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Neuroscience

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

Published: November 10, 2011 doi: 10.3791/3662
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1
1Disease Mechanism Research Core, RIKEN Brain Science Institute, 2Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

Summary

Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und andere

Abstract

Um zu verstehen, wie sich Unterschiede in komplexen Zelle Formen erreicht werden, ist es wichtig, genau zu verfolgen Mikrotubuli Organisation. Die Drosophila Larve Körper Wand enthält verschiedene Zelltypen, die Modelle, um Zellen und Gewebe Morphogenese Studie sind. Zum Beispiel Tracheen werden verwendet, um Rohr Morphogenese 1, und die dendritische Verzweigung (DA) sensorischen Neuronen der Drosophila Larve zu einem primären System für die Aufklärung der allgemeinen und Neuron-Klasse-spezifische Mechanismen der dendritischen Differenzierung 2-5 und Degeneration 6 prüfen .

Die Form der Dendriten Niederlassungen erheblich variieren kann zwischen Neuron Klassen und sogar zwischen verschiedenen Niederlassungen eines einzelnen Neurons 7,8. Genetische Studien in DA Neuronen lassen vermuten, dass Differential Zytoskelett-Organisation kann morphologischen Unterschiede in dendritische Verzweigung Form 4,9-11 zugrunde liegen. Wir bieten eine robuste immunologische Kennzeichnung Methode, um einessay in vivo Mikrotubuli Organisation in DA sensorischen Neurons Dendriten Laube (Abbildungen 1, 2, Movie 1). Dieses Protokoll zeigt die Zerlegung und Immunfärbung des ersten Stadiums Larve, eine Bühne, wenn sie aktiv sensorischen Neurons Dendriten Auswuchs und Verzweigung Organisation auftritt 12,13.

Neben Färbung sensorischen Neuronen erreicht diese Methode robust Kennzeichnung von Mikrotubuli Organisation in den Muskeln (Filme 2, 3), Luftröhre (Abbildung 3, Movie 3), und andere Körperteile Wand Gewebe. Es ist für die Ermittler wollen Mikrotubuli Organisation in situ Analyse in die Wand des Körpers bei der Untersuchung von Mechanismen, die wertvolle Kontrolle von Geweben und Zellen zu gestalten.

Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien

Hinweise vor Beginn: Dissection und immunhistochemische Färbung sind in einem magnetischen Kammer durchgeführt und die Larve sich mit speziell geformten Insektennadeln merken. Detaillierte Anweisungen für den Bau eines magnetischen Kammer und Vorbereitung dieser Stifte können in Zusammenhang mit Verweisen 14,15 gefunden werden. Kurz gesagt, ist ein 1x1cm quadratisches Loch in ein magnetisches Blatt und einem Deckglas angebracht auf der Rückseite des Blattes in eine kleine Kammer zu schneiden. Die Seiten der Kammer sind mit Epoxy-Kleber versiegelt; nach dieser Leim abgebunden hat die Kammer mehrmals mit 70% Ethanol vor Gebrauch gewaschen werden. Dissection Insekten Pins sind durch Biegen in die gewünschte Form hergestellt und anschließend verklebt auf eine Metall-Reiter 14,15. Alternativ zu einem Metall-Reiter haben wir ein umgekehrtes Flat-Head Stahl Reißzwecke mit einem Handgriff von einem cut-off gelben Spitze gemacht werden. Die Nutzung dieser magnetische Kammer Anordnung ermöglicht genaue Kontrolle over pin Positionierung und Gewebe Stretching beim Präparieren.

Zum Antrieb der Reportergen-Expression in den verschiedenen Untergruppen der DA Neuronen Ermittler können mit mehreren verschiedenen Gal4-Linien (zusammengefasst von Shimono und Kollegen 16). Viele dieser Linien sind aus dem öffentlichen Lager-Zentren zur Verfügung. In dieser repräsentativen Protokoll führen wir Immunfärbung einer Zeile, in der zwei gegensätzliche Klassen von DA Neuronen sind Co-markierten: die einfachste Klasse I und komplexeste Klasse IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8: Kusabira-Orange (KO)).

  1. Bereiten Ca + +-freien HL3.1 Kochsalzlösung
    1. In mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 Saccharose und 5 Trehalose; pH 7.2 19. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C. Hinweis: Ca + +-freier Lösung verhindert Muskelkontraktion beim Präparieren.
  2. Bereiten Sie 2x PHEM Puffer
    1. In mM: 130 PIPES, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C.

      Hinweis: Diese Materialien werden nicht auflösen, bis der pH-Wert nähert 7,0.

  3. Bereiten Sie das Fixativ frisch unmittelbar vor der Fixierung.
    1. Um eine 25ml Lösung, erste Mix 2g Paraformaldehyd, 100 &mgr; l 1M NaOH und 10 ml Wasser in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen vorbereiten.
    2. Schütteln Sie in einem 55 ° C Wasserbad mit Schüttler Fixativ, bis die Lösung klar ist. (Gesamtvolumen wird bei etwa 11,5 ml sein.)
    3. Coole Fixativ auf Eis.
    4. Add 12.5ml 2x PHEM Puffer.
    5. Der pH-Wert auf 7,0 mit 1 M HCl.
    6. Füllen Sie die Lösung mit Wasser, bis das Volumen ist 25ml.
    7. Filtern Sie die Lösung mit Whatman-Papier.

2. Larven Dissektion

Beachten Sie vor Beginn: Mikrotubuli-Netzwerke und insbesondere in sensorischen Dendriten, werden Zusammenbruch rasch nach Beginn der Dissektion. Achieving schnelle Zerlegung in weniger als fünf Minuten durch eine sofortige Fixierung gefolgt sind Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieses Protokolls.

  1. Waschen Sie die Larve im Wasser schnell und verschieben Sie sie in dieser Rückgang mit einer Schleife des Haares.
  2. Orient die Larve dorsal und ventral auf dem Glas. Hinweis: Diese Orientierung ist die ventrale Cluster Neuronen zu untersuchen. Um zu untersuchen, dorsalen Cluster Neuronen, invertieren die Orientierung.
  3. Verwenden Sie das Zentrum Insekten-polig auf dem vorderen Ende in der Nähe der Mündung Haken pin. Legen Sie den Stift kurz vor dem Ende für die besten Ergebnisse.
  4. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung HL3.1 in der Sektion Kammer.
  5. Schneiden Sie das sehr hinteren Spitze der Larve off mit Mikroschere. Hinweis: Dieser Schritt eröffnet eine Öffnung am hinteren Ende der Larve, die den Zugang für die Mikroschere (Schritt 2,7) ermöglichen wird.
  6. Schnappen Sie mit der Zange der Region gut, dass jetzt Stossen ist aus der Öffnung am hinteren Ende der Larve. Ziehen Sie die gesamte Darm.
  7. Legen Sie dieSpitze von einem Blatt der Mikroschere durch die Öffnung und entlang der ventralen Mittellinie in Richtung der vorderen.
  8. Mit der Ecke Stifte, Bolzen der nun freien Ecken, posterior, dann anterior. Gleichzeitig sanft dehnen öffnen Sie die Larven Filet.

3. Fixation, Sperrung, Färbung und Montage von Larven Filets

Hinweise vor Beginn: Alle Fixierung und Färbung Schritte werden in der Sektion Kammer durchgeführt. Während dieses Prozesses darauf achten, nicht das Insekt Stifte halten die Larve, da dies zu Gewebeschäden führen kann klopfen. Um zu verhindern, das Experiment vor dem Austrocknen, das tut alles Färbeschritte in eine kleine Tupperware Behälter befeuchtet Gewebe umgeben.

  1. Saugen Sie das Ca + +-freien HL3.1 Puffer unter Verwendung eines gelben Spitze. Unmittelbar fügen Sie die Fixiermittel mit einem anderen pipetteman.
  2. Gently Pipette auf und ab, um das Fixiermittel mit den restlichen Spuren von Ca + +-freien HL3.1 Puffer-Mixin der Kammer. Unmittelbar absaugen und dann fügen Sie frisches Fixativ in die Kammer.
  3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
  4. Wash 6x 10 Minuten in PBST (0,1% Triton X-100 in PBS).
  5. Block mit 5% Ziegenserum in PBST für 20 min bei RT.
  6. Ersetzen Sie die Blocking-Lösung mit primärem Antikörper in 5% Ziegenserum in PBST verdünnt. Die primären Antikörper verwendet werden Maus-anti-α-Tubulin (DM1A) und Ratte anti-CD8 (5h10), beide verdünnt 1 / 1000.

    Hinweis: Der Prüfer kann wollen Maus-anti-α-Tubulin (DM1A) mit Maus-Anti-futsch (22C10) 20,21 verdünnt 1 / 1000 unter bestimmten Umständen ersetzt (siehe Diskussion).

  7. Inkubieren über Nacht (mindestens 16h) bei 4 ° C.
  8. Wash 6x 10 Minuten in PBST.
  9. Add sekundären Antikörper-Lösung in 5% Ziegenserum in PBST verdünnt. Die sekundären Antikörper verwendet werden, Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG und Cy3 donkey anti-Ratte-IgG. Halten Sie die Probe abgedeckt, um zu verhindern FluorophorFoto-Bleiche 22.
  10. Inkubieren entweder bei RT für 2 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C eine Stunde bei Raumtemperatur.
  11. Wash 6x 10 Minuten in PBST.
  12. Setzen Sie den Larven Filet auf der Folie Nagelhaut-Seite nach unten, in 80% Glycerin montieren und Dichtung den Seiten des Deckglases mit Nagellack für einen "schnellen" zu montieren.
    Hinweis: Für eine verbesserte Gewebe Lichtung, und eine dauerhafte stabile Probe, mount in DPX wie bisher 23 beschrieben.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Fluoreszenzfärbung wurde unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. In den Abbildungen 1-2, verschiedene Zweige innerhalb eines Dendriten Laube haben verschiedene Zytoskelett-Organisation. Abbildung 1 zeigt einen Bereich der Laube einer Klasse IV DA Neuron bei der 1. Larvenstadium Larvenstadium. Die ganze Laube ist mit mCD8 markiert:: KO erkannt und mit einem Anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Tubulin wird unter Verwendung anti α-Tubulin-Antikörper und Fluorescent sekundären (Alexa Fluor 488). Die wichtigsten Branchen sind für Tubulin positiv, einige dünne Seitenäste Tubulin-negativ. Movie 1 ist eine Reihe von seriellen Schnitten durch eine ähnliche Färbung einer Klasse-I-DA Neurons. Abbildung 2 zeigt einen Bereich der Laube einer Klasse IV DA Neuronen mit Antikörpern gegen futsch und CD8 an der 1. Larvenstadium Larvenstadium gefärbt. Die wichtigsten Branchen sind futsch-positiv, einige dünne Seitenäste futsch-negativ. Abbildung 3. Tracheen in der larvalen Körper Wand zeigen eine komplexe Mikrotubuli Organisation. Filme 2 und 3 zeigen Schnittserien der Färbung durch Körperwand Muskeln und Luftröhre.

Abbildung 1
Abbildung 1. Abb.. 1 zeigt eine Region von der Laube einer Klasse IV DA Neuron bei der 1. Larvenstadium Larvenstadium. : Die ganze Laube ist mit mCD8 gekennzeichnet: KO erkannt und mit anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Tubulin wird unter Verwendung anti-&-Tubulin Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa 488). Panels AC sequentielle konfokalen z-Abschnitte (0,5 um), C'-C ", single Antikörper-Färbung von Feld C Beispiel von Ästen mit einem (gelbe Pfeilspitze) oder ohne (lila Pfeil) Mikrotubuli sind hervorgehoben. Roten Pfeile markieren Mikrotubuli in der zugrunde liegenden Epithelzellen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Abb.. 2 zeigt eine ähnliche Region von der Laube einer Klasse IV da Neuron mit Antikörpern gegen futsch und CD8 an der 1. Larvenstadium Larvenstadium gefärbt. : Die ganze Laube ist mit mCD8 gekennzeichnet: KO erkannt und mit anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Futsch erkannt wird mit anti-futsch-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa 488). Die wichtigsten Branchen sind futsch-positiv, einige dünne Seitenäste futsch-negativ. Beispiel für Branchen mit (gelbe Pfeilspitze) oder ohne (lila Pfeil) futsch sind hervorgehoben.


Abbildung 3. Trachea befleckt mit dem anti-Tubulin-Protokoll beschrieben. Diese Larve ist der dritte Larvenstadium und seziert wie zuvor 23,24 beschrieben. Movie 3 zeigt vergrößert Schnittserien aus dem Bereich von einem Quadrat markiert.

Movie 1. Serienschnitte Tracing Tubulin-Färbung in der dendritischen Dorn einer Klasse I Neuron. Die ganze Laube ist mit mCD8 markiert:: KO (Magenta) erkannt und mit anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Tubulin (grün) wird unter Verwendung eines Anti-α-Tubulin-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa Fluor 488). Maßstab: die eine Seite des Videobildes entspricht 46.88μm im Abschnitt. Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.

Movie 2. Serienschnitte Tracing Tubulin-Färbung in body Wand Muskeln eines dritten Larvenstadium Larve. Tubulin wird unter Verwendung anti-α-Tubulin-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa Fluor 488). Maßstab: die eine Seite des Videobildes entspricht 46.88μm im Abschnitt. Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.

Movie 3. Serienschnitte Tracing Tubulin-Färbung in einer Körperwand Luftröhre eines dritten Larvenstadium Larve, mit einem quadratischen in Abbildung 3 markiert. Tubulin wird unter Verwendung anti-α-Tubulin-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa Fluor 488). Maßstab: die eine Seite des Videobildes entspricht 46.88μm im Abschnitt. Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.

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Discussion

Um zu verstehen, wie komplex Zellformen sind es erreicht ist wichtig in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode Assay Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten. Neben Färbung sensorischen Neuronen erreicht diese Methode robust immunhistologische Färbung der Luftröhre, Muskeln und andere Körperteile Wand Gewebe.

Wir verwenden dieses Protokoll, um Mikrotubuli Organisation in den Entwicklungsländern sensorischen Dendriten DA Neuronen zu untersuchen. Diese Dendriten sind sehr empfindlich gegen Verletzungen oder Stress 25, und brechen schnell nach Beginn der Dissektion 23. Dissection sollte in fünf Minuten oder weniger durchgeführt werden. Mikrotubuli in der Luftröhre und andere Körperteile Wand Gewebe sind stabiler. Dieses Protokoll wird von den verwendeten vorzubereiten Larven Filets für die Analyse der neuromuskulären Synapse 14,15 angepasst und ist für den schnellen f optimiertixation nach einer schnellen Sektion.

Bei der Analyse der Dendriten der DA Neuronen, robust anti-Tubulin-Färbung in darüber liegenden Muskeln, und die zugrunde liegenden Epithelzellen 26 kann zu einem komplizierten Färbungsmuster (Abbildung 1, Kino1) führen. Daher vorsichtig Tracing von dendritischen Färbung durch mehrere serielle Schnitte (Kino1) kann für eine vollständige Analyse des Mikrotubuli-Organisation in der DA Neuron Dendriten Laube erforderlich sein. Monoklonale Antikörper, die spezifisch Drosophila Homolog MAP1B, futsch 20,21, können auch verwendet werden, um die Mikrotubuli-Zytoskelett in der Drosophila peripheren Nervensystems 5,9,20 Label sein. Futsch ist nur in Neuronen exprimiert und daher ist es eine weniger komplizierte Färbungsmuster als α-Tubulin (Abbildung 2). GFP-markierten-endogenen-Tau wurde auch als ein Marker für die DA Neuron dendritischen Mikrotubuli 27 verwendet worden. Die Verwendung dieser Marken ist wirksam, aber es sollte darauf hingewiesen werden, dass in den Axon-Termini von the neuromuskulären Synapse futsch speziell Etiketten gebündelt Mikrotubuli 28. Die genaue räumliche Beziehungen zwischen futsch, Tau und Mikrotubuli in DA Dendriten sind noch nicht vollständig charakterisiert werden. In diesem Protokoll haben wir endogenen Mikrotubuli-Organisation gerichtet. Es ist auch möglich, Etikett Mikrotubuli mit Überexpression von GFP markierten Tau oder Tubulin. Es sollte gegen induzierende unerwartete Phänotypen bei Überexpression Ansätze 29 verwendet genommen werden.

In unsere Hände ist immunhistochemische Färbung von Mikrotubuli in DA Neuronen und anderen Körperteilen Wand Gewebe am besten erreicht, wenn der sekundäre Antikörper verwendet, um die anti-Tubulin primärer Antikörper erkennen eine leicht visualisiert Fluorophor wie Alexa Fluor 488 gekoppelt ist. Wenn also die Verwendung von transgenen Tools DA Neuronen im Konzert mit anti-Tubulin-Kennzeichnung z. B. über die Gal4/UAS System, LexA-System oder in MARCM 23 und MARCM Derivate Label, bevorzugen wir Markerproteine ​​mitaus spektrale Überlappung mit dieser sekundären, wie mCD8:: Cherry und mCD8: KO.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei RIKEN für die Finanzierung. P10-Gal4 war eine Art Geschenk Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankreich).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps Dumont 11251-20
Microscissors Fine Science Tools 15000-08
Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) Sigma-Aldrich T9026 Dilution 1/1000
Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant Developmental Studies Hybridoma Bank 22C10 Dilution 1/1000
Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) Caltag MCD0800 Dilution 1/1000
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG Invitrogen A-11001 Dilution 1/500
Cy3 anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 712-166-150 Dilution 1/200

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References

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