Summary
Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en andere
Abstract
Om te begrijpen hoe verschillen in complexe cellen vormen zijn bereikt, is het belangrijk om nauwkeurig te volgen microtubuli organisatie. De Drosophila larven lichaam muur bevat verschillende celtypen die zijn modellen om cellen en weefsels morfogenese bestuderen. Bijvoorbeeld luchtpijp worden gebruikt om de buis morfogenese 1, en de dendritische arborization (DA) sensorische neuronen van de Drosophila larven hebben een primaire systeem worden voor de opheldering van algemene en neuron-class-specifieke mechanismen van dendritische differentiatie 2-5 en degeneratie zes onderzoeken .
De vorm van dendriet takken kunnen sterk variëren tussen neuron klassen, en zelfs tussen verschillende takken van een enkel neuron 7,8. Genetische studies in DA neuronen suggereren dat differentieel organisatie van het cytoskelet kan morfologische verschillen in dendritische branche vorm 4,9-11 ten grondslag liggen. Wij bieden een robuuste immunologische etikettering methode om eenssay in vivo microtubuli organisatie in DA sensorische neuron dendriet prieel (figuren 1, 2, Film 1). Dit protocol geeft de dissectie en immunokleuring van de eerste instar larve, een stadium waarin actieve sensorische neuron dendriet uitgroei en vertakking organisatie is 12,13 optreedt.
In aanvulling op vlekken sensorische neuronen, deze methode bereikt robuuste kenmerken van microtubuli organisatie in de spieren (Movies 2, 3), luchtpijp (Figuur 3, Movie 3), en andere lichaamsdelen muur weefsels. Het is waardevol voor onderzoekers die willen microtubuli organisatie te analyseren in situ in het lichaam muur bij het onderzoek naar de mechanismen die de controle weefsels en cellen vorm.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
Opmerkingen voor het begin van: Dissection en immunohistochemische kleuring worden uitgevoerd in een magnetische kamer en de larve wordt vastgepind met behulp van speciaal gevormde insect pinnen. Gedetailleerde instructies voor de bouw van een magnetische kamer, en voorbereiding van deze pinnen is te vinden in gerelateerde referenties 14,15. In het kort, is een 1x1cm vierkant gat gesneden in een magnetische plaat en een dekglaasje aangebracht op de achterkant van het blad naar een kleine kamer te maken. De zijkanten van de kamer worden afgedicht met epoxy lijm, na deze lijm heeft de kamer wordt meerdere malen gewassen met 70% ethanol voor gebruik. Dissectie insect pinnen worden bereid door het buigen naar de gewenste vorm en vervolgens gelijmd op een metalen lipje 14,15. Als alternatief voor een metalen lipje, hebben we gebruik gemaakt van een omgekeerde platte kop stalen punaise met een handvat gemaakt van een cut-off geel tip. Het gebruik van deze magnetische kamer regeling laat ove nauwe controler pin positionering en weefsel stretchen tijdens de dissectie.
Te rijden reporter gen-expressie bij verschillende subgroepen van DA neuronen onderzoekers kunnen gebruik maken van verschillende Gal4 regels (samengevat door Shimono en collega's 16). Veel van deze lijnen zijn verkrijgbaar bij de openbare voorraad centra. In deze vertegenwoordiger protocol, voeren we immunokleuring van een lijn waarin twee contrasterende klassen van DA neuron zijn co-label: de meest eenvoudige klasse I en meest complexe-klasse IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).
- Bereid Ca + +-vrij HL3.1 zoutoplossing
- In mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sucrose, trehalose en 5; pH 7,2 19. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C. Let op: Ca + +-vrije oplossing voorkomt dat spiercontractie tijdens de dissectie.
- Bereid 2x PHEM buffer
- In mm: 130 BUIZEN, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C.
Opmerking: Deze materialen zullen niet oplossen totdat de pH 7,0 benaderingen.
- In mm: 130 BUIZEN, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C.
- Vers bereiden de fixeermiddel onmiddellijk voor de fixatie.
- Met het oog op een 25ml oplossing, eerste mix 2g paraformaldehyde, 100μl 1M NaOH en 10 ml water voor te bereiden in een 50 ml Falcon buis.
- Schudden fixatief in een 55 ° C waterbad met shaker tot de oplossing helder is. (Totaal volume zal ongeveer 11,5 ml zijn.)
- Cool fixeermiddel op het ijs.
- Voeg 12.5ml 2x PHEM buffer.
- Breng de pH op 7,0 met 1M HCl.
- Vul de oplossing met water tot het volume is 25ml.
- Filtreer de oplossing met behulp van Whatman papier.
2. Larvale dissectie
Let op voordat u begint: microtubuli netwerken, en met name die in sensorische dendrieten, zal afbraak snel na de start van dissectie. Achieving snel dissectie in minder dan vijf minuten gevolgd door onmiddellijke fixatie zijn de belangrijkste factoren voor het succes van dit protocol.
- Was de larve in het water en ze snel te verplaatsen naar deze daling met behulp van een lus van haar.
- Oriënteer de larve dorsale zijde omhoog en de ventrale zijde op het glas. Opmerking: Deze oriëntatie is te onderzoeken of het ventrale cluster neuronen. Om te onderzoeken dorsale cluster neuronen, keren de oriëntatie.
- Gebruik het centrum insect-pin aan het voorste einde nabij de monding haken pin. Plaats de pin dicht bij het einde voor het beste resultaat.
- Breng een druppel HL3.1 zoutoplossing in de dissectie kamer.
- Snijd de zeer achterste punt van de larve af met microscissors. Opmerking: Deze stap opent een opening aan het achterste eind van de larve die de toegang voor de microscissors (stap 2.7) zal toestaan.
- Pak met de tang de regio van darm, die nu buiten steken van de opening aan het achterste eind van de larve. Trek de hele darm.
- Plaats hetpunt van een mes van de microscissors door de opening en snijd langs de ventrale middellijn naar de voorste.
- Met behulp van de hoek pinnen, pin het nu gratis hoeken, posterior eerst, dan anterior. Tegelijkertijd voorzichtig rekken open de larvale filet.
3. Fixatie, blokkeren, vlekken, en montage van larvale filets
Opmerkingen voor het begin van: Alle fixatie en kleuring stappen worden uitgevoerd in het dissectie kamer. Tijdens dit proces, pas dan op dat het insect pinnen die de larve, omdat dit kan leiden tot weefselschade kloppen. Om te voorkomen dat het experiment uitdroogt, doe alle vlekken stappen in een klein Tupperware container, omringd door vochtige weefsels.
- Zuig het Ca + +-vrij HL3.1 buffer met behulp van een gele tip. Onmiddellijk toevoegen het fixeermiddel met een andere pipetteman.
- Voorzichtig pipet op en neer om het fixeermiddel mengen met de resterende sporen van Ca + +-vrij HL3.1 bufferin de kamer. Onmiddellijk aspireren en dan voegen we verse fixatief in de kamer.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Was 6x 10 minuten in PBST (0,1% Triton X-100 in PBS).
- Blok met 5% geit serum in PBST voor 20 minuten bij RT.
- Vervang het blokkeren oplossing met primaire antilichamen verdund in 5% geit serum in PBST. De gebruikte primaire antilichamen zijn muis anti-α-tubuline (DM1A) en de rat anti-CD8 (5H10) zowel verdund 1 / 1000.
Opmerking: De onderzoeker wenst te muis anti-α-tubuline (DM1A) vervangen met muis anti-Futsch (22C10) 20,21 verdund 1 / 1000 in bepaalde omstandigheden (zie bespreking).
- Incubeer overnacht (minstens 16 uur) bij 4 ° C.
- Was 6x 10 minuten in PBST.
- Voeg secundair antilichaam verdund in 5% geit serum in PBST. De gebruikte secundaire antilichamen worden Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG en Cy3 ezel anti-rat IgG. Houd het monster bedekt om te voorkomen dat fluorofoorfoto-bleken 22.
- Incubeer hetzij bij RT gedurende twee uur, of overnacht bij 4 ° C, gevolgd door een uur bij kamertemperatuur.
- Was 6x 10 minuten in PBST.
- Plaats de larvale filet op de dia nagelriem naar beneden, de berg in 80% glycerol, en verzegelen de zijkanten van het dekglaasje met nagellak voor een 'snelle' te monteren.
Opmerking: Voor een betere weefsel clearing, en een permanent stabiele monster, monteren in DPX zoals eerder beschreven 23.
4. Representatieve resultaten:
Fluorescerende kleuring werd onderzocht onder een confocale microscoop. In de figuren 1-2, verschillende branches binnen een dendriet prieel hebben verschillende organisatie van het cytoskelet. Figuur 1 toont een regio van het prieel van een klasse IV DA neuron op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO en gedetecteerd met behulp van een anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti α-tubuline antilichaam en fluorescent secundair (Alexa Fluor 488). De belangrijkste branches positief zijn voor tubuline, sommige dunne zijtakken zijn tubuline-negatief. Film 1 is een set van seriële secties door een soortgelijke kleuring van een klasse I DA neuron. Figuur 2 toont een regio van het prieel van een klasse IV DA neuron gekleurd met antilichamen tegen Futsch en CD8 op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De belangrijkste takken zijn Futsch-positief, wat dunne zijtakken zijn Futsch-negatief zijn. Figuur 3. Luchtpijpen in het larvale lichaam muur tonen een complex microtubule organisatie. Movies 2 en 3 tonen seriële secties van verkleuring door het lichaam muur spieren en luchtpijp.
Figuur 1. Fig. 1 toont een regio van het prieel van een klasse IV DA neuron op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO en gedetecteerd met behulp van anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti-&-tubulin antilichamen en fluorescente secundaire (Alexa 488). Panelen AC opeenvolgende confocale z-profielen (0.5μm), C'-C ", een antilichaam vlekken uit panel C. Voorbeeld van takken met (gele pijl) of zonder (paars pijlpunt) microtubuli worden gemarkeerd. Red pijlpunten hoogtepunt microtubuli in de onderliggende epitheliale cellen.
Figuur 2. Fig. 2 toont een vergelijkbare regio's van het prieel van een klasse IV da neuron gekleurd met antilichamen tegen Futsch en CD8 op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO en gedetecteerd met behulp van anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Futsch wordt gedetecteerd met behulp van anti-Futsch antilichaam en fluorescerende secundaire (Alexa 488). De belangrijkste takken zijn Futsch-positief, wat dunne zijtakken zijn Futsch-negatief zijn. Voorbeeld van takken met (gele pijl) of zonder (paars pijlpunt) Futsch worden gemarkeerd.
Figuur 3. Luchtpijp gekleurd met het anti-tubuline protocol hierboven beschreven. Deze larve is de derde larvestadium en ontleed zoals eerder beschreven 23,24. Movie 3 toont vergroot seriële secties van het gebied gekenmerkt door een vierkant.
Film 1. Serial secties tracing Tubuline vlekken in de dendritische prieel van een klasse I neuron. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO (Magenta) en gedetecteerd met behulp van anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Tubuline (groen) wordt gedetecteerd met behulp van een anti-α-tubuline antilichaam en tl-secundair (Fluor Alexa 488). Schaal: de ene kant van de video beeld komt overeen met 46.88μm in de sectie. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 2. Serial secties tracing Tubuline kleuring in body wand spieren van een derde instar larve. Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti-α-tubuline antilichaam en tl-secundair (Fluor Alexa 488). Schaal: de ene kant van de video beeld komt overeen met 46.88μm in de sectie. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 3. Serial secties tracing Tubuline kleuring in een lichaam muur luchtpijp van een derde instar larve, gemarkeerd met een plein in Figure.3. Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti-α-tubuline antilichaam en tl-secundair (Fluor Alexa 488). Schaal: de ene kant van de video beeld komt overeen met 46.88μm in de sectie. Klik hier om de film te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om te begrijpen hoe complex cel vormen zijn bereikt, is het belangrijk om te kunnen nauwkeurig test microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode voor het testen van microtubuli organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten. In aanvulling op vlekken sensorische neuronen, deze methode bereikt robuuste immunohistologische kleuring van luchtpijp, spieren en andere lichaamsdelen muur weefsels.
Wij gebruiken dit protocol om microtubuli organisatie te onderzoeken in het ontwikkelen van zintuiglijke dendrieten van de DA neuronen. Deze dendrieten zijn zeer gevoelig voor verwondingen of stress 25, en snel af te breken na het begin van de dissectie 23. Dissection moeten worden uitgevoerd binnen vijf minuten of minder. Microtubuli in de luchtpijp en andere lichaamsdelen wand weefsels meer stabiel. Dit protocol is een bewerking van die gebruikt worden voor te bereiden larven filets voor de analyse van de neuromusculaire overgang 14,15, en is geoptimaliseerd voor een snelle fixation na een snelle dissectie.
Bij het analyseren van de dendrieten van de DA neuronen, robuuste anti-tubuline kleuring in bovenliggende spier, en de onderliggende epitheliale cellen 26 kan leiden tot een gecompliceerde kleuringspatroon (Figuur 1, film1). Vandaar dat een zorgvuldige tracering van dendritische vlekken door verschillende seriële secties (film1) kan nodig zijn voor een volledige analyse van microtubuli organisatie in de DA neuron dendriet prieel. Monoklonale antilichamen tegen de specifieke Drosophila homoloog van MAP1B, Futsch 20,21, kan ook worden gebruikt om de microtubuli cytoskelet label in de Drosophila perifere zenuwstelsel 5,9,20. Futsch wordt uitgedrukt alleen in neuronen en dus het produceert een minder ingewikkelde kleuringspatroon dan α-tubuline (Figuur 2). GFP-gelabelde-endogeen-Tau is ook gebruikt als een marker van de DA neuron dendritische microtubuli 27. Het gebruik van deze markers is effectief, maar dient te worden opgemerkt dat in de axon-uiteinden van stee neuromusculaire junctie Futsch etiketten die speciaal zijn gebundeld microtubuli 28. De exacte ruimtelijke relaties tussen de Futsch, Tau, en microtubuli in DA dendrieten zijn nog niet volledig gekarakteriseerd. In dit protocol hebben we aangepakt endogene microtubuli organisatie. Het is ook mogelijk om het etiket microtubuli met overexpressie van GFP gelabelde Tau of tubuline. Zorg moet worden genomen tegen het induceren van onverwachte fenotypes bij overexpressie benaderingen worden gebruikt 29.
In onze handen, is immunohistochemische kleuring van microtubuli in DA neuronen en andere lichaamsdelen wand weefsels best bereikt wanneer de secundaire antilichamen gebruikt worden om de anti-tubuline primaire antilichaam te detecteren is gekoppeld aan een eenvoudig te visualiseren, zoals fluorofoor Alexa Fluor 488. Vandaar dat bij het gebruik van transgene tools om DA neuronen in overleg label met anti-tubuline etikettering bijvoorbeeld via het Gal4/UAS systeem, LexA-systeem, of in MARCM 23 en MARCM derivaten, geven we de voorkeur marker-eiwitten metuit spectrale overlap met deze secundaire, zoals mCD8:: Cherry-en mCD8:: KO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken RIKEN voor financiering. P10-Gal4 was een soort geschenk van Alain Vincent (Universite Paul Sabatier, Toulouse, Frankrijk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
References
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Ramon y Cajal, S. Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , Oxford University Press. (1911).
- London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
- Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
- Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
- Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
- Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
- Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
- Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
- Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
