Summary
등의 연결을 dendrites 같은 복잡한 세포 모양은, 개발하는 동안 달성하는 방법 이해하기 위하여, 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 미세 소관 조직, 기관, 근육을 검토하는 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명 및 기타
Abstract
복잡한 세포 형태의 차이가 달성되는 방법을 이해하기 위하여, 정확하게 미세 소관 조직을 수행하는 것이 중요합니다. Drosophila 애벌레 바디 벽이 세포와 조직 morphogenesis을 연구하는 모델 몇 가지 세포 유형이 포함되어 있습니다. 예를 들어 tracheae는 튜브 morphogenesis 1, Drosophila의 유충의 감각 뉴런은 일반의 해설과 모수 석의 차별화 2-5와 퇴보 6 신경 세포 수준의 특정 메커니즘에 대한 기본 시스템이되고있는 돌기 arborization (DA)를 검사하는 데 사용됩니다 .
dendrite 가지의 모양은 신경 세포 클래스 사이에 크게 다릅니다, 심지어는 하나의 신경 세포 7,8의 다른 지점 사이에 있습니다. DA의 뉴런의 유전자 연구는 차동 cytoskeletal 조직이 돌기 지점 모양 4,9-11의 형태학의 차이를 기초 수있는 것이 좋습니다. 우리에게 강력한 면역 라벨 방법을 제공DA 감각 신경 dendrite 아버의 생체내의 미세 소관 기관 (그림 1, 2, 영화 1) ssay. 이 프로토콜은 먼저 instar의 유충의 해부와 immunostaining, 활성 감각 신경 세포의 dendrite의 파생물 및 분기 조직 12,13을 발생하는 단계를 보여줍니다.
감각 뉴런을 얼룩뿐만 아니라,이 방법은 강력한 근육의 미세 소관 조직의 라벨 (영화 2, 3),기도 (그림 3, 영화 3), 기타 신체 벽의 조직을 실현하고 있습니다. 그런 메커니즘을 조사하면 신체 벽에 현장에서 미세 소관 조직을 분석하고자 조사에 대한 가치가 컨트롤 조직 및 세포 모양.
Protocol
1. 시약의 준비
시작하기 전에주의 사항 : 해부 및 immunohistochemical 얼룩은 자기 챔버에서 수행되고 유충은 특별히 모양의 곤충 핀을 사용하여 넘어뜨린 것입니다. 자기 챔버 건설, 이들 핀의 준비에 대한 자세한 지침은 관련 참고 문헌 14,15에서 찾을 수 있습니다. 간단히, 1x1cm의 사각형 구멍은 자성 시트 및 소형 챔버를 만들기 위해 시트의 뒤쪽에 부착된 coverslip으로 절단됩니다. 챔버의 측면은 에폭시 접착제로 봉인되며이 접착제는 챔버가 사용하기 전에 70 % 에탄올로 여러 번 씻어입니다 설정한 후. 해부의 곤충 핀은 필요한 모양 벤딩하여 준비하고 금속 탭을 14,15에 붙어 있습니다. 또는 금속 탭을 우리는 컷오프 노란색 팁 만든 핸들 거꾸로 플랫 헤드 스틸 그리기 핀을 사용합니다. 이 자기 챔버 배열의 사용이 가까이 제어 ove 수 있습니다R 핀 위치와 조직 해부 동안 스트레칭.
DA 뉴런의 조사관의 다른 하위 집합에 리포터 유전자 발현을 유발하기 위해서는 몇 가지 Gal4 행 (시모노 및 동료 16 요약)를 사용할 수 있습니다. 이 라인의 대부분은 공공 주식 센터에서 사용할 수 있습니다. 이 대표 프로토콜에서는, 우리는 DA 신경 세포의 대조되는 두 클래스가 공동으로 표시되는 라인의 immunostaining 수행 : 가장 간단한 클래스 I 및 가장 복잡한 수준의 IV (P10 - Gal4 17,18, UAS - mCD8 : : Kusabira - 오렌지 (KO)).
- 칼슘 + + 무료 HL3.1 염분 준비
- MM 년 : 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 자당, 5 trehalose, 산도 7.2 19. 필터 소독 및 저장 4 ° C. 참고 : 칼슘 + + 무료 솔루션 해부하는 동안 근육 수축을 방지합니다.
- 2X PHEM 버퍼를 준비
- MM 년 : 130 파이프, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; 산도 7.0. 필터 소독 및 저장 4 ° C.
참고 : 산도가 7.0 접근 때까지이 자료는 용해되지 않습니다.
- MM 년 : 130 파이프, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; 산도 7.0. 필터 소독 및 저장 4 ° C.
- 고정 바로 앞에 갓 정착액을 준비합니다.
- 50ml 팔콘 튜브에 25ml 솔루션을 먼저 믹스 2g의 paraformaldehyde, 100μl 1M NaOH와 10ml의 물을 준비하기 위해서.
- 솔루션 분명히 때까지 흔드는와 55 ° C의 물을 욕조에 정착액 흔들어. (총 부피는 11.5에 대한 ML됩니다.)
- 얼음 쿨 정착액.
- 12.5ml 2X PHEM 버퍼를 추가합니다.
- 1M HCL과 7.0 산도를 조정합니다.
- 볼륨이 25ml가 될 때까지 물로 솔루션을 채우십시오.
- 워트 먼지 종이를 사용하여 솔루션을 필터링합니다.
2. 애벌레 해부
시작하기 전에 참고 : 감각 dendrites 이들 특히 미세 소관 네트워크를, 그리고 신경 쇠약 증세는 절개의 개시 이후 급속하게됩니다. 교류즉각적인 고정 다음 채 5 분 빠른 절개를 hieving하면이 프로토콜의 성공의 핵심 요인입니다.
- 물에 유충을 씻고 빠르게 머리카락 루프를 사용하여이 드롭으로 그들을 이동합니다.
- 유리에 동양의 유충 등의 측면까지와 복부 쪽. 참고 :이 방향은 복부 클러스터 신경을 검사하는 것입니다. 지느러미 클러스터 신경을 검사하려면 방향을 반전.
- 입 후크 근처 앞쪽에 끝을 핀에 가운데 곤충 핀을 사용합니다. 최상의 결과를 얻으려면 끝에 가까운 핀을 삽입합니다.
- 해부 실에서 HL3.1 식염수 한 방울을 넣으십시오.
- microscissors와 유충의 가장 뒷부분 팁을 잘라. 참고 :이 단계는 microscissors (2.7 단계)에 대한 액세스를 허용합니다 유충의 사후 끝에 구멍을 엽니다.
- 포셉 지금 유충의 사후 끝에 구멍 밖으로 삐져는 창자의 영역과 함께 잡아. 부드럽게 전체 창자를 꺼내.
- 을 장소앞쪽에 향해 배면의 중간선에 따라 조리개와 컷을 통해 microscissors 중 하나 블레이드의 팁.
- 코너 핀 사용하여 다음 앞쪽에 첫번째 사후 지금 무료로 모서리를, 핀. 동시에 부드럽게 애벌레 등심을 열고 스트레칭.
3. 고정, 차단 얼룩, 그리고 애벌레 필레의 장착
시작하기 전에주의 사항 : 모든 고정 및 얼룩 단계는 절개 챔버에서 수행됩니다. 이 과정에서,이 조직의 손상을 초래할 수 있으므로 유충을 잡고 곤충 핀을 노크하지 않도록주의합니다. 밖으로 건조에서 실험을 방지하기 위해 moistened 조직으로 둘러싸인 작은 파티 간다 구 컨테이너의 모든 얼룩 단계를 않습니다.
- 노란 팁을 사용하여 칼슘 + + 무료 HL3.1 버퍼를 기음. 즉시 다른 pipetteman을 사용하여 정착액을 추가합니다.
- 부드럽게 칼슘 + + 무료 HL3.1 버퍼의 남은 흔적과 정착액를 섞어 아래 피펫과챔버 인치 즉시 대기음 후 챔버에 신선한 정착액을 추가합니다.
- 20 분 상온에서 부화.
- PBST에서 배의 상업 중심지 (0.1 %를 튼과 PBS에서 X - 100) 씻으십시오.
- RT에서 20 분 대한 PBST로 5 % 염소 혈청과 차단.
- PBST로 5 % 염소 혈청으로 희석 주 항체와 차단 솔루션을 교체합니다. 사용하는 기본 항체는 마우스 방지 α - Tubulin (DM1A)와 쥐 안티 CD8 (5H10) 모두 희석 1천분의 1입니다.
참고 : 조사는 (토론 참조) 마우스 방지 Futsch (22C10) 일부 상황에서는 20,21 희석 1,000분의 1과 마우스 방지 α - Tubulin (DM1A)를 대체하실 수 있습니다.
- 4 (적어도 16h)을 밤새 품어 ° C.
- PBST에서 배의 상업 중심지 씻으십시오.
- PBST로 5 % 염소 혈청의 희석 보조 항체 솔루션을 추가합니다. 사용되는 이차 항체는 알렉사 형석 488 염소 안티 - 마우스 IgG와 Cy3 당나귀 안티 쥐 IgG 수 있습니다. 형광단을 방지하기 위해 적용 샘플을 유지22 사진 표백.
- 두 시간 동안 RT에서 부화하거나, 또는 야간 4 ° C 상온에서 한 시간 따라갔다.
- PBST에서 배의 상업 중심지 씻으십시오.
- 슬라이드 아래 표피 사이드에있는 애벌레 필릿를 놓고, 80 % 글리세롤에 마운트하고, '빠른'마운트를 위해 매니큐어로 coverslip의 측면을 봉쇄.
참고 : 조직 개선 삭제하고 영구적으로 안정적인 예제, DPX에 마운트 이전 23 설명된대로.
4. 대표 결과 :
형광 염색법은 공촛점 현미경으로 조사되었다. 그림에서는 dendrite 아버 이내에 1-2, 다른 지점 다른 cytoskeletal 조직을했습니다. 그림 1은 1 일 instar 애벌레 단계에서 클래스 IV DA 신경 세포의 아버의 영역을 보여줍니다. KO는 및 보조 안티 CD8 항체 및 형광 (Cy3)을 사용하여 검색 : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다. Tubulin은 안티 α - Tubulin 항체 및 형석을 사용하여 감지escent 보조 (알렉사 형석 488). 주요 지점은 Tubulin 양성 반응이 일부 얇은 사이드 가지 Tubulin - 아무것도 없습니다. 영화 1 클래스 I DA 뉴런과 비슷한 얼룩을 통해 시리얼 섹션의 집합입니다. 그림 2는 1 일 instar 애벌레 단계에서 Futsch와 CD8에 대한 항체 물들일 클래스 IV DA 신경 세포의 아버의 영역을 보여줍니다. 주요 지점 Futsch - 긍정, 일부 얇은 사이드 가지 Futsch - 아무것도 없습니다. 그림 3. 애벌레 바디 벽 Tracheae은 복잡한 미세 소관 조직을 보여줍니다. 영화 2, 3 바디 벽의 근육과 기관을 통해 얼룩의 시리얼 섹션을 표시합니다.
그림 1. 그림. 1 1 일 instar 애벌레 단계에서 클래스 IV DA 신경 세포의 아버의 영역을 보여줍니다. : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다 : KO 및 안티 - CD8 항체 및 형광 보조 (Cy3)을 사용하여 발견했습니다. Tubulin은 안티 - & - Tubuli를 사용하여 감지N 항체 및 형광 보조 (알렉사 488). 기본에 패널 AC 순차적 공촛점 Z - 섹션 (0.5μm), C' - C "와 (과 노란색 화살촉) 또는 microtubules가 강조 표시됩니다 (보라색 화살촉)가없는 지점의 패널 C. 예제에서 단일 항체 얼룩. 레드 화살촉 하이라이트 microtubules 상피 세포.
그림 2. 그림. 2 1 일 instar 애벌레 단계에서 Futsch와 CD8에 대한 항체 물들일 클래스 IV 다 신경 세포의 아버과 비슷한 영역을 보여줍니다. : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다 : KO 및 안티 - CD8 항체 및 형광 보조 (Cy3)을 사용하여 발견했습니다. Futsch는 안티 Futsch 항체 및 형광 보조 (알렉사 488)를 사용하여 감지됩니다. 주요 지점 Futsch - 긍정, 일부 얇은 사이드 가지 Futsch - 아무것도 없습니다. 와 (과 노란색 화살촉) 또는 (보라색 화살촉) Futsch하지 않고 가지의 예제가 강조 표시됩니다.
그림 3. 기관은 위에서 설명한 안티 Tubulin 프로토콜을 사용하여 얼룩. 이 유충은 셋째 instar하고 이전에 23,24을 설명한대로 해부 했어요. 영화 3 사각형으로 표시된 필드에서 확대 시리얼 섹션을 보여줍니다.
영화 1. 직렬 부분은 내가 신경 클래스의 돌기 아버 걸쳐 Tubulin의 얼룩을 추적. KO (마젠타) 및 보조 안티 CD8 항체 및 형광 (Cy3)을 사용하여 검색 : 전체 아버은 mCD8로 표시되어있다. Tubulin은 (녹색) 반 α - Tubulin 항체 및 형광 보조 (알렉사 형석 488)를 사용하여 감지됩니다. 규모 : 비디오 이미지의 한쪽이 섹션에서 46.88μm에 해당합니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
몸매에 Tubulin의 얼룩을 추적 영화 2. 직렬 섹션삼분의 일 instar의 유충의 Y 벽의 근육. Tubulin은 반 α - Tubulin 항체 및 형광 보조 (알렉사 형석 488)를 사용하여 감지됩니다. 규모 : 비디오 이미지의 한쪽이 섹션에서 46.88μm에 해당합니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3. Figure.3에 사각형으로 표시된 삼분의 일 instar의 유충의 시체가 벽에 기관에서 Tubulin의 얼룩을 추적 시리얼 섹션. Tubulin은 반 α - Tubulin 항체 및 형광 보조 (알렉사 형석 488)를 사용하여 감지됩니다. 규모 : 비디오 이미지의 한쪽이 섹션에서 46.88μm에 해당합니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
그것을 달성하는 방법 복잡한 세포 모양 이해하기 위해서는 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 분석 미세 소관 기관에 대한 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명합니다. 얼룩 감각 신경뿐만 아니라,이 방법은 기관, 근육 및 다른 신체 벽면 조직의 강력한 immunohistological 얼룩을 구현합니다.
우리는 DA의 뉴런의 개발 감각 dendrites의 미세 소관 조직을 검사하기 위해이 프로토콜을 사용합니다. 이러한 dendrites가 부상을 입거나 스트레스 25에 민감하고, 해부 23 시작 이후 빠른 속도로 다운 휴식. 해부 다섯 분 이내에 실시하여야한다. 기관 및 기타 바디 벽의 조직에 Microtubules 더 안정됩니다. 이 프로토콜은 신경근육학 접합 14,15의 분석을 위해 애벌레 필레 준비를 사용하는 사람에서 적응하고, 빠른 F에 최적화되어 있습니다빠른 절개 후 ixation.
DA의 뉴런, overlying 근육에 강력한 안티 Tubulin의 얼룩, 그리고 근본적인 상피 세포 26 dendrites을 분석하면 것은 복잡한 얼룩 패턴 (그림 1, Movie1)를 가져올 수 있습니다. 여러 직렬 섹션을 통해 돌기 얼룩 (Movie1)의 추적 그래서주의는 검사 신경 dendrite 아버에있는 미세 소관 조직의 전체 분석을 위해 필요할 수 있습니다. MAP1B, Futsch 20,21의 특정 Drosophila의 homologue하는 단클론 항체는 또한 Drosophila 말초 신경계 5,9,20에있는 미세 소관의 cytoskeleton 레이블을 사용할 수 있습니다. Futsch은 뉴런로 표현하고 따라서 그것은 α - Tubulin (그림 2)보다 덜 복잡한 얼룩 패턴을 생산하고 있습니다. GFP - 태그 - 내생 - 타우도 DA 신경 세포의 돌기 microtubules 27 마커로서 사용되고 있습니다. 이러한 마커의 사용은 효과가 있지만, 그것은 지적되어야한다는 세기의 축삭 - 테르의전자 신경근육학 교차점 Futsch는 특히 번들 microtubules 28 레이블. Futsch, 타우, 그리고 검찰 dendrites에 microtubules 사이의 정확한 공간적 관계는 완전히 특징으로 아직 있습니다. 이 프로토콜에서는 내생적인 미세 소관 조직을 해결했습니다. 또한 GFP 태그 타우 또는 Tubulin의 overexpression을 사용하여 레이블 microtubules 수 있습니다. 주의 overexpression 접근 방식이 29 사용할 때 예기치 못한 phenotypes를 유도 대해 주의해야한다.
우리 손에, DA의 뉴런과 다른 신체 벽면 조직의 microtubules의 immunohistochemical 얼룩이 가장 안티 - Tubulin 차 항체를 검출하는 데 사용되는 보조 항체가 이러한 알렉사 형석 488으로 쉽게 - 시각 형광단에 결합되었을 때 이루어진다. 따라서 Gal4/UAS 시스템, LexA 시스템, 또는 MARCM 23 MARCM 파생 상품을 통해 안티 - tubulin의 상표 예와 함께 콘서트에 검찰의 신경을 레이블 유전자 변형 도구를 사용하는 경우, 우리는 함께 마커 단백질을 선호: 벚꽃과 mCD8 : : : KO이 mCD8 같은 보조, 같은과 스펙트럼 중복보세요.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 자금에 대한 RIKEN 주셔서 감사합니다. P10 - Gal4은 알랭 빈센트 (Université 폴 Sabatier, 툴루즈, 프랑스)의 일종 선물했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
References
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