Kromatin Immunoprecipitation (chip) ved hjelp Drosophila Vev
Summary
Nylig high-throughput sekvensering teknologi har økt følsomhet Chromatin Immunoprecipitation (chip) eksperiment og bedt sin søknad med rensede celler eller dissekert vev. Her har vi avgrense en metode å bruke ChIP teknikk med<em> Drosophila</em> Vev, som kan ta den endogene kromatin staten i en godt karakterisert biologisk system.
Abstract
Epigenetikk fortsatt et raskt voksende felt som studerer hvordan den kromatin staten bidrar til differensial genuttrykk i forskjellige celletyper i ulike utviklingsstadier. Epigenetisk regulering bidrar til et bredt spekter av biologiske prosesser, herunder cellulær differensiering under embryonal utvikling og homeostase i voksen alder. En kritisk strategi i epigenetic studiene er å undersøke hvordan ulike histonmodifikasjonene og kromatin faktorer regulere genuttrykk. For å møte dette, er Chromatin Immunoprecipitation (chip) som brukes mye til å få et øyeblikksbilde av foreningen av spesielle forhold med DNA i cellene av interesse.
ChIP teknikken bruker vanligvis dyrkede celler som starter materiale, som kan fås i overflod og homogenitet å generere reproduserbare data. Det er imidlertid flere begrensninger: For det første er miljøet å vokse celler i petriskål forskjellig fra in vivo, og dermed kanikke nødvendigvis den endogene kromatin tilstand av celler i en levende organisme. Andre kan ikke alle typer celler dyrkes ex vivo. Det er bare et begrenset antall cellelinjer, som folk kan få nok materiale til ChIP analysen.
Her beskriver vi en metode for å gjøre ChIP eksperiment ved hjelp Drosophila vev. Utgangsmaterialet er dissekert vev fra en levende dyr, og dermed kan gjenspeile den endogene kromatin staten. Tilpasningsevne denne metoden med mange forskjellige typer vev vil tillate forskere å adressere mye mer biologisk relevante spørsmål om epigenetisk regulering i en vivo, to. Kombinere denne metoden med high-throughput sequencing (chip-seq) vil ytterligere tillate forskere å få en epigenomic landskap.
Protocol
Discussion
Allsidigheten av chip analyser som omtales i denne protokollen kan brukes på forskjellige vev, noe som gir en mulighet til å studere kromatin staten i en biologisk relevant system. CHIP eksperimenter med celler fra dyrkede systemer er praktisk å utføre fordi store mengder celler kan lett skaffes. Men ikke dyrkede celler ikke nødvendigvis reflektere celler i en multi-mobilnettet miljø. Ved å utvikle denne teknikken bruker dissekert vev fra levende dyr, kan vi ta mange spørsmål som dyrkede celler ikke kan.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke dr. Keji Zhao sin lab (NIH / NHLBI) for deres hjelp i å gi sekvensering resultater. Vi ønsker også å takke UCSC Genome Project for bruk av Genome Browser å visualisere kartlagt sekvensering leser.
Dette arbeidet har vært støttet av R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award og R01HD065816 fra NICHD, den Lucile Parkard Foundation, og Johns Hopkins University oppstart finansiering til XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
