Summary
الأذن الداخلية الماوس هي جهاز اللوحاء المستمدة من الحواس التي التنموية البرنامج وضعت خلال فترة الحمل. نحن تعريف
Abstract
الأذن الداخلية الثدييات على 6 ظهائر الحسية متميزة: 3 عرف في الأمبولات من القنوات نصف دائري؛ بقع في utricle والكييس، وعضو كورتي في القوقعة ملفوف. وعرف وبقع تحتوي على خلايا شعر الدهليزي أن transduce المحفزات الميكانيكية إلى أيد بالمعنى الخاص للتوازن، في حين أن خلايا الشعر السمعي في جهاز كورتي هي محولات الطاقة الأولية لعقد جلسات استماع 1. خلية مواصفات مصير هؤلاء في ظهائر الحسي والتشكل من القنوات الهلالية والقوقعة تجرى خلال الأسبوع الثاني من الحمل في الماوس ويتم الانتهاء إلى حد كبير قبل الولادة 2،3. وتجرى بشكل روتيني دراسات التنموية في الأذن الداخلية من خلال الماوس حصاد الأجنة وراثيا في مختلف المراحل الجنينية أو بعد الولادة إلى التبصر في الأساس الجزيئي لل/ والخلوية أو الظواهر المورفولوجية 4،5. نحن نفترض أن نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية في الرحم < / em> في سياق المكاسب والخسائر من دراسات وظيفة يمثل نهجا مجانية إلى transgenesis الماوس التقليدية للاستجواب من الآليات الوراثية الكامنة وراء تطور الثدييات الأذن الداخلية 6.
نموذج تجريبي لإجراء دراسات misexpression الجينات في الأذن الداخلية الماوس النامية أثبتت هنا يحل في ثلاث خطوات عامة: 1) البطن بطني، 2) microinjection transuterine، و 3) في electroporation الجسم الحي. البطن بطني هو أسلوب البقاء على قيد الحياة الماوس الجراحية التي تسمح لجهات خارجية من الرحم للوصول تجريبية لزرع الأجنة 7. microinjection Transuterine هو استخدام مشطوف بال micropipettes الزجاج، وشعري لإدخال التعبير البلازميد في تجويف الحويصلة الأذنية أو otocyst. في الجسم الحي electroporation هو تطبيق موجة مربع، والبقول الحالية مباشرة إلى قيادة التعبير البلازميد إلى 8-10 الخلايا الاصلية.
الحمار = "jove_content"> نحن سبق وصفها هذا نقل الجينات electroporation القائم على تقنية وشملت مذكرات مفصلة عن كل خطوة من البروتوكول 11. يمكن للتقنيات الفأر الجنينية التجريبية يكون من الصعب معرفة من النثر والصور الثابتة وحدها. في العمل الحالي، ونحن شرح الخطوات 3 في الجينات إجراء التحويل. الأهم من ذلك، نحن نشر الرقمي المجهر الفيديو لاظهار وجه التحديد كيفية: 1) تحديد اتجاه الجنين في الرحم، 2) إعادة توجيه الأجنة لاستهداف الحقن لotocyst، 3) microinject الحمض النووي مختلطة مع حل الصبغة الكاشفة في otocyst في أيام الجنينية 11.5 و 12.5، 4) electroporate في otocyst حقنه، و 5) الأجنة التسمية electroporated لاختيار ما بعد الولادة عند الولادة. ونحن نقدم نماذج تمثيلية من الأذن الداخلية transfected بنجاح، ودليل التصويرية لأكثر الأسباب شيوعا للmistargeting otocyst؛ مناقشة كيفية تجنب الأخطاء المنهجية المشتركة، والمبادئ التوجيهية الحالية للكتابة في الرحم زين رعاية الحيوان بروتوكول نقل.
Protocol
1. بطني البطن
- تخدير أحد السدود التي هي أجنة في يوم الجنينية 11.5 (E11.5؛ ظهر اليوم تم الكشف عن المكونات المهبل هو يوم 0.5 من التطور الجنيني) عن طريق الحقن داخل الصفاق من حل صوديوم مخدر بنتوباربيتال (7.5 ميكروليتر لكل غرام من وزن الجسم). عامل مخدر حل: 180 ميكرولتر من 50 ملغ / مل حل الصوديوم بنتوباربيتال و 100 ميكرولتر من الايثانول المطلقة؛ 320 ميكرولتر من 65 ملغ / مل سلفات المغنيزيوم مائي (ينظم لهجة الرحم)، و 400 ميكرولتر من البروبيلين جليكول (غير قابلة للامتزاج مع مركبة مائي وعضوي المكونات).
- تقييم اكتمال التخدير عن طريق إجراء التجارب المؤذية المنبهات: أزمة مخلب؛ قرصة الذيل، وبرمشة استجابة للمس الخد وvibrissae. تطبيق مرهم معقم للعين على القرنيات.
- حلق الفراء البطن من منطقة فوق العانة إلى القفص الصدري مع المقص وشفرة غرامة (اوستر # 40 شفرة). تطهير البطن مع الايثانول 70٪، 10٪ اليود البوفيدون (Betadine)، وهوالثانية والايثانول 70٪، بالتسلسل. مكان الماوس البطن الجانبية أسفل على الستارة معقم ومن ثم وضع على وسادة التدفئة أو لوحة دافئ (37 درجة مئوية) لمدة 2-5 دقائق.
- شق الجلد في منطقة البطن في خط الوسط مع بطني الكرة ذات الرؤوس مقص. تمديد شق لمدة 10-14 ملم. تحديد ألبا الخط، وهو، أبيض اوعائي الفرقة النسيج الضام على طول خط الوسط بطني من جدار البطن. شق في ألبا الخط مع الكرة يميل مقص وتوسيع شق 10-14 ملم. ري على الفور في البطن مع prewarmed (37 درجة مئوية) lactated رينغر حل.
- عناصر خارجية قرني الرحم بالملقط حلقة دون تطبيق الضغط المفرط على مواقع التوطين. ري قرون تخريجها الرحم مع prewarmed، حل رينغر lactated.
2. Transuterine Microinjection
- افتعال سميك الجدران، ماصة البورسليكات الزجاج microinjection الشعرية مع الخصائص التالية: 12-16 μم القطر الخارجي وشطبة 20 درجة. على مجتذب P-97 سوتر ماصة مع خيوط مربع صغير، واستخدام البرنامج التالي: حرارة = اختبار المنحدر بالإضافة إلى وحدات (3)؛ الضغط = 200؛ سحب = 0؛ سرعة = 46؛ مرة = 100). مع beveler BV-10 سوتر، استخدم 104C (الذهب) قرص جلخ لماصات قطرها كبير. مخزنة التعبير Resuspend البلازميد في ميكروغرام 3-4 / ميكرولتر في فوسفات الكالسيوم الحرة المالحة (درجة الحموضة 7،2-7،4). إضافة أخضر سريع بلوري إلى دوامة المركزة، والحمض النووي بلطف لمدة 30 ثانية، وتدور في 10000 جم لمدة 10 ثانية. يتم تحديد الحد الأدنى للأخضر سريع المطلوبة لتعقب بصريا على فعالية حقن تجريبيا. ردم ماصة مشطوف مع الحمض النووي / حل سريع الخضراء. ربط ماصة microinjection المحملة على حامل ماصة للحاقن الضغط (Picospritzer باستخدام> النيتروجين نقي بنسبة 99٪ والغاز المصدر).
- Transilluminate الرحم مع كثافة منخفضة، وعلى ضوء الهالوجين لتصور الجنين داخل موقع غرس لها. التعرف على BEAتينغ القلب، وحويصلات الدماغ، وبراعم الأطراف، الوليدة البطين ال 4 من الدماغ المؤخر، والعين. ري الرحم كل دقيقة 2 مع prewarmed، lactated حل رينغر للحفاظ على الماء. تطبيق ضغط لطيف على الرحم لإعادة توجيه جنين والتعرف على المعالم التشريحية المشار إليها أعلاه.
- توجيه جنين للتعرف على وريد رئيس الأولية التي الأمامية والخلفية فروع الجهة الوسيطة في الأراضي التي يقيم otocyst. لا يمكن otocyst المناسب أن ينظر من قبل تضوء الرحم. يقع في منتصف الطريق بين otocyst الفروع الأمامية والخلفية من وريد رئيس الأولية التي، جنبا إلى جنب مع الجذع الرئيسي للالسياق، تشكل شكل توجد القوائم أو القائمين على ملعب لكرة القدم الاميركية. وotocyst هو في منتصف الطريق بين توجد القوائم.
- إدراج ماصة حقن عن طريق الرحم في مسار تماشيا مع موقع مفترض لotocyst. نبض microinjector مرة واحدة بعد مرورا uterلنا تصور الصبغة الكاشفة وتقريبي في موقع رأس ماصة. دفع ماصة تحت السيطرة ميكرومتر والنبض مرة أخرى لتقييم عمق. مزيد من التقدم في ماصة في اللحمة المتوسطة رئيس الجانبية ونبض مرارا وتكرارا. وسوف ناجحة تستهدف otocyst تكشف عن شكل مدبب من قناة اللمف الباطن ظهريا والإسكالوب شل شكل من الدهليز. lactated حل رينغر الافراج عن الضغط على الرحم، وإزالة ماصة من الجنين / الرحم في اقتراح واحد، وعلى الفور لري الرحم مع prewarmed،.
3. في الجسم الحي Electroporation
- ري الرحم مع حل قارع الأجراس في lactated. حل تطبيقها حديثا قارع الأجراس lactated هو ضروري لزوجين كهربائيا الأقطاب مجداف على غرار إلى الرحم. يبلل السطوح التنغستن من الأقطاب مع وقارع الأجراس lactated. مركز otocyst حقنه في طريق الأقطاب. بلطف ضغط الرحم مع السلطة الفلسطينية electroporationddles. الكاثود هي على اتصال مع جدار الرحم الجانبية لحقن otocyst والقطب الموجب على اتصال مع جدار الرحم المتاخمة للotocyst uninjected. يؤدي الى نبض موجة مربع قطار مع التبديل دواسة القدم على electroporator. المعلمات Electroporation هي: 5، 50 ميللي ثانية البقول بنسبة 43 فولت في النبضة و 950 ميللي ثانية تأخير interpulse. ري فورا الرحم بعد تسليم القطار نبض. تسجيل الحالية تسليمها إلى الأنسجة: 60-100 mAmps يكفي لtransfect الأسلاف الظهارية أذني. حقن وelectroporate 4-6 و الأجنة E11.5 في السد.
- تنفيذ، مستقل 2 microinjection transuterine من ديكستران فلوري مائي (اليكسا فلور 488 إذا كان التعبير البلازميد يشفر بروتين أحمر فلوري أو أليكس فلور 594 إذا كان التعبير البلازميد يشفر ببروتين أخضر) إلى البطين ال 4 من هذه الأجنة التي داخلي آذان حقن بدقة وعلى الأقل 60 mAmps الحالية في النبضة وكان ديlivered خلال electroporation. سوف ديكستران فلوري تكون قابلة للكشف عند الولادة في الدماغ المؤخر، وتمكين مجموعة من الجراء التي تم التلاعب بها آذان الداخلية خلال مرحلة التطور الجنيني (انظر 3.5).
- ري قرون الرحم مع وقارع الأجراس lactated. معاودة قرون الرحم في تجويف البطن. مسح تجويف الرحم مع 2-4 مل من prewarmed، حل رينغر lactated والسماح للفيضان إلى استنزاف للخروج من موقع على شق وثنى العقيمة. استبدال اللف مع مادة جافة ومعقمة. خياطة جدار البطن مع إبرة من غير قطع وخياطة 6-0 resorbable. نحن نفضل غرزة تشغيل، وتأمين كل غرزة أخرى، على جدار على حد سواء في منطقة البطن والجلد.
- تجف الفراء والسدود وتدير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات مثل Meloxicam عن طريق الحقن تحت الجلد. عودة السد إلى القفص انتعاش prewarmed على الستارة العقيمة. رصد وتسجيل التنفس والسدود، شق سالكية موقع، والمهبل لإفرازات دموية. النزيف هو التهاب المفاصل الروماتويديإعادة ولكن إذا كان الحاضر وبلا هوادة، الموت ببطء السد في حين انها لا تزال تحت تأثير التخدير. لاحظ الوقت الذي يستعيد وعيه ويحاول أن ambulate. عودة السد إلى مستعمرة الماوس عندما تظهر بوادر من الأكل والشرب وبدأت في بناء العش. عادة، يحدث هذا في غضون 12 ساعة.
- عند الولادة (يوم بعد الولادة 0)، وضع فلاش في منطقة الدماغ المؤخر من كل الجرو في القمامة للكشف عن ديكستران فلوري باستخدام مجهر stereofluorescence تشريح مع GFP أو تكساس مرشح الأحمر، حسب الاقتضاء. عودة إلى سد المرضعات فقط تلك الجراء التي تعرض العلامات الدماغ المؤخر.
4. ممثل النتائج
الشكل 1. تم حقن نقل Electroporation بوساطة الجينات إلى القوقعة النامية. otocyst E11.5 مع بروتين التعبير الترميز الخضراء المعززة البلازميد فلوري (EGFP) وelectroporated (نبض هيئة تنظيم الاتصالاتفي المعلمات: 5، 43 فولت والبقول بنسبة 50 ميللي ثانية / نبض و 950 ميللي ثانية تأخير interpulse). أ) ممثل الأذن الداخلية من يوم واحد بعد الولادة 6 (P6) الجرو الذي otocyst تم حقن وelectroporated في E11.5 يدل التعبير EGFP من القاعدة من خلال بدوره منتصف القوقعة. تمت إزالة الجدار الجانبي من القوقعة من مطلع الاوسط وقمة فقط. لم transfected الأسلاف E11.5 التي تؤدي إلى قمة. B) جبل الجامعة المناعية من القوقعة في (أ) مع الشعر علامة الخلية، الميوسين 7A (Myo7a)، يشير إلى أن التعبير EGFP يتبع مسار للجهاز كورتي ويكون موضعيا بشكل صارخ لظهارة الخلية الحاملة للشعر الحسية. ج) والأذن الداخلية ممثل من جنين E18.5 otocyst التي تم حقن وelectroporated في E11.5. إسقاط ليزر متحد البؤر يوضح التعبير EGFP في Myo7a إيجابية خلايا الشعر الحسية. D) ليزر متحد البؤر الإسقاط من ظهارة والحسية قوقعة من الجهاز E18.5 كورتي تشير EGFP expression في خلايا الشعر الداخلية (IHC)، خلايا الشعر الخارجي (OHC)، وخلايا phalangial الداخلية (IPC)، وخلايا عمود (PC)، وخلايا دايترس "(DC). شريط النطاق في (ب) ينطبق على (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية: الأذن الداخلية الماوس يطور من اللوحاء أذني خلال الأسبوع الأول من التنمية postimplantation 12،13. بعد يوم الجنينية 9.5 (E9.5)، فقد invaginated في اللوحاء وتحولت إلى حويصلة مملوءة بسائل يسمى otocyst 2. السلائف أذني في حويصلة تؤدي إلى الخلايا الحسية وnonsensory داخل الأذن الداخلية ناضجة وكذلك الخلايا العصبية التي يعصب خلايا الشعر الحساسة ميكانيكيا في ظهائر والحسية الدهليزي والسمعية. على مراحل جنينية في وقت متأخر، تم تأسيس المجمع، 3 الابعاد التشكل من المتاهة الغشائي في الأذن الداخلية 3،12. وتجرى عادة مكسب وخسارة وظيفة من بين الطرائق التجريبية التي transgenesis الماوس إلى التبصر في التنظيم الجيني للعمليات التنموية مثل مواصفات مصير الخلايا وتشكيل نمط. التلاعب الوراثي الحيوي للأذن الفأر وضع الداخلي فيالرحم يمثل نهجا مجانية إلى transgenesis الفأر أن الأزواج تقنيات نقل الجينات مع فأر التجارب علم الأجنة 6،11.
فيروس ونقل الجينات electroporation بوساطة تقنيات تم تطويرها للتعامل مع التعبير الجيني في الأذن الداخلية النامية 6،11،14،15. الغدة المرتبطة الفيروسية (AAV) ناقلات تصيب الأسلاف أذني التي تؤدي إلى أنواع الخلايا الحسية وnonsensory واستخدمت لاستجواب الأساس الجزيئي للكالسيوم التي تعتمد على الإيماس في خلايا الشعر الماوس 16. ناقلات AAV إنتاج التتر العالية التي تمكن من التعبير واسع في الأذن الداخلية والأنماط المصلية الفيروسية المختلفة عرض tropism فريدة من نوعها والتي قد تكون مفيدة للتعبير الخلوية التفاضلية. مساوئ تشمل قدرة ثابت حشو أن يحد من حجم الجينات التي يمكن misexpressed وشرط للحصول على الخبرة الفيروسية لجعل، تنقية، وعيار الفيروسات. Electroporation بوساطة الجينات TRوقد استخدمت ansfer لتقييم دور عامل أساسي النسخ الحلزوني حلقة الحلزون في تحديد مصير الخلايا الحسية الشعر في الجسم الحي 6. البلازميدات التعبير تكييفها للتكنولوجيا subcloning بوابة تتيح البناء السريع والفعال للناقلات مع المروجين فريد قيادة التعبير عن الجينات الفائدة من والبروتين علامة فلوري من تسلسل IRES 17. ويمكن التعبير عن الجينات ذات الأهمية في أذني السلائف في غضون 24 ساعة من electroporation والتعبير يمكن أن تستمر في الأذن الداخلية بعد الولادة اعتمادا على المروج المستخدمة. البلازميد البناء، وتنقية، والتركيز، وتحديد الكميات يتطلب المعيار الوحيد المهارات البيولوجية الجزيئية. وتشمل العيوب انخفضت كفاءة في ترنسفكأيشن المجراة مع تزايد حجم البلازميد فوق 8KB ~ وارتفاع معدل الفتك الجنينية بالمقارنة مع معظم الناقلات الفيروسية. كلا electroporation وفيروس بوساطة تقنيات نقل الجينات يتطلب التمكن من الفأر الجنينية التكنولوجيا التجريبيةniques: جراحة البقاء على قيد الحياة، في التلاعب الرحم من الأجنة، وmicroinjection transuterine. الهدف من هذا المخطوط هو معالجة المسألة الأخيرة من خلال إظهار كل خطوة حاسمة المنهجية المجهر الفيديو الرقمية.
المنهجية الملاحظات على الفيديو: لقد اخترنا عمدا عدم ثنى الموقع مع شق مجال معقم أثناء تصوير المشاهد حتى يمكن أن نرى موقف من خط الوسط بطني فيما يتعلق التشريح من السد، اي رئيس (غير واضحة عمدا في معظم إطارات ولكن يمكن تمييزه)، والأطراف، والذيل. اللف في موقع شق يمنع بشكل فعال وجهة النظر هذه، ويمكن أن نخلط جهود لتقدير العلاقات التشريحية ذات الصلة مكانيا خلال البطن بطني وتسلسل حقن. ومع ذلك، نوصي اللف البطن السد بحيث تخريجها بقية أبواق الرحم في حقل معقمة للحفاظ على عقامة الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن عمدا لم تحاول الشياطينtrate خياطة من شقوق جراحية في جدار البطن والجلد لأنه يجب تعلم هذه الطرق من قبل على توجيه من خبير من طبيب بيطري أو فني مؤهل الجراحية. الدكتور مارسيل أولا بيريت، جنتيل (جامعة تكساس في سان انطونيو)، ويعرض نقاشا ممتازا في هذا الموضوع، مع استكمال رسم تصويري، في نشرة له، "مبادئ خياطة البيطرية." (18)
التوصيات الإجرائية: نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية يمثل تحديا من الناحية التقنية. هناك سلسلة من أفضل الممارسات التي من شأنها القضاء على كمية كبيرة من التقلبات وضمان تحقيق نتائج ناجحة. نحن تقديم توصيات محددة لتسهيل التعلم دون هذا المنهج التجريبي.
تشاور الكوادر البيطرية لتطوير جراحة بقاء الفأر حيوان بروتوكول الرعاية: بروتوكول رعاية الحيوان لاجراء عملية جراحية بقاء الثدييات وتطالب لانتاج منذيجب تعريف التخدير، التسكين، والرعاية المحيطة بالجراحة وتنسيقها. وترد مناقشة تفصيلية لرعاية الحيوان تطوير البروتوكول، بما في ذلك اللغة التي يمكن أن تشكل نواة بروتوكول مقدم الطلب، والمعلومات التكميلية (انظر " رعاية الحيوان بروتوكول للتنمية "). وبالإضافة إلى ذلك، فإن مؤسسات الرعاية منزلك الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) والموظفين البيطرية مما لا شك فيه تقديم توجيهات إضافية بشأن وضع بروتوكول مناسب بناء على طلبها.
إنشاء منطقة مخصصة بقاء الماوس لجراحة لنقل الجينات في الرحم: البطن بطني هي تصنف على أنها عملية جراحية كبرى لأنه يمس تجويف الجسم. ومعظم IACUCs لا تتطلب والطبقة العقيمة 100 البيئة من أجل البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية كبرى الماوس. بدلا من ذلك، وهي منطقة مخصصة التي تتضمن الإضاءة المناسبة، فينتيlation والتدفئة التكميلية، والثابت، من المحتمل غير قابلة للاختراق، السطوح disinfectable تكون مطلوبة. نحن نفضل لإجراء عملية جراحية لدينا بقاء في غطاء محرك السيارة رقائقي تدفق الأفقي الذي يحمي الفار من العدوى، ويقلل من الإجهاد الفسيولوجية، وبالتالي مرافق استعادة ما بعد الجراحة. لقد حددنا سلسلة من التعديلات المخصصة ل، أفقي، ثبط التذبذب الصفحي غطاء تدفق (Envirco 630 LF) والتي تشمل الاتجاه، الهالوجين القوة الكهربائية المنخفضة الإضاءة المسار؛ الدارات الكهربائية الموسعة لجينة معدات نقل الطاقة، ومنافذ الطاقة راحة مع القواطع أعلى مقاعد البدلاء لمرور الحبل. ويرد تخطيطي مفصل لهذه التعديلات والمعلومات التكميلية (انظر " هود تدفق الصفحي في نقل الجينات الرحم "). تشاور IACUC الخاص بك كما كنت في وضع بروتوكول الخاص رعاية الحيوان لتحديد موقع مناسب التي يتم مخصصة حصرا لسو الماوسrvival عملية جراحية.
وزن السد إلى 0.1 غرام أقرب قبل ادارة التخدير الصوديوم بنتوباربيتال: الصوديوم بنتوباربيتال هو مخدر فعال وسيوفر ما لا يقل عن 105 دقيقة من الوقت في العمل عند اتباع الجدول الزمني الجرعات الموصى بها. 1 تحديد وزن الجسم دقيق لكل سد قبل حساب جرعة من خليط لحقن مخدر. أبدا تقدير سد وزن الجسم. استخدام الحقنة إبرة صينية الحساسية وحقنة من Dikison بيكتون: شطبة الإنسان داخل الأدمة مثالية للحقن داخل الصفاق ارضحي في الفئران الحوامل. وعلاوة على ذلك، هذه الحقنة لديها منخفضة للغاية حجم الفضاء القتلى ويتم معايرة لمجموعة من وحدات التخزين مخدر المطلوبة عادة للسدود التي الأجنة في E11.5 أو E12.5.
نشر وعي وقائي لدعم بقاء على قيد الحياة الجنينية: إدارة مخدر موضعي على خط خياطة، مثلBupivicaine، والنظامية، غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات، مثل Meloxicam، وذلك قبل وضع سد في قفص الانتعاش بحيث المسكنات على متن الطائرة في الوقت الذي يتعافى من سد التخدير. الحد من عدم الراحة في سد يسهل التعافي بعد العملية الجراحية والحفاظ على حمل صحي.
شطبة وmicroinjection الماصات وتقيد باحكام القطر الخارجي: إن سبب واحد الأكثر شيوعا من الفتك الجنينية هي الأنسجة و / أو تلف الأوعية الدموية من الماصات microinjection بنيت بطريقة سيئة. microinjection Transuterine في otocyst الماوس E11.5 يحمل معوقات مختلفة من الحقن في أكبر الأجهزة في أقدم أجنة (أي حويصلات الدماغ، والعين، وأطرافهم، الخ). Unbeveled، مشطوف سيئة، أو كبيرة بشكل غير لائق الماصات القطر الخارجي وسوف يتسبب في حدوث نزيف من الأوعية في الرحم، والحشوية صفار الأوعية الدموية في كيس، و / أو الجنين في E11.5، والتي سوف تقلل البقاء على قيد الحياة الجنينية. فمن الممكنلتسليم-كسر الماصات الدائم لقطر الصغيرة التي تحمل شطبة المناسبة، ولكن من الصعب القيام به بشكل روتيني. سوف جنين فأر E11.5، الذين صغيرة otocyst هو الهدف، أن يكون لا ترحم. استشارة P-1000 P-97 كتاب الطبخ الماصة 2011 من الآلات سوتر عن الخطاب الكامل على تصميم وتصنيع ماصة 19. وأشارت المعلمات من أجل الماصات المستخدمة في هذا العمل أعلاه، ولقد تم تلفيق لهم مناقشتها بالكامل من قبل 11. الملاحظات الاجرائية في دليل المالك لbeveler سوتر BV-10 الصكوك هي أيضا مصدر ممتاز.
نفهم لماذا mistargeting في otocyst بواسطة microinjection transuterine يحدث: والفيديو يعرض حصيلة مثالية لmicroinjection transuterine في E11.5 وotocyst E12.5. Mistargeting في otocyst ينتج عادة من طريق الحقن بشكل سطحي جدا، وعميق جدا، أو من الماصات ملفقة غير الكافية. الشكل 2 يوضح هذه الشروط. لوحةويوضح وجهة نظر الجانبي من الجهة اليسرى من جنين E12.5 التقط بواسطة تضوء بعد microinjection transuterine نجاح حل سريع الخضراء في otocyst. في الدماغ المؤخر (HB) يظهر ظهري الشق على شكل وتد في otocyst. العين (ه) ويحتوي على حلقة من الصباغ على طول محيطه وforelimb اليسار هو بارز. الجذع الرئيسي من وريد رئيس الابتدائي (PHV) هو فقط تحت otocyst. يتم تعبئة otocyst مع الأخضر بسرعة والذي يظهر أسود: على ظهري، قناة اللمف الباطن (ED) والدهليز من otocyst (OC) ويمكن أن يستشف. والاستهداف الناجح للotocyst-12.5 E11.5 يقدم دائما قناة اللمف الباطن ملحوظ بشكل واضح والدهليز. لوحة أ "يظهر نفس الصورة كما هو الحال في دون وضع العلامات البيضاء لتسهيل مراجعة نقدية للotocyst حقن.
الشكل 2. دليل مصور لmistargeting في otocyst بواسطة microinjec transuterineنشوئها. جميع لوحات عرض وجهة النظر الجانبي الأيسر للجنين E12.5 مع الدماغ المتوسط صعودا واليسار الدماغ الأمامي، ما عدا لوحة H، والذي هو وجهة نظر ظهري للمنطقة الدماغ المؤخر، الدماغ المتوسط. لوحات في كل صف وتمثل صورا للجنين نفسه. انظر مناقشة للحصول على شرح مفصل لأسباب mistargeting otocyst. الاختصارات: ه، العين اليسرى، إد، قناة اللمف الباطن؛ FG، سريع الخضراء، وغبطة، الدماغ المؤخر، رطل، برعم الطرف؛ OC، otocyst، بعد التمديد، إقليم أذني، P، ماصة؛ PHV الابتدائي وعرق الرأس، حزب العمال، ماصة معلومات سرية.
حقن سطحي هو سبب شائع من mistargeting. الفريقان هي ما يبرهن على وجود حقن سطحي إلى الحمل المستكن E12.5. في الدماغ المؤخر (HB) درجة والأراضي أذني (بعد التمديد، دائرة) واضحة في هذا الرأي، والجانبي الأيسر. ماصة microinjection (ع) في المقدمة. سريع الخضراء (FG) يبدأ في إخراج من طرف ماصة (B)، والبقول مع لاحق من الضغط محقن (CD)، وينشر صبغة في شكل البيضاوي. توزيع اله صبغ تشير إلى أن عرضه بين جدار الرحم، وصفار البيض الحشوية كيس، وهو غشاء خارج الجنين التي تحيط تجويف exocoelomic. وينبغي أن المجرب لا تحاول أن تعيد استهداف otocyst في هذا الجنين ولكن ينبغي أن تنتقل إلى الجنين المقبل. حقنات متعددة ترتبط مع بقاء الجنينية انخفضت، وهو التأثير الذي ما أكثر حدة في E11.5 من E12.5.
حقن عميق هو السبب الأكثر شيوعا من mistargeting. لوحات FH إثبات وجود مسار الحقن الذي يمر عبر أراضي أذني في الدماغ المؤخر. على المنوال رئيس الابتدائي (PHV)، العين اليسرى (ه)، وماصة (ع) واضحة في هذا الرأي الجانبي للجنين E12.5. تم تهجير وطرد الأولي للأخضر سريع (FG) ظهريا فيما يتعلق الوريد رئيس الأساسي / إقليم أذني. مع نبضات لاحقة، كان شغلها تماما الدماغ المؤخر على شكل وتد (HB) مع الأخضر سريع (لوحة G). وتناوب 90 درجة من الجنين حقن يتيح الكشف عن الأخضر بسرعة داخل hindbraفي تجويف من وجهة النظر ظهري (لوحة H). على حد سواء نتيجة حقن سطحي وعميق من عدم القدرة على إدراك عمق ماصة microinjection بعد أن يجعل اتصال مع الرحم. وثمة نهج عملي هو أن يعمل بشكل جيد للمضي قدما في ماصة من خلال الرحم وبعد ذلك مرة واحدة نبض فورا للبحث عن سحابة من أخضر سريع: مكان وجود نفخة يدل على موقف التقريبي للطرف ماصة. ضبط عمق بناء على هذا النبض مجموعة الحقائق.
ماصات ملفقة غير كاف هي السبب الأكثر شيوعا لmistargeting. محاولة حقن هو موضح في لوحات وأجريت ايك مع طرف الماصة الذي تم كسره يدويا ولكن ليس مشطوف. وجهة النظر الجانبي للجنين E12.5 يظهر الدماغ المؤخر (HB)، العين اليسرى (ه)، وماصة microinjection (ع). نلاحظ أن الطرف ماصة (حزب العمال) هو انحنى بشكل حاد وفشل في اختراق الرحم (الفريق الأول). تطبيق قوة إضافية المقصات غيض من ماصة (لوحة J، السهم)، وترك نقطةette طرف جزءا لا يتجزأ من الرحم. وطرد كمية صغيرة من أخضر سريع (FG) من كسر ماصة، ورصدت على سطح الرحم. يجب إزالة ماصة جزءا لا يتجزأ من طرف (لوحة K) بالملقط، ودفع غرامة معقمة والتخلص منها مع النفايات الحادة. إذا لا يمكن للطرف أن يكون موجودا أو ماصة نجحت في إزالة، الموت ببطء السد تحت التخدير.
توثيق الملاحظات الإجرائية على ورقة البقاء على قيد الحياة الماوس بيانات عملية جراحية: عنصر حاسم لتعلم هذه الأساليب هو توثيق الملاحظات وإجراء تعديلات بناء على تلك الملاحظات. تنتج عملية جراحية بقاء الماوس بيانات ورقة ومذكرة المعلومات قبل الجراحة، من المنطوق، وبعد العملية الجراحية. وتشمل البيانات قبل الجراحة الوزن السد، جرعة من مخدر تسليمها، وحقن البلازميد، وما إلى ذلك من منطوق البيانات وتشمل حقن الجنين (أي، R2 هو الجنين الثاني من المبيض في القرن الرحم اليمين)، ونوعية الحقن (أي، لا اللمف الباطن اكتشاف قناة، صبغ في 4
استخدام الحالية تسليمها للنبضة لتحسين كفاءة ترنسفكأيشن: نبض موجة مربع يتكون القطار من 5، 43volt والبقول 50msec مع جملة 950msecتأخير النبض. البلاتين 5mm، و أقطاب أسلوب مجداف ضمان أن يرد على كامل الأراضي أذني ضمن الحقل الكهربائي. ويمكن تحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن مماثلة مع المجاذيف 3mm، على الرغم من أنها أكثر صعوبة في وضع دقيق. والنموذج الأمثل من خلال تقييم نبض الحالية نقلها إلى الجنين خلال نبض النهائية، وليس من قبل تجتاح الفولتية وتقييم كفاءة ترنسفكأيشن. الأساس المنطقي هو أن التيار تسليمها في النبضة يختلف في الجهد المستمر اعتمادا على سالكية من توصيل الكهربائي بين الرحم والأقطاب البلاتين. على افتراض أن يتم ريها حديثا الرحم مع حل قارع الأجراس lactated على الفور قبل وضعها في المجاذيف، وتهمة الناقل موجودا في الزائدة، والمتغير الرئيسي هو كمية الضغط "اقتران" تطبق على الرحم مع المجاذيف. لطيف الضغط على النتائج 43volts في 60mAmps <الحالية ترنسفكأيشن تسليمها ومتفرقة في أحسن الأحوال. معتدل الضغط على 43volts النتائج في 100mAmps-60 وسلمت ترنسفكأيشن الأكثر كفاءة. ضغط ثقيل على النتائج في 43volts> 100mAmps تسليمها ويرتبط مع معدل ضربات القلب يتغير باستمرار، وزيادة الفتك الجنينية. الضغط المفرط تتمزق والحشوية الكيس المحي (قد شعرت "البوب" من خلال المجاذيف) ويتسبب في الفتك الجنينية. فمن المرجح أن ضغط متغير تطبيق يغير مقاومة بين الأقطاب الكهربائية التي تؤثر على تسليم الحالي. وقد عرفت وتيرة نبض 1Hz (واحد من 50 ميللي ثانية النبض في الثانية الواحدة)، واضطراب الأقل إلى دورة للجنين في القلب، وهو ربط إيجابي من أجل البقاء الجنينية. نستنتج أن المعلمة الأكثر أهمية في رصد في إنشاء نموذج فعال في الجسم الحي electroporation الحالي هو تسليم في النبضة. وينبغي تعديل أي نموذج نبض تشمل رصد دقيق للتيار تسليمها في النبضة.
اعتماد نهج وحدات لتعلم اله تقنية: الوحدة 1: ممارسة جراحة صورية مع جهات خارجية الرحم، ولكن لا حقن أو electroporate. السدود تحمل البطن بطني بشكل جيد للغاية، ويجب ألا يتعرض مضاعفات بعد الجراحة المتعلقة تقنية جراحية. مهارات البقاء على قيد الحياة الماوس الجراحية يقيمون بلا شك في مؤسسة بيت مواصلة التدريب الكافي لذلك. تحقيق التمكن من المهارات الجراحية قبل الشروع. الوحدة 2: microinjection الممارسة transuterine في otocyst على سد تخدير دون توقع الانتهاء من عملية جراحية البقاء على قيد الحياة: الموت ببطء السد تحت التخدير، وعزل هذه الأجنة المحقونة، وتقييم جودة حقن otocyst. الوحدة 3: الهدف فقط 2 في 2 otocysts الأجنة مختلفة مع الأخضر بسرعة، لا electroporate، واستكمال عملية جراحية، والتحقق من صحة بقاء الجنين المصب. الوحدة 4: الهدف فقط 2 الأجنة مع electroporate، الحمض النووي / حل سريع أخضر، التحقق من صحة بقاء الجنين المصب، والتأكد من EF ترنسفكأيشنficiency. الوحدة (5): الهدف فقط 2 الأجنة مع الحمض النووي / حل سريع أخضر، electroporate، حقن اليكسا فلور إلى البطين 4 إلى تسمية جنين التلاعب بها، حدد الأجنة وصفت في P0، والتأكد من كفاءة ترنسفكأيشن.
منحنى التعلم الإجرائي: التمكن من تقنيات الجراحة الماوس البقاء على قيد الحياة، مع التوجيه المناسب من موظفي الطب البيطري والجراحة من مؤسسة منزل واحد، هو سريع نسبيا، وينبغي أن لا يتطلب سوى 3-5 السدود قيمتها من الناحية العملية للمبتدئ لاكتساب الخبرة. وسوف microinjection Transuterine وelectroporation في الجسم الحي لتوليد الأذن الداخلية transfected مفيد تتطلب 10-50 السدود قيمتها من جهد، على افتراض هناك 6 أجنة قابلة للتنفيذ في فترة الحمل واتباع نهج تدريجي. هؤلاء الطلاب الذين يتمتعون الأنشطة التي تتطلب المهارات الحركية الدقيقة (أي العزف على آلة موسيقية، الخياطة، صنع نموذج، أو ألعاب القوى التنافسية) على فترات أقصر من تدريب ثوسراج الدين أن لا تفعل ذلك. ويرتبط حاسمة لإتقان الناجح لهذه الأساليب هي الاهتمام الدقيق بالتفاصيل (أي microinjection ماصة تلفيق، تشريح الأوعية الدموية، وتدوين الملاحظات واضح)، وبشخصيته الهادئة إلى حد معقول.
سير العمل: اكتساب الخبرة مرة واحدة، يمكن للمرء أن توقع عن طريق الحقن وelectroporating 4-6 أجنة في سد؛ 3-5 أجنة سوف البقاء على قيد الحياة، والأجنة 2-4 وسوف يكون من المفيد transfected الأذن الداخلية للتحليل. واليكسا الدماغ المؤخر تقنية وضع العلامات فلور إلى الأجنة التسمية لفرز عند الولادة يتطلب حقن الدماغ المؤخر إضافية في كل جنين electroporated، ولكن لأنه يتحمل جيدا وهذا لا يؤثر سلبا على كفاءة الإجراءات. وهكذا، فإن معدل الاسترداد من الأذن الداخلية transfected من المفيد في الجسم الحي electroporation يقارن ايجابيا على معدل الاسترداد من فئرانا معدلة وراثيا متماثلة اللواقح من نموذج تربية heterogygous. من ذوي الخبرة، 2-3 السدود لكل مجرب في اليوم الواحد هو عمل معقولةتدفق: 1.5 ساعة لكل سد لاجراء عملية جراحية ومجموعة من 1،5-2 ساعات عن بعد العمليات الجراحية للرصد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر هيومانا الصحافة للحصول على إذن لنشر تلفيق ماصة microinjection الرقم الذي ظهر أصلا في الصفحة 130 من مرجع 11؛ لاري Dlugas ستيفن وونغ، OHSU وزارة الاتصالات للتربية وللبالفيديو، لاري Dlugas لتصميم الفيديو والتحرير؛ آدم M. O 'كوين، مصمم مميز، Trion / Envirco لتصميم عادتنا تدفق رقائقي الأفقي غطاء محرك السيارة وغولدسميث ليه لتوفير التخطيطي التقنية؛ فيكتور مونتيروسو، MV، ماجستير، دكتوراه، وChatkupt توم، DVM، OHSU قسم الطب المقارن، للاسترشاد مع شركائنا حيوان بروتوكول الرعاية، والتقنيات الجراحية، ونظام وقائي للوعي، مارسيل بيريت، جنتيل، DVM، MS، لتبادل النشرات له على تقنيات خياطة البيطرية؛ إدوارد Porsov، MS، لتصميم لدينا برنامج Adobe Premiere Pro والفيديو المجهر محطة عمل الكمبيوتر، والأبيض وليا جوناس هينكلي من LNS السفلية (بورتلاند، أو). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد القومي للصمم وآلات موسيقية أخرىص اضطرابات التواصل: DC R01 008595 و 008595-R01 العاصمة 04S2 (لJB) وP30 DC005983 (ولاية أوريغون السمع مركز البحوث الأساسية غرانت، بيتر جيليسبي، الباحث الرئيسي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
