שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.
כרומוזום חיידקי ניתן להשתמש כדי לשמור על דנ"א זר ביציבות בטווח מגה בסיס 1. אינטגרציה לתוך הכרומוזום עוקף בעיות כגון שכפול הפלסמיד, יציבות הפלסמיד, אי התאמה פלסמיד, ושונות פלסמיד מספר עותק. שיטה זו משתמשת integrase באתר ספציפי של הפאג Streptomyces (Φ) C31 2,3. Integrase ΦC31 מזרז רקומבינציה ישירה בין שני אתרי DNA ספציפיים: attB ו attP (34 ו – 39 נ"ב, בהתאמה) 4. רקומבינציה זו יציבה ולא לחזור 5. "משטח נחיתה" (LP) הרצף המורכב של הגן spectinomycin עמידות, aadA (SPR), וכן א ' SS-coli glucuronidase גן (uidA) מוקף אתרים attP שולב הכרומוזומים של Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, ו tumefaciens Agrobacterium באזור intergenic, אניPC לוקוס, ואת מוקד תטא, בהתאמה. ס meliloti נעשה שימוש בפרוטוקול זה. וקטורים התורמות Mobilizable המכילים אתרי attB משני צדי אדום stuffer חלבון פלואורסצנטי (RFP) גנים גן עמידות לאנטיביוטיקה יש גם לבנות. בדוגמה זו pJH110 גנטמיצין פלסמיד עמיד משמש. הגן RFP 6 עשוי להחליף את המבנה הרצוי באמצעות SPH אני Pst א לחלופין מבנה סינתטי מוקף אתרים attB יכול להיות תת משובטים לתוך וקטור mobilizable כגון pK19mob 7. הביטוי של הגן ΦC31 integrase (משובטים מ pHS62 8) הוא מונע על ידי האמרגן לאק, על מגוון רחב מארח mobilizable פלסמיד pRK7813 9.
פרוטוקול ההזדווגות tetraparental משמש להעברת קלטת התורם אל זן LP ובכך להחליף את סמני ברצף LP עם קלטת התורם. תאים אלה הם טראןS-integrants. טרנס integrants נוצרים ביעילות אופיינית של 0.5%. טרנס integrants נמצאות בדרך כלל בתוך 500-1,000 מושבות הראשונים שהוקרנו על ידי רגישות לאנטיביוטיקה או כחול לבן ההקרנה באמצעות 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-beta-D-glucuronic חומצה (X-gluc). פרוטוקול זה מכיל את ההזדווגות ובחירת נהלים ליצירה בידוד טרנס integrants.
הטכניקה IMCE מאפשר שילוב יעיל של קלטת ה-DNA בודד מוקף attB לתוך לוקוס-LP של זן מהונדס בעבר. ברגע מבנה הרצוי משובט במקום RFP ליצור את הקלטת התורם, הטכניקה אינה דורשת טיהור שינוי ה-DNA עתידיים, מה שהופך אותו מאוד חזקים. זה קריטי, כי בקרות מתאימות הצמיחה כלולות, כדי להיות ב?…
The authors have nothing to disclose.
כדי מרגרט סי סמית עבור חביב מתן שיבוט integrase
גיוס תמיכה של:
הגנום קנדה / הגנום Prairie
NSERC גילוי מענקים פרויקט אסטרטגי
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
SmUW227 strain | In house, available by request |