Summary
Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.
Abstract
De bacteriële chromosoom kan worden gebruikt om vreemd DNA stabiel te houden in de mega-base bereik 1. De integratie in het chromosoom omzeilt onderwerpen als plasmide replicatie, plasmide stabiliteit, plasmide onverenigbaarheid, en plasmide aantal kopieën variantie. Deze methode maakt gebruik van de site-specific integrase van de Streptomyces faag (Φ) C31 2,3. De ΦC31 integrase katalyseert een directe recombinatie tussen twee specifieke DNA-sites: attB en attP (34 en 39 bp, respectievelijk) 4. Dit recombinatie stabiel is en niet terug 5. Een "landingsplaats" (LP) sequentie bestaande uit een spectinomycine-resistentiegen, aada (SPR) en E. coli ß-glucuronidase gen (uidA) geflankeerd door attP plaatsen is geïntegreerd in de chromosomen van Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi en Agrobacterium tumefaciens in een intergene regio, de ampc locus en de TETA locus respectievelijk. S. meliloti wordt in dit protocol. Mobiliseerbare vectoren die donor attB flankeren een stuffer rood fluorescent eiwit (RFP) gen en een antibioticumresistentiegen zijn aangelegd. In dit voorbeeld gentamicine resistente plasmide pJH110 gebruikt. De RFP gen 6 kan worden vervangen door een gewenste construct met Sphl en Pst I. Als alternatief kan een synthetische construct geflankeerd door attB sites kunnen sub-gekloneerd is in een mobiliseerbare vector, zoals pK19mob 7. De expressie van het ΦC31 integrase gen (gekloneerd pHS62 8) wordt aangedreven door de lac-promotor, een mobiliseerbare breed gastheerbereik plasmide pRK7813 9.
Een tetraparental koppelen protocol wordt gebruikt om de donor cassette over in de LP stam en vervangt de merkers met de LP sequentie met de donor cassette. Deze cellen zijn trans-integranten. Trans-integranten gevormd met een typische rendement van 0,5%. Trans-integranten zijn kenmerkend in de eerste 500-1000 kolonies gescreend met antibiotica gevoeligheid of blauw wit screenen met 5-bromo-4-chloor-3-indolyl-ß-D-glucuronzuur (X-Gluc). Dit protocol bevat de paren en de selectieprocedures voor het maken en isoleren van de trans-integranten.
Protocol
1. Productie van Cultuur
- Bereid steriele vloeibare media: TY 10 (5 g / l trypton, 3 g / l gistextract, 0,44 g / l calciumchloride dehydrateren) en LB 11 (10 g / l trypton, 5 g / l gistextract, 5 g / natriumchloride, pH 7).
- Inoculeer uit een kolonie: SmUW227 (S. meliloti LP-stam: de bouw zal elders worden beschreven, stam bouw details zijn beschikbaar op aanvraag) () in 5 ml TY media met 50 ug / ml spectinomycine. Inoculeer de volgende stammen in 5 ml LB vloeibare media, aan te vullen met de gegeven antibiotica: E. coli DH5a 12 met pJC2 de integrase expressieplasmide, met 10 ug / ml tetracycline, E. coli MT616 13, mobilisator, met 10 ug / ml chlooramfenicol en E. coli DH5a bevattende pJH110 de donor cassette plasmide met 5 pg / ml gentamicine.
- Incubate E. coli-stammen 's nachts op 37 ° C met een constante schudden. Incubate S. meliloti rek bij 30 ° C voor twee dagen schudden. Het is mogelijk om een S. meliloti cultuur 's nachts met een grotere inoculum (1:500 subcultuur van een verzadigde cultuur).
2. De bereiding en de Mixing
- Was 1,5 ml van de cultuur voor elke stam door het verzamelen van de cel pellet door middel van centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 30 seconden en resuspenderen in 1 ml steriele 0,85% NaCl, herhaal een keer.
- Hersuspenderen pellet in 100 ul steriel 0,85% NaCl.
- Individueel spot 10 ul van gewassen cultuur voor elke stam op een vlakte TY agarplaat. Deze vlekken zijn controle-plekken.
- Voeg 40 pi van elke stam exclusief E. coli DH5a 12 met pJC2 in een steriele buis mix en spot 120 pi van dit mengsel op een vlak TY agarplaat. Deze plek is de no-integrase negatieve controle.
- Voeg 40 pi van elke stam in een steriele tUbe, mix, en spot 160 pi van dit mengsel op een vlakte TY agarplaat. Deze plek is de IMCE paring plaats.
- Laat plekken te drogen in een laminaire stroming kap.
- Seal platen en incuberen bij 30 ° C geroerd.
3. Isolatie van Trans-integranten
- Strook controle vlekken en IMCE spot op TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine (SmUW227 berust op Rm1021 die een mutatie verleend op hoog niveau tegen streptomycine 14 draagt) en 30 ug / ml gentamicine.
- Voor de berekening van de IMCE efficiëntie, mengen ongeveer ¼ van de IMCE paring plaats in 500 pi steriel 0,85% NaCl. Maak 10-voudige seriële verdunningen tot 10 -7. Plaat verdunningen 10 -2 via 10 -5 op TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine en 30 ug / ml gentamicine, om te selecteren op trans-integranten. Plaat verdunningen 10 -3 thrdoorgedreven 10 -7 op TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine, te selecteren voor trans-integranten potentiële ontvangers, dus totaal ontvangers.
- Voor isolatie van markerless trans-integranten mengen ongeveer een kwart van de IMCE paren plaats in 500 ul steriel 0,85% NaCl. Maak 10-voudige seriële verdunningen tot 10 -6. Plaat verdunningen 10 -4-10 -6 vier TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine en 200 ng / ml X-Gluc.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
- Bekijk RFP trans-integranten onder groen licht (525 nm) en door een rood filter (> 610 nm) 15.
- Bereken het percentage IMCE efficiëntie CFU trans-integranten opzichte van de totale CFU ontvangers. Ongeveer de helft van de trans-integranten zal hebben ondergaan, waar cassette uitwisseling waardoor ze wit en spectinomycine gevoelig.
- Om de markerless trans-integranten (w vindenhier donor vector geen Gm r bevat zoals in pJH110) scherm een witte kolonie (langere incubatieperiode 1-2 extra dagen bij kamertemperatuur wordt de differentiatie van kolonies via X-Gluc verbeteren, dit noodzakelijk S. meliloti SmUW227), bevestigen de kolonie spectinomycine gevoeligheid door middel van screening op een TY agarplaat zonder antibiotica en een TY agarplaat met 100 ug / ml spectinomycine.
4. Representatieve resultaten
Na drie dagen van incubatie op TY aangevuld met streptomycine en gentamicine de controle strepen mag geen groei. De IMCE strook moet confluent groei van de kop strook en veel kolonies op de tweede strook, zoals in figuur 2. De efficiëntie van trans-integratie, uitgedrukt als het percentage trans-integranten de totale ontvangers, moet in het bereik van 0,5%. Ongeveer de helft van de trans-integranten zal spectinomycine gevoelig en witHiermee tonen ze hebben ondergaan waar cassette uitwisseling. Trans-integranten met de tester RFP donor cassette van pJH110 getoond moet worden onderscheiden RFP fluorescentie wanneer bekeken onder groen licht (525 nm) en door een rood filter (> 610 nm) 15.
. Figuur 1 Conjugation mengsel illustratie: Met behulp van de expressie van de genen van overdracht pRK600, worden alle plasmiden willekeurig overgebracht van cel tot cel. Deze overdracht resulteert in de creatie van de trans-integranten in het mengsel, door overname van de LP-stam van de twee plasmiden die nodig zijn voor IMCE, de integrase (int) helper plasmide pJC2 en de donor plasmide pJH110. De donor cassette van de niet-replicerende donor plasmide (pJH110) wordt uitgewisseld via ΦC31 integrase activiteit met merkers van de LP-cassette op het chromosoom, waardoor het verlies van de LP-merkers (Spr en uidA) en het behoud van de donor cassette (RFP en Gm r) in het resulterende trans-integrand.
Figuur 2. A:. Paring spot plaat op een niet-selectieve TY plaatje, waar gedroogde cel mengsels op agar oppervlak B: Mating vlekken strepen op de streptomycine-gentamicine-X-Gluc plaat, van linksboven met de klok mee geen integrase controle, IMCE in S. meliloti, E. coli DH5a bevattende pJC2 en E. coli DH5a bevattende pJH110 en E. coli MT616 controle, en S. . meliloti UW227 controle C: 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-X-Gluc agar D:. 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-gentamicine-X-Gluc agar (blauwe kolonies zijn single recombinanten, witte kolonies hebben ondergaan waar. cassette uitwisseling) E: 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-X-Gluc agar tonen een gebrek aan fluorescentie F:. 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-gentamicine-X-Gluc agar met twee niveaus van de fluorescentie (helderder kolonies komen overeen met blauwe kolonies en hebben een hogere RFP uitdrukking vermoedelijk als gevolg van de promotor lezen-maar van vector-sequentie, waar kolonies te hebben ondergaan, waar-cassette uitwisseling bevatten RFP met alleen haar directe promotor zonder read-through van de lac promotor in de vector, die afwezig is.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De IMCE techniek maakt het mogelijk voor de efficiënte integratie van een enkele attB geflankeerd DNA-cassette in de LP-locus van een eerder ontworpen stam. Zodra de gewenste construct wordt gekloond in plaats van RFP aan de donor cassette te creëren, is de techniek niet nodig latere DNA-zuivering en transformatie, waardoor het zeer robuust. Het is cruciaal dat goede groei controles zijn opgenomen, om zeker te zijn van de resistentie tegen antibiotica is het gevolg van het ontstaan van trans-integranten en niet op andere factoren.
IMCE produceert trans-integranten ongeveer 0,5% rendement. Daarentegen dubbele kruisen via homologe recombinatie plaatsvindt met een frequentie van ongeveer 10 -6. Recombineering via λ-rood 16, een ander faag gebaseerd systeem, vereist specifieke homologie, en is gevarieerd effectiviteit buiten de E. coli 17. Nog een andere optie, Tn7 site specific recombinatie vereist attTn7 plaatsen 18 4,19. Hoewel het gebruik van ΦC31 integrase vereist voor constructie van een gastheer, is niet beperkt tot bepaalde stammen. IMCE heeft de voordelen van efficiency en modulariteit gezien het feit dat elke donor cassette kan mogelijk worden geïntegreerd in elke LP-stam. Het is ideaal voor studies waar een enkele kloon bibliotheek functioneel moet gescreend worden in meerdere hosts als gevolg van genexpressie eisen of genetische complementatie in enkele kopie gewenst is.
De grootte van de construct worden geïntegreerd is beperkt door de grootte van DNA dat met succes kan worden gekloneerd in de vector donor via ligatie. Donor vectoren die Gateway bestemmingen 20 kan worden gebruikt en zijn bijzonder geschikt voor grote insert fosmid / cosmide libraries. De antibioticaresistentiemarkers de donor vectoren kunnen ook worden gebruikt voor het selecteren thij assemblage van DNA-fragmenten na overlappende IMCE door kruising van twee verschillende trans-integranten via transductie, elektroporatie of genomische 21. Dit ontwerp overweging moet het mogelijk maken voor de montage van zeer grote constructies in de LP-locus in de LP-stam. Dit kan vooral nuttig zijn voor opname van synthetisch gen constructen voor toepassingen in metabole constructie of synthetische biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Om Margaret CM Smith voor vriendelijk het verstrekken van de integrase kloon
Financiering steun van:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery en strategische Projectsubsidies
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
