描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株,称为停机坪株,外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合,通过共轭ΦC31整合表达。
可用于细菌染色体的稳定保持在大型基地范围内1外源DNA。整合到染色体复制质粒,质粒稳定性,质粒不相容性和质粒拷贝数变异,如规避的问题。这种方法使用从链霉菌噬菌体(Φ)C31的2,3特定地点的整合。 ΦC31整合酶催化两个特定的DNA位点之间的直接重组:attB和attP(34和39个基点,分别)4。此重组是稳定的,并没有恢复5。一个“着陆垫”(LP)的1霉素抗性基因,AADA(SPR),和大肠杆菌组成的序列大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因(uidA基因 )两侧attP网站已整合到苜蓿根瘤菌,Ochrobactrum anthropi,在区域间的农杆菌染色体, 上午PC轨迹和的TETA轨迹,分别与根瘤菌用于在该协议。捐助动员的载体侧翼1填塞红色荧光蛋白(RFP)基因和抗生素抗性基因的attB网站也已建成。在这个例子中使用庆大霉素的耐药质粒pJH110。使用SPH我和 Pst一所需的结构可能会被替换的RFP基因6另外attB网站两侧,可能是一种人工合成的构造子克隆到动员的载体,如pK19mob 7。由lac启动子驱动的ΦC31整合(克隆pHS62 8)基因的表达质粒pRK7813 9上动员的广泛的寄主范围。
一个tetraparental交配协议用于转移到捐助盒的LP菌株,从而取代捐助卡带在LP序列标记。这些细胞的移植S-稳定整合。横贯稳定整合,形成了0.5%的典型效率。横贯稳定整合通常是发现在第一500-1000菌落筛选抗生素的敏感性,或用5 – 溴-4 – 氯-3 – 吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸(X GLUC)蓝白筛选。该协议包含用于创建和隔离跨稳定整合的交配和选拔程序。
该的IMCE技术允许为一个单一的attB两侧LP轨迹以前工程菌的DNA磁带的有效整合。一旦RFP创建捐助盒克隆所需的构造,该技术并不需要随后的DNA纯化和改造,使得它非常健壮。这是至关重要的,包括适当的生长控制,是某些抗生素耐药性是由于建立反稳定整合,而不是其他因素。
IMCE生产效率约0.5%的反式稳定整合。相反,通过同源重组的双重交叉发生在约10 -6?…
The authors have nothing to disclose.
请提供整合克隆玛格丽特厘米史密斯
资金支持:
加拿大基因组/基因组大草原
NSERC发现和战略项目赠款
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
SmUW227 strain | In house, available by request |