Chromatin Immunopræcipitation (CHIP) under anvendelse af Drosophila Væv
Summary
For nylig high-throughput sekventering teknologi har i høj grad øget følsomhed af kromatin Immunpræcipitation (CHIP) eksperiment, og bedt sin ansøgning ved hjælp af oprensede celler eller dissekeret væv. Her har vi skitsere en metode til at bruge CHIP teknik med<em> Drosophila</em> Væv, som kan løse den endogene kromatin tilstand i en velkarakteriseret biologisk system.
Abstract
Epigenetik er fortsat en rivende udvikling felt, der undersøger, hvordan kromatin staten bidrager til differentiel genekspression i forskellige celletyper på forskellige udviklingsstadier. Epigenetisk regulering bidrager til et bredt spektrum af biologiske processer, herunder celledifferentiering under embryonisk udvikling og homeostase i voksenalderen. En kritisk strategi i epigenetiske studier er at undersøge, hvordan forskellige histon modifikationer og kromatin faktorer regulerer genekspression. For at løse dette, er kromatin Immunpræcipitation (CHIP) anvendes bredt for at få et øjebliksbillede af sammenslutningen af bestemte faktorer med DNA i cellerne af interesse.
CHIP teknik almindeligvis bruger dyrkede celler som udgangsmateriale, som kan fås i overflod og homogenitet til at generere reproducerbare data. Der er imidlertid adskillige forbehold: første miljø til at dyrke celler i petriskålen er forskellig fra den in vivo, kan såledesikke afspejle den endogene kromatin tilstand af celler i en levende organisme. Sekund, kan ikke alle typer af celler skal dyrkes ex vivo. Der er kun et begrænset antal cellelinier, som folk kan opnå tilstrækkeligt materiale til CHIP assay.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til at gøre CHIP forsøg under anvendelse af Drosophila væv. Udgangsmaterialet dissekerede væv fra et levende dyr, kan således præcist afspejler det endogene kromatin tilstand. Tilpasningsevne denne metode med mange forskellige typer af væv vil give forskere til at løse en masse mere biologisk relevante spørgsmål vedrørende epigenetisk regulering in vivo 1, 2. Kombinere denne fremgangsmåde med højt gennemløb sekventering (Chip-seq) vil yderligere give forskere til at opnå en epigenomic landskab.
Protocol
Discussion
Den alsidighed af chip analyser beskrives i denne protokol kan bruges på forskellige væv, hvilket giver mulighed for at studere kromatin tilstand i en biologisk relevant system. CHIP eksperimenter under anvendelse af celler fra dyrkede systemer er bekvemt at udføre på grund stor mængde celler kan let opnås. Imidlertid har dyrkede celler ikke nødvendigvis celler i en multi-cellulære miljø. Ved at udvikle denne teknik ved hjælp af dissekeret væv fra levende dyr, kan vi tage fat på mange spørgsmål, som dyrked…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Keji Zhao laboratorium (NIH / NHLBI) for deres hjælp i at yde sekventering resultater. Vi vil også gerne takke UCSC genom projekt for brugen af Genome Browser til at visualisere kortlagt sekventering læser.
Dette arbejde er blevet støttet af R00HD055052 NIH Pathway til Independence Award og R01HD065816 fra NICHD, den Lucile Parkard Foundation, og Johns Hopkins University opstart midler til XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
