topo in via di sviluppo dell'orecchio interno dimostrato qui si risolve in tre fasi generali: 1) laparotomia ventrale; 2) microiniezione transuterine e 3) elettroporazione in vivo. Laparotomia ventrale è una tecnica di sopravvivenza del mouse che permette di esternalizzazione chirurgica dell'utero per accedere sperimentale per gli embrioni impiantati 7. Microiniezione Transuterine è l'uso di smussati, micropipette capillari di vetro per introdurre plasmide di espressione nel lume della vescicola otica o otocyst. In vivo elettroporazione è l'applicazione di onda quadra, diretti impulsi di corrente per guidare l'espressione plasmidico in 8-10 cellule progenitrici.
11. Mouse tecniche sperimentali embriologici può essere difficile da imparare dalla prosa e immagini fisse da solo. Nel presente lavoro, dimostriamo i 3 passaggi della procedura di trasferimento genico. La maggior parte critica, abbiamo distribuire microscopia video digitale per mostrare con precisione come: 1) identificare l'orientamento dell'embrione in utero, 2) riorientare embrioni per il targeting iniezioni al otocyst; 3) microinject DNA miscelata con una soluzione tracciante colorante nella otocyst al giorno e 11,5 embrionali 12,5; 4) elettroporare il otocyst iniettato; e 5) embrioni etichette elettroporate per la selezione post-natale alla nascita. Forniamo esempi rappresentativi di successo trasfettate orecchio interno, di una guida pittorica per le cause più comuni di mistargeting otocyst, discutere su come evitare i più comuni errori metodologici e attuali orientamenti per la scrittura di un utero in gene trasferimento degli animali protocollo di cura.
Protocol
1. Laparotomia ventrale
- Anestetizzare una diga i cui embrioni sono al giorno embrionale 11,5 (E11.5, a mezzogiorno del giorno viene rilevata una spina vaginale è il giorno 0,5 dello sviluppo embrionale) mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di sodio pentobarbital anestesia (7,5 pl per grammo di peso corporeo). Soluzione di lavoro anestetico: 180 pl di 50 mg / mL di sodio pentobarbital, 100 pl di etanolo assoluto, 320 pl di 65 mg / ml di solfato di magnesio acquoso (modula tono uterina), e 400 pl di glicole propilenico (miscibile veicolo acquoso e organico componenti).
- Valutare la completezza di anestesia effettuando prove di stimoli nocivi: squeeze zampa; risposta e lampeggiano al tocco sulla guancia e vibrisse; pizzico coda. Applicare una pomata oftalmica sterile per le cornee.
- Accorciare il pelo addominale dalla zona sovrapubica alla gabbia toracica, con forbici e una lama fine (Oster # 40 della lama). Disinfettare l'addome con il 70% etanolo, 10% di iodio povidone (Betadine), unnd etanolo al 70%, sequenzialmente. Luogo del mouse addome rivolto verso il basso su un telino sterile e quindi impostare su una piastra elettrica o piatto caldo (37 ° C) per 2-5 minuti.
- Incidere la cute addominale sulla linea mediana ventrale con palla punta forbici. Estendere l'incisione di 10-14 mm. Identificare la linea alba, uno avascolare, fascia bianca tessuto connettivo lungo la linea mediana ventrale della parete addominale. Incidere la linea alba con palla punta forbici ed estendere il 10-14 mm incisione. Lavare immediatamente con l'addome preriscaldato (37 ° C), Ringer lattato soluzione.
- Esternalizzare i due corni dell'utero con una pinza ad anelli senza applicare una pressione eccessiva sui siti di impianto. Irrigare le corna uterine esternalizzati con preriscaldata, soluzione di Ringer lattato.
2. Microiniezione Transuterine
- Realizzare una parete spessa, borosilicato pipetta microiniezione capillare di vetro, con le seguenti caratteristiche: 12-16 μm diametro esterno ed uno smusso 20 gradi. Su un P-97 Sutter estrattore pipetta con filamento piccola scatola, utilizzare il seguente programma: calore = test di rampa più 3 unità; pressione = 200; tirare = 0; velocità = 46; tempo = 100). Con il BV-10 Beyeler Sutter, utilizzare la 104C (oro) disco abrasivo per pipette di grande diametro. Risospendere plasmide di espressione a 3-4 pg / pl in fosfato di calcio libero soluzione salina tamponata (pH 7,2-7,4). Aggiungi cristallino verde veloce al DNA concentrato, vortex delicatamente per 30 secondi, e far girare a 10.000 g per 10 secondi. La quantità minima di verde veloce necessaria per seguire visivamente l'efficacia dell'iniezione viene determinato empiricamente. La pipetta in sostegno degli smussato con il DNA / fast soluzione verde. Collegare la pipetta caricato microiniezione al titolare pipetta della pressione dell'iniettore (Picospritzer con> 99% di azoto puro come fonte di gas).
- Transilluminate l'utero a bassa intensità, luce alogena per visualizzare l'embrione all'interno del suo sito di impianto. Identificare il beating cuore, vescicole cerebrali, gemme degli arti, nascente 4 ° ventricolo del cervello posteriore, e gli occhi. Irrigare l'utero ogni 2 minuti con preriscaldata e soluzione di Ringer lattato per mantenere l'idratazione. Applicare una leggera pressione sull'utero di riorientare l'embrione e identificare i punti di repere anatomici di cui sopra.
- Orientare l'embrione per identificare la vena principale cui testa anteriore e posteriore fianco rami del territorio mesenchimali in cui il otocyst risiede. Il otocyst appropriato non può essere visto da transilluminazione dell'utero. Il otocyst si trova a metà strada tra i rami anteriore e posteriore della vena testa primaria che, insieme al tronco principale della vena, formare la forma dei montanti o pali su un campo di football americano. Il otocyst è a metà strada tra i montanti.
- Inserire la pipetta iniezione attraverso l'utero in una traiettoria in linea con la posizione del presunto otocyst. Pulse il microiniettore volta dopo aver attraversato il uterci visualizzare il colorante tracciante e il approssimare la posizione della punta della pipetta. Far avanzare la pipetta sotto controllo micrometro e pulsare di nuovo per valutare la profondità. Ulteriori avanzare la pipetta nel mesenchima laterale della testa e il polso più volte. Il targeting otocyst successo rivelerà la forma affusolata del condotto endolinfatico dorsalmente e capesante forma a conchiglia del vestibolo. Rilasciare la pressione sul utero, rimuovere la pipetta dalla dell'embrione / utero in un unico movimento, e subito irrigare l'utero con preriscaldata, soluzione di Ringer lattato.
3. Elettroporazione in vivo
- Irrigare l'utero con la soluzione di Ringer lattato. Soluzione appena applicato Ringer lattato è necessario accoppiare elettricamente la pagaia in stile elettrodi verso l'utero. Inumidire le superfici degli elettrodi di tungsteno con il Ringer lattato. Centro il otocyst iniettato nel percorso degli elettrodi. Delicatamente comprimere l'utero con il pa elettroporazioneddles. Il catodo è in contatto con la parete uterina laterale al otocyst iniettata e l'anodo è in contatto con la parete uterina adiacente alla otocyst non iniettati delle cavie. Attivare un quadrato treno di impulsi d'onda con l'interruttore a pedale sul elettroporatore. Parametri di elettroporazione sono: 5, 50 msec impulsi a 43 volt per impulso e 950 msec ritardo interpulso. Immediatamente irrigare l'utero dopo il treno di impulsi viene consegnato. Registrare la corrente erogata al tessuto: 60-100 mAmps è sufficiente per trasfettare progenitori epiteliali dell'orecchio. Iniettare e elettroporare 4-6, gli embrioni E11.5 per diga.
- Effettuare un secondo, microiniezione indipendente transuterine acquosa di destrano fluorescente (Alexa 488 se il plasmide di espressione codifica una proteina fluorescente rossa o Alex Fluor 594 se il plasmide di espressione codifica una proteina verde fluorescente) nel ventricolo 4 ° di tali embrioni cui interno orecchie accuratamente iniettato e almeno 60 mAmps di corrente per impulso era delivered durante l'elettroporazione. Il destrano fluorescente sarà rilevabile al momento della nascita nel cervello posteriore e consentire la selezione di cuccioli cui interno sono state manipolate le orecchie durante l'embriogenesi (vedi 3.5).
- Irrigare le corna uterine con il Ringer lattato. Reinserire le corna uterine nella cavità addominale. Sciacquare la cavità uterina con 2-4 ml di preriscaldata, soluzione di Ringer lattato e consentire l'overflow di drenare fuori dal sito di incisione sul telino sterile. Sostituire il drappeggio a secco, materiale sterile. Suturare la parete addominale con un non-taglio ago e un 6-0 sutura riassorbibile. Si preferisce un filza, bloccando ogni punto altro, sia per la parete addominale e la pelle.
- Asciugare fur le dighe 'e amministrare un non-steroidei anti-infiammatori come il Meloxicam per iniezione sottocutanea. Riportare la diga per la gabbia di recupero preriscaldata in un telino sterile. Monitorare e registrare le respirazioni dighe ", sito pervietà dell'incisione e della vagina per lo scarico di sangue. Il sanguinamento è rari, ma se presente e senza sosta, l'eutanasia la diga, mentre lei è ancora sotto anestesia. Nota: il momento in cui riprende conoscenza e tenta di deambulare. Riportare la diga per la colonia del mouse quando mostra segni di mangiare e bere e ha iniziato a costruire il nido. In genere, questo si verifica entro 12 ore.
- Alla nascita (postnatali giorno 0), il flash della regione rombencefalo di ogni pup nella lettiera per rilevare la fluorescenza destrano utilizzando un microscopio stereofluorescence dissezione con GFP o Texas Red filtro impostato a seconda dei casi. Ritorna alla diga di allattamento solo i cuccioli che visualizzano l'etichettatura rombencefalo.
4. Risultati rappresentativi
Figura 1. Elettroporazione trasferimento genico mediato alla coclea sviluppo. La otocyst E11.5 stato iniettato un plasmide di espressione codifica maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) ed elettroporati (impulsi TRAnei parametri: cinque, 43 impulsi volt a 50 msec / impulsi e 950 msec di ritardo interpulso). A) Un orecchio rappresentante interno da un giorno postnatale 6 (P6) cucciolo otocyst cui è stato iniettato e elettroporate E11.5 a dimostrare l'espressione EGFP dalla base attraverso il turn centro della coclea. La parete laterale della coclea è stato rimosso dal mezzo giro e solo apice. E11.5 progenitori che danno origine al vertice non sono state trasfettate. B) mount intero immunocolorazione della coclea in (A) con il marcatore delle cellule dei capelli, 7a miosina (MYO7A), indica che l'espressione EGFP segue la traiettoria dell'organo del Corti ed è grossolanamente localizzato l'epitelio capelli cellula portante sensoriale. C) Un orecchio rappresentante interno da un embrione E18.5 otocyst cui è stato iniettato e elettroporate a E11.5. La proiezione laser confocale dimostra espressione EGFP in MYO7A-positivi cellule ciliate sensorie. D) la proiezione laser confocale dell'epitelio cocleare sensoriale dell'organo del Corti E18.5 indicando EGFP expression nelle cellule ciliate interne (IHC), le cellule ciliate esterne (OHC), le cellule interne phalangial (IPC), cellule pilastro (pc), e le cellule Deiters '(dc). La barra della scala in (B) si applica a (A).
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Discussion
Trasferimento del gene per l'orecchio del mouse in via di sviluppo interno: L'orecchio interno del mouse si sviluppa dalla placode otic durante la prima settimana di sviluppo post-impianto 12,13. Di giorno embrionale 9.5 (E9.5), il placode ha invaginato e trasformato in una vescicola piena di liquido chiamato otocyst 2. Precursori Otic in vescicole dare origine alle cellule sensoriali e nonsensory all'interno dell'orecchio interno matura così come i neuroni che innervano le cellule ciliate meccanicamente sensibili nel epiteli sensoriale di tipo uditivo e vestibolare. Alla fine del stadi embrionali, il complesso, 3-dimensionale morfologia del labirinto membranoso dell'orecchio interno è stabilito 3,12. Guadagno e perdita di funzione modalità sperimentali sono in genere eseguita da transgenesi del mouse al fine di conoscere la regolazione genetica dei processi di sviluppo, come specifica il destino delle cellule e la formazione di pattern. Dinamica manipolazione genetica dell'orecchio topo in via di sviluppo internoutero rappresenta un approccio complementare alla transgenesi del mouse che le coppie le tecniche di trasferimento genico con il mouse dell'embriologia sperimentale 6,11.
Virus e elettroporazione-mediate tecniche di trasferimento del gene sono state sviluppate per manipolare l'espressione genica in via di sviluppo orecchio interno 6,11,14,15. Virali adeno-associati (AAV) vettori infettare progenitori dell'orecchio che danno origine a tipi di cellule sensoriali e nonsensory e sono stati utilizzati per interrogare la base molecolare di calcio-dipendente esocitosi in cellule pilifere topo 16. Vettori AAV producono alti titoli che consentono l'espressione ampia nella parte interna dell'orecchio e diversi sierotipi virali visualizzare tropismo unico che può essere vantaggioso per l'espressione differenziale di cellulare. Gli svantaggi comprendono una capacità fissa ripieno che limita la dimensione del gene che può essere misexpressed e l'esigenza di competenza virologica fare, purificare, e titolo i virus. Elettroporazione-mediata gene transfer è stato utilizzato per valutare il ruolo di una base helix-loop-elica fattore di trascrizione in specificando sensoriale destino della cellula capelli in vivo 6. Plasmidi di espressione adatti per la tecnologia Gateway subclonazione consentire la costruzione rapida ed efficiente di vettori con promotori uniche guida l'espressione di un gene d'interesse ed una proteina marcatore fluorescente da una sequenza IRES 17. I geni di interesse possono essere espressi in precursori dell'orecchio entro 24 ore di elettroporazione e di espressione possono persistere nell'orecchio postnatale interno a seconda del promotore utilizzato. Costruzione plasmide, purificazione, concentrazione, e la quantificazione richiedono competenze molecolari unico standard biologici. Gli svantaggi sono diminuiti in termini di efficienza di transfezione vivo al crescere della dimensione plasmide sopra 8kb ~ e un tasso elevato di letalità embrionale rispetto alla maggior parte vettori virali. Sia elettroporazione e virus-mediate tecniche di trasferimento genico esigere la padronanza del mouse sperimentazione embrionale tecnologianiche: l'intervento chirurgico la sopravvivenza, la manipolazione in utero di embrioni, microiniezione e transuterine. L'obiettivo di questo manoscritto è quello di affrontare il problema quest'ultimo dimostrando ogni fase critica metodologica mediante microscopia video digitale.
Note metodologiche sulla video: Abbiamo volutamente scelto di non coprire il sito di incisione con il campo sterile durante le riprese in modo che il visitatore poteva vedere la posizione della linea mediana ventrale in relazione alla anatomia della diga, vale a dire, la testa (volutamente sfocata nella maggior parte frames, ma riconoscibili), gli arti e la coda. Drappeggi del sito di incisione blocca in modo efficace questo punto di vista e può confondere gli sforzi per apprezzare rapporti anatomici spazialmente rilevanti durante la laparotomia ventrale e una sequenza di iniezione. Tuttavia, si consiglia drappeggi l'addome della diga in modo che il resto esteriorizzata uterina corna su un campo sterile per mantenere asepsi chirurgica. Inoltre, volutamente non ha tentato di demonicentrare sutura delle incisioni chirurgiche della parete addominale e della pelle, perché questi metodi devono essere appresa da guida esperta di un veterinario o tecnico qualificato chirurgico. Dr. Marcel I. Perret-Gentil (Università del Texas a San Antonio), presenta una eccellente discussione di questo argomento, completo di rappresentazioni pittoriche, nel suo volantino, "Principi di sutura veterinaria." 18
Raccomandazioni procedurali: trasferimento di geni all'orecchio interno di sviluppo del mouse è tecnicamente impegnativo. Ci sono una serie di best practice che eliminerà una notevole quantità di variabilità e di garantire risultati di successo. Facciamo raccomandazioni specifiche qui sotto per facilitare l'apprendimento a questo approccio sperimentale.
Consultare il personale veterinario per sviluppare la sopravvivenza del mouse protocollo di intervento chirurgico cura degli animali: Il protocollo di cura degli animali per un intervento chirurgico la sopravvivenza dei mammiferi è esigente per produrre dalanestesia, analgesia, e perioperatorio devono essere definite e coordinate. Una discussione dettagliata di sviluppo protocollo di cura degli animali, compreso il linguaggio che può costituire il nucleo del protocollo del richiedente, viene fornito informazioni supplementari (vedi " Animal Cura Protocol Development "). Inoltre, Animal Care vostri istituti d'origine 'e Comitato uso (IACUC) e del personale veterinario sicuramente fornire ulteriori indicazioni sulla formulazione di un protocollo adatto su richiesta.
Istituire un apposito spazio di sopravvivenza del mouse in un intervento chirurgico per il trasferimento genico in utero: laparotomia ventrale è un annuncio di un importante intervento chirurgico, perché compromette una cavità corporea. La maggior parte dei IACUCs non richiede una sterile, classe 100 ambiente per interventi di chirurgia maggiore sopravvivenza del mouse. Piuttosto, un'area dedicata che comprende una corretta illuminazione, ventimento, riscaldamento supplementare, e duro, non porose, superfici disinfettabili saranno probabilmente necessari. Noi preferiamo condurre la nostra sopravvivenza intervento chirurgico in una cappa a flusso laminare orizzontale, che protegge il mouse dalle infezioni, riduce lo stress fisiologico, e quindi impianti di recupero post-operatorio. Abbiamo definito una serie di modifiche personalizzate ad un oscillazioni smorzate, cappa a flusso laminare orizzontale (630 Envirco LF) che includono direzionale, alogene a bassa potenza di illuminazione della pista; espanso circuiti elettrici al materiale trasferimento genico di potenza e prese di corrente da incasso con ritagli da banco passaggio per il cavo. Uno schema dettagliato di queste modifiche è fornito come informazioni supplementari (vedi " cappa a flusso laminare In Utero Gene Transfer "). Consultare il proprio IACUC come si sviluppa il protocollo di cura degli animali per definire una posizione adatta, che è dedicato esclusivamente al mouse survival chirurgia.
Pesare la diga con l'approssimazione di 0,1 grammi prima di somministrare l'anestesia pentobarbital di sodio pentobarbital di sodio è un efficace anestetico e fornirà almeno 105 minuti di tempo di lavoro quando il dosaggio consigliato è seguita. Determinare un peso corporeo accurato per ogni diga prima di calcolare la dose di miscela anestetico per iniettare. Mai una stima del peso corporeo diga. Utilizzare la siringa con ago e la siringa Allergy vassoio da Becton Dikison: lo smusso umana intradermica è ideale per atraumatici iniezioni intraperitoneali in femmine di topo gravide. Inoltre, la siringa ha un volume estremamente basso spazio morto ed è calibrato per la gamma di volumi di anestetico in genere richiesti per le dighe in cui gli embrioni sono E11.5 e E12.5.
Distribuire analgesia profilattica per sostenere la sopravvivenza embrionale: amministrare un anestetico locale sulla linea di sutura, come ad esempioBupivicaine, e sistemica, non-steroidei anti-infiammatori non steroidei, come il Meloxicam, prima di mettere la diga nella gabbia di recupero in modo che gli analgesici sono a bordo dal momento in cui la diga di recupero dall'anestesia. Ridurre il disagio nella diga facilita il recupero post-operatorio e la manutenzione di una gravidanza sana.
Conici pipette la microiniezione e saldamente limitano l'diametro esterno: la singola causa più comune di mortalità embrionale è un tessuto e / o di danno vascolare da pipette microiniezione mal costruite. Microiniezione Transuterine nel mouse E11.5 otocyst porta vincoli diversi da quello a iniezione in grandi organi dei vecchi embrioni (cioè, vescicole cervello, degli occhi, degli arti, ecc.) Unbeveled, poco smussati, o impropriamente grandi pipette diametro esterno provoca sanguinamento dai vasi in utero, il sacco vitellino viscerale vascolare, e / o l'embrione a E11.5, che diminuirà la sopravvivenza embrionale. È possibilea portata di mano-break pipette durevoli di piccolo diametro che portano uno smusso appropriato, ma è difficile farlo abitualmente. L'embrione di topo E11.5, il cui minuscolo otocyst è l'obiettivo, sarà spietato. Consultare il P-1000 P-97 Cookbook Pipette 2011 dal Instruments Sutter per un discorso pieno di pipette di progettazione e fabbricazione 19. Parametri per le pipette utilizzati in questo lavoro sono osservato sopra, la loro fabbricazione è stata ampiamente discusso in precedenza 11. Le note procedurali contenute nel manuale del proprietario per gli strumenti Sutter BV-10 Beyeler sono anche una risorsa eccellente.
Comprendere per quale motivo il mistargeting otocyst con microiniezione transuterine verifica: Il video presenta il risultato ideale per la microiniezione transuterine nel E11.5 e E12.5 otocyst. Mistargeting il otocyst deriva solitamente da iniettare troppo superficiale, troppo in profondità, o pipette adeguatamente fabbricati. La Figura 2 mostra queste condizioni. PannelloA mostra una vista laterale del lato sinistro di un embrione E12.5 ripreso da transilluminazione dopo il successo microiniezione transuterine di veloce soluzione di verde nel otocyst. Il rombencefalo (MP) appare come una forma di cuneo dorsale tacca verso otocyst. L'occhio (e) ha un anello di pigmento lungo la sua periferia e la zampa anteriore sinistra è prominente. Il tronco principale della vena testa primaria (PHV) è appena sotto il otocyst. Il otocyst è pieno di verde veloce che appare nero: la dorsale, condotto endolinfatico (ndr) e il vestibolo della otocyst (oc) possono essere individuate. Il targeting successo del otocyst E11.5-12.5 sarà sempre presente un condotto endolinfatico chiaramente distinguibile e vestibolo. Pannello A 'mostra la stessa immagine in A senza etichetta bianca per facilitare la revisione critica della otocyst iniettato.
Figura 2. Una guida pittorica mistargeting il otocyst da transuterine microinjeczione. Tutti i pannelli mostrano la vista laterale sinistra di un embrione E12.5 con mesencefalo e sinistra proencefalo, tranne il pannello H, che è una vista dorsale del rombencefalo-mesencefalo regione. Pannelli in ogni riga rappresentano immagini dell'embrione stesso. Vedi la discussione per una spiegazione dettagliata delle cause della mistargeting otocyst. Abbreviazioni: e, occhio sinistro, ed, endolinfatico condotta; fg, veloce verde, hb, romboencefalo, lb, arti boccio; oc, otocyst, ot, territorio otic, p, pipetta; PHV, la vena testa primaria; pt, punta della pipetta.
Iniezione superficiale è una causa comune di mistargeting. Pannelli ESSERE dimostrano una iniezione superficiale nelle E12.5 concepito. L'(HB) notch rombencefalo e il territorio otic (ot, cerchio) sono evidenti in questa sinistra, vista laterale. La pipetta microiniezione (p) è in primo piano. Veloce verde (fg) comincia a espellere dalla punta della pipetta (B), e con impulsi successivi dalla pressione dell'iniettore (CD), si diffonde colorante in un ovale-forma. La distribuzione dei thcolorante e suggerisce che è stato introdotto tra la parete uterina e il viscerale sacco vitellino, extraembrionali una membrana che avvolge la cavità exocoelomic. Lo sperimentatore non deve tentare di re-indirizzare la otocyst in questo embrione, ma dovrebbe passare per l'embrione successiva. Iniezioni multiple correlano con una ridotta sopravvivenza embrionale, un effetto che è più acuto rispetto a E11.5 E12.5.
Iniezione profonda è la causa più comune di mistargeting. Pannelli FH dimostrare una traiettoria di iniezione che passa attraverso il territorio otic nel rombencefalo. La vena testa primaria (PHV), l'occhio sinistro (e), e la pipetta (p) sono evidenti in questa vista laterale di un embrione E12.5. L'espulsione iniziale del verde veloce (fg) viene spostato dorsalmente rispetto alla vena testa primario / territorio otica. Con impulsi successivi, il cuneo rombencefalo (HB) era completamente riempita veloce verde (gruppo G). A 90 gradi di rotazione dell'embrione iniettato permette la rilevazione del verde preferenziale all'interno del hindbranella cavità dalla vista dorsale (pannello H). Sia risultato superficiale e profondo iniezioni dalla incapacità di percepire la profondità della pipetta microiniezione dopo fa contatto con l'utero. Un approccio pratico che funziona bene è quello di avanzare la pipetta attraverso l'utero e poi subito a pulsare una volta per cercare un soffio di verde veloce: la posizione del soffio indica la posizione approssimativa della punta della pipetta. Regolare la profondità sulla base di questo telemetria impulsi.
Pipette adeguatamente prefabbricati sono la causa più comune di mistargeting. Il tentativo di iniezione mostrata in pannelli IK è stato condotto con un puntale che è stata rotta manualmente, ma non smussato. La vista laterale dell'embrione E12.5 mostra il cervelletto (HB), occhio sinistro (e), e la pipetta microiniezione (p). Si noti che la punta della pipetta (pt) è nettamente piegato e non è riuscito a penetrare l'utero (pannello di I). L'applicazione di una forza aggiuntiva cesoie la punta della pipetta (Panel J, freccia), lasciando il pipette punta incorporato in utero. Una piccola quantità di veloce verde (FG) è stato espulso dalla pipetta fratturato e ha individuato la superficie dell'utero. Il incorporato la punta di pipetta (Panel K) deve essere rimosso con pregio e con pinze sterili e scartati come rifiuti taglienti. Se la punta della pipetta non può essere individuato o rimosso con successo, l'eutanasia la diga sotto anestesia.
Documentare le osservazioni procedurali di un mouse sopravvivenza chirurgia scheda tecnica: un elemento cruciale per l'apprendimento di questi metodi è quello di documentare le osservazioni e apportare modifiche in base a tali osservazioni. Produrre una sopravvivenza del mouse chirurgia scheda tecnica e annotare informazioni preoperatoria, operative e post-operatorio. Dati preoperatorie includono peso diga, la dose di anestetico consegnato, iniettato plasmide, ecc dati operativi includono iniettato embrione (cioè, R2 è l'embrione secondo dall'ovario nella corno uterina destra), la qualità di iniezione (cioè, nessuna endolinfatico condotto rilevato, colorante in 4
Usa corrente erogata per impulso per ottimizzare l'efficienza di trasfezione: La piazza treno di impulsi d'onda è costituito da 5, 43volt, legumi 50msec con un altro 950msecritardo dell'impulso. Il platino 5 millimetri, elettrodi di stile pale assicurare che tutto il territorio otic è contenuto all'interno del campo elettrico. Efficienze di trasfezione simili può essere realizzato con piastre 3 mm, anche se sono più difficili da posizionare accuratamente. Il paradigma impulso è stato ottimizzato valutando la corrente trasferito l'embrione durante l'impulso finale, non da spazzare attraverso tensioni e valutare l'efficienza di trasfezione. La ragione è che la corrente erogata per impulso varia a tensione costante secondo la pervietà di accoppiamento elettrico tra l'utero e gli elettrodi di platino. Supponendo che l'utero è appena irrigato con soluzione di Ringer lattato è immediatamente prima di mettere le pale e la carica del vettore è presente in eccesso, la variabile principale è la quantità di pressione "accoppiamento" applicata in utero con le pale. Una leggera pressione a risultati 43volts in 60mAmps <trasfezione di corrente erogata e sporadiche al meglio. Pressione moderata a 43vrisultati olt a 60 100mAmps consegnato e la transfezione più efficiente. Una forte pressione a risultati 43volts in> 100mAmps consegnato e si correla con la frequenza cardiaca alterata e persistente aumento letalità embrionale. Una pressione eccessiva rompe il sacco vitellino viscerale (un "pop" si può cogliere attraverso le pale) e causa letalità embrionale. È probabile che la pressione applicata variabile altera l'impedenza tra gli elettrodi che inficia la corrente erogata. La frequenza degli impulsi di 1 Hz (un impulso 50 msec per secondo) è stato definito come il minimo disturbo al ciclo cardiaco dell'embrione, che è una correlazione positiva per la sopravvivenza embrionale. Concludiamo che il parametro più importante per il monitoraggio per stabilire un efficace paradigma elettroporazione in vivo è la corrente erogata per impulso. Modifica di qualsiasi paradigma impulso dovrebbe includere un attento monitoraggio della corrente erogata per impulso.
Adottare un approccio modulare per l'apprendimento thTecnica e: Modulo 1: Pratica un intervento chirurgico farsa con esternalizzazione uterina, ma non per iniezione o elettroporare. Dams tollerare laparotomia ventrale molto bene e non dovrebbe mai avere complicanze post-chirurgiche legate alla tecnica chirurgica. Capacità di sopravvivenza del mouse chirurgiche sono indubbiamente residenti in istituto di casa in modo da perseguire una formazione adeguata. Raggiungere padronanza delle competenze chirurgiche prima di procedere. Modulo 2: microiniezione Practice transuterine nel otocyst su una diga anestetizzato senza l'aspettativa di completare l'intervento di sopravvivenza: l'eutanasia la diga sotto anestesia, isolare gli embrioni iniettati, e valutare la qualità delle iniezioni otocyst. Modulo 3: destinazione solo 2 otocysts embrioni in 2 differenti con green veloci, non elettroporare, completare l'intervento chirurgico, e convalidare valle sopravvivenza embrionale. Modulo 4: bersaglio solo 2 embrioni con DNA / veloce soluzione verde, elettroporare, convalidare valle sopravvivenza embrionale, e accertare la transfezione efcienza. Modulo 5: destinazione solo 2 embrioni con DNA / veloce soluzione verde, elettroporare, iniettare Alexa Fluor nel ventricolo 4 ° di etichettare l'embrione manipolato, selezionare gli embrioni etichettati a P0, e verificare l'efficienza della trasfezione.
Curva di apprendimento procedurale: padronanza delle tecniche di sopravvivenza del mouse chirurgia, con la guida appropriata dal personale veterinario e chirurgica del proprio istituto di appartenenza, è abbastanza rapida e richiede solo di essere 3-5 dighe di valore della pratica per i principianti di acquisire know-how. Microiniezione Transuterine ed elettroporazione in vivo di generare utilmente trasfettate orecchio interno richiederà 10-50 dighe-vale la pena dello sforzo, supponendo che ci sono 6 embrioni realizzabili per la gravidanza e l'approccio modulare è seguita. Gli studenti che amano le attività che richiedono abilità motorie fini (ad esempio, suonare uno strumento musicale, per il cucito, il modello-making, o l'atletica competitivi) hanno periodi di formazione più brevi rispetto those che non lo fanno. I correlati critici per la padronanza con successo di questi metodi sono scrupolosa attenzione ai dettagli (per esempio, la microiniezione pipetta fabbricazione, l'anatomia vascolare, esplicita prendere appunti) e un atteggiamento ragionevolmente tranquillo.
Workflow: le competenze una volta si ottiene, si può anticipare l'iniezione e electroporating 4-6 embrioni per diga; 3-5 embrioni sopravviverà, e 2-4 embrioni saranno utilmente transfettate orecchio interno per l'analisi. Il rombencefalo Alexa Fluor tecnica di etichettatura per gli embrioni di etichette per la selezione alla nascita richiede l'iniezione aggiuntiva rombencefalo in ogni embrione elettroporate, ma questo è ben tollerato e non pregiudichi l'efficienza procedurale. Così, il tasso di recupero utilmente trasfettate orecchio interno da elettroporazione in vivo paragonabile a il tasso di recupero di topi omozigoti mutanti da un paradigma di allevamento heterogygous. Con l'esperienza, 2-3 dighe al sperimentatore al giorno è un lavoro ragionevoleflow: 1,5 ore per ogni diga per un intervento chirurgico e un totale di 1,5-2 ore per il monitoraggio post-operatorio.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Humana Press per il permesso di pubblicare la pipetta figura microiniezione di fabbricazione, che è originariamente apparso a pagina 130 di riferimento 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Ministero delle Comunicazioni educativi, per videografia, Larry Dlugas per il design e video editing; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco per la progettazione di nostra consuetudine orizzontale, cappa a flusso laminare e Les Goldsmith per fornire lo schema tecnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Dipartimento di Medicina comparativa, per la guida con il nostro animali protocollo di cura, tecniche chirurgiche, e profilattico analgesia regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, per condividere la sua dispensa sulle tecniche di sutura veterinaria, Edward Porsov, MS, per la progettazione la nostra workstation video di Adobe Premiere Pro microscopia computer; e Leah bianco e Jonas Hinckley dei LNS didascalie (Portland, OR). Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute on Deafness e other disturbi della comunicazione: DC 008595 R01 e R01 DC 008595-04S2 (a JB) e P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Core Center Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
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