En snabb och effektiv metod för att integrera främmande DNA av intresse i färdiga acceptor stammar, sk landning pad stammar, beskrivs. Metoden tillåter platsspecifik integration av ett DNA-kassett in i den konstruerade landningsplats lokus för en given stam, genom konjugering och uttryck av ΦC31 integras.
Den bakteriella kromosomen kan användas för att stabilt hålla främmande DNA i mega-basen intervallet 1. Integrering i kromosomen kringgår frågor som plasmidreplikation, plasmidstabilitet, plasmid inkompatibilitet och plasmidkopieantalet varians. Denna metod används platsspecifika integras från Streptomyces fag (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integras katalyserar en direkt rekombination mellan två specifika DNA webbplatser: attB och attP (34 och 39 bp respektive) 4. Denna rekombination är stabil och inte återgå 5. En "landning dyna" (LP)-sekvens bestående av en spektinomycin-resistensgen, aadA (SPR), och E. coli ß-glukuronidasgenen (uidA) flankerad av ATTP ställen har integrerats i kromosomerna i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi och Agrobacterium tumefaciens i en intergenregion, AMpC-lokuset och den tetA-lokuset, respektive. S. meliloti används i detta protokoll. Mobiliserbara donator vektorer innehållande attB-ställen som flankerar en stuffer röd fluorescerande protein (RFP)-genen och en gen för antibiotikaresistens har också konstruerats. I detta exempel är gentamicin resistenta plasmiden pJH110 används. RFP-genen 6 kan ersättas med en önskad konstruktion med användning av Sphl-och Pstl Alternativt en syntetisk konstruktion flankerad av attB ställen kan vara sub-klonades in i en mobiliserbar vektor såsom pK19mob 7. Uttrycket av ΦC31 integras-genen (klonad från pHS62 8) drives av lac-promotorn, på en mobiliserbar brett värdområde plasmiden pRK7813 9.
En tetraparental parning protokoll används för att överföra givaren kassetten in i LP-stam därigenom ersätta markörer i LP-sekvensen med givaren kassetten. Dessa celler är trans-integranter. Trans-integranter är utformade med en typisk effektivitet av 0,5%. Trans-integranter normalt återfinns inom de första 500-1,000 kolonier screenades genom antibiotikakänslighet eller blå-vit screening med användning av 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-glukuronsyra (X-gluc). Detta protokoll innehåller parning och urvalsförfaranden för att skapa och isolera trans-integranter.
Den IMCE Tekniken möjliggör effektiv integrering av ett enda flankerad attB DNA-kassett till LP-platsen för en tidigare konstruerad stam. När den önskade konstruktionen klonas i stället för RFP för att skapa givaren kassetten kräver tekniken inte efterföljande DNA rening och transformation, vilket gör det mycket robust. Det är viktigt att lämpliga tillväxt kontroller ingår, för att vara säker på att antibiotikaresistens beror på skapandet av trans-integranter och inte andra faktorer….
The authors have nothing to disclose.
Margaret CM Smith vänligt ge integras klonen
Finansiering stöd från:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery och strategiska projektbidrag
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
SmUW227 strain | In house, available by request |