لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة
Summary
في الآونة الأخيرة زادت الإنتاجية العالية التكنولوجيا التسلسل كثيرا حساسية مناعي الكروماتين (رقاقة)، ودفعت تجربة تطبيقه باستخدام خلايا النقي أو أنسجة تشريح. نحن هنا تحدد طريقة لاستخدام تقنية رقاقة مع<em> ذبابة الفاكهة</em> الأنسجة، والتي يمكن أن تتصدى الدولة لونين الذاتية في نظام بيولوجي جيدا تتميز.
Abstract
علم التخلق يبقى مجال ينمو بسرعة، كيف يمكن للدراسات حالة لونين يساهم في التعبير الجيني الفرق في أنواع الخلايا المتميزة في مراحل تنموية مختلفة. تنظيم جينية تسهم في طائفة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك تمايز الخلايا أثناء التطور الجنيني والتوازن في الجسم في مرحلة البلوغ. استراتيجية بالغة الأهمية في دراسات جينية هو لبحث كيفية إدخال تعديلات بسيطة وعوامل شتى لونين تنظيم التعبير الجيني. للتصدي لهذا، يتم استخدام الكروماتين مناعي (رقاقة) على نطاق واسع للحصول على لقطة من الجمعيات من العوامل خاصة مع الحمض النووي في خلايا الفائدة.
تقنية رقاقة يستخدم عادة الخلايا المستزرعة كما بدءا المادية، التي يمكن الحصول عليها في وفرة وتجانس لتوليد البيانات استنساخه. ومع ذلك، هناك محاذير عدة: قد أولا، والبيئة لزراعة خلايا في طبق بيتري وهو يختلف عن ذلك في الجسم الحي، وبالتاليلا تعكس الحالة الذاتية لونين من الخلايا في كائن حي. ثانيا، لا يمكن لجميع أنواع خلايا الجسم الحي يكون السابقين مثقف. لا يوجد سوى عدد محدود من خطوط الخلايا، من الذي يمكن للناس الحصول على ما يكفي من المواد لفحص رقاقة.
نحن هنا وصفا لطريقة للقيام تجربة الرقاقة باستخدام الأنسجة ذبابة الفاكهة. يتم تشريح المواد بدءا من أنسجة حيوان، وبالتالي يمكن أن تعبر بدقة عن حالة لونين الذاتية. والقدرة على التكيف على هذه الطريقة مع العديد من أنواع مختلفة من الأنسجة تسمح للباحثين لمعالجة الكثير من المسائل ذات الصلة فيما يتعلق بيولوجيا تنظيم جينية في الجسم الحي 1 و 2. والجمع بين هذه الطريقة مع الإنتاجية العالية التسلسل (رقاقة وما يليها) تسمح مزيد من الباحثين للحصول على المشهد epigenomic.
Protocol
Discussion
ويمكن استخدام براعة من التحليلات CHIP التي نوقشت في هذا البروتوكول على أنسجة مختلفة، الأمر الذي يوفر فرصة لدراسة حالة لونين في النظام ذات الصلة من الناحية البيولوجية. التجارب الرقاقة باستخدام خلايا من نظم مثقف ومريحة لأداء إذ لا يمكن أن كمية كبيرة من الخلايا التي تم ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر مختبر الدكتور كيجي زهاو (المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI) لمساعدتهم في تقديم نتائج التسلسل. ونود أيضا أن نشكر مشروع الجينوم UCSC لاستخدام متصفح الجينوم لتصور التسلسل تعيين يقرأ.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المسار R00HD055052 على جائزة الاستقلال وR01HD065816 من معاهد الصحة القومية، وParkard مؤسسة وسيل، وجامعة جونز هوبكنز لبدء التمويل لXC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
