Summary
Кинетохора где SAC инициирует его сигнал контроля митотической сегрегации сестринских хроматид. Описан способ визуализировать набор и оборот одного из кинетохора белков и ее координации с хромосомой движения
Abstract
КПП шпиндельного узла (SAC) механизм активного сигнала, который контролирует взаимодействие между хромосомой кинетохоры и микротрубочки веретена, чтобы предотвратить наступление анафазы до хромосом подключены правильно. Клетки используют этот механизм для предотвращения анеуплоидия или геномной нестабильности и, следовательно, рака и других заболеваний человека, как врожденные пороки и болезни Альцгеймера 1. Число SAC компоненты, такие как Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Род и Aurora B киназы были определены, и все они кинетохора динамический белков 2. Опыт показывает, что кинетохора где сигнал SAC начинается. SAC премьер нормативных цель Cdc20. Cdc20 является одним из основных APC / C (P naphase romoting C или C омплекс yclosome) активаторов 3 и также кинетохора динамические белок 4-6. При активации SAC ингибирует активностьPC / C, чтобы предотвратить разрушение двух ключевых субстратов, циклин B и securin, тем самым предотвращая метафазы к анафазе переход 7,8. Точно, как сигнал SAC инициируется и собран на кинетохоры и передал на APC / C для подавления ее функции по-прежнему остается неуловимым.
Дрозофилы является чрезвычайно послушный экспериментальной системы, гораздо проще и лучше понятных организма по сравнению с человека, кроме одного, который разделяет фундаментальные процессы, в общем. Это, пожалуй, один из лучших организмов для использования био-визуальных исследований в живых клетках, особенно для визуализации событий митоза, в пространстве и времени, так как раннего эмбриона идет по 13 быстрых ядерных циклов деление синхронно (8-10 минут для каждого цикла при 25 ° С) и постепенно организует ядер в одном монослое только под корой 9.
Здесь я представляю био-изображений методом с использованием трансгенных Drosophila выраженияпоют GFP (зеленого флуоресцентного белка) или его вариант-целевых белков интереса и Leica TCS SP2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для изучения системы SAC функции мух, показывая изображение GFP слитых белков некоторых компонентов ЦОД, Cdc20 и Mad2 , в качестве примера.
Protocol
1. Трансгенные мухи и обслуживание
- Трансгенных мух, используемые в этой демонстрации: Ubq-GFP-Cdc20 (II), Ubq-ЗП-His2B (X *); Ubq-GFP-Cdc20 (II *), Ubq-GFP-Cdc20 (II *); mad2 Е.Ю. ( III *) и Ubq-GFP-Cdc20 трансгенных мух ранее созданный в лаборатории с помощью стандартного Р-элемент опосредованного трансгенный подход 10,11 и Ubq-ЗП-His2B это своего рода подарок от Yohanns Belaïche в UMR 144 CNRS / Институт Кюри, Париж, Франция. Они были введены в Mad2 мутант фона с помощью стандартных дрозофилы генетики. Mad2 EY оригинальных мутантов линии было закуплено в Блумингтон фондового центра. Мы не будем обсуждать процедура, используемая для повышения трансформантов в этом протоколе.
Примечание: * представляет собой число хромосом. - Обслуживание: трансгенные мухи были сохранены при 25 ° C в пластиковых флаконах containinг летать питания и дополнительные сухой порошок дрожжи на вершине. Флакон был регулярно менять каждые 3-4 недели в зависимости от условий выращивания (рис. 1).
2. Лети приготовления пищи (Лаборатория шкале)
- Соответствующее количество лету смесь еда нагревается при постоянном помешивании до растворения компонентов.
- О 8-10 мл этой среде был распространен в качестве раствора в каждый пластиковый флакон (диаметром 2,5 см х 8 см длиной) с помощью Jencons научно ООО перистальтического насоса.
- Когда пища суспензия была создана и охлаждают до комнатной температуры, затем флакон подключен с вилкой пена хлопка. Эти продукты флаконы помещаются в лоток, который затем запечатанный в полиэтиленовый пакет и хранить при температуре 4 ° C для дальнейшего использования.
3. Мелкое яйцо коллекции
- Около 50 пар 2-3 дня по старой мухи взрослых были переведены в новый флакон пищу муха снабжена дополнительными сухой порошок дрожжей на поверхности при температуре 25 ° C для мирянв G эмбрионы.
- Мух, которые затем передаются новому флакон каждый час и оставить эмбрионов во флаконе в течение 30 минут, чтобы некоторые из собранных эмбрионы в возрасте 8-10 вокруг ядерной цикл разделения, когда ядра постепенно переходят на кору и организован монослоя. Первая коллекция часов обычно уничтожается, как это часто содержит возраста эмбрионов, которые были сохранены в женских тел, когда условия не подходят для укладки.
4. Подготовка Покровные и слайды
- Возьмите 50 х 22 мм, покровного и слегка смочите ее четырех углов с одной стороны, с очень небольшим количеством воды с помощью влажной мягкой щеткой ручку и положил его на предметное стекло так, чтобы покровное не двигается из-за капиллярного поверхностного натяжения вызваны тонкой жидкой пленки.
- Нанесите тонкую полоску гептан клея посередине покровного стекла, гептан должна испариться за несколько секунд, чтобы оставить клей на покровное.
- Вырезать другой покровное с алмазным пером на небольшие квадраты (~ 1,5 мм 2), выбрать один и разместить его на одном конце полосы клея (это используется для открытия иглы при микроинъекции требуется) и сохранить для будущих другие использовать.
- Возьмем другой предметное стекло и наклеить кусочек двусторонней клейкой ленты длиной около 2 см к нему и снимите крышку бумаги. (См. Рисунок 2А и В).
5. Dechorionate эмбрионов
- Передача мухи на свежий флакон пищи и использовать смоченные тонкой кистью пера передать около 50 яиц на двустороннюю липкую ленту на слайд с соответствующим количеством жидкости, чтобы яйца должны быть распространено. Когда жидкость испарится яйца прилипают к ленте.
- При вскрытии микроскоп сенсорным яйца несколько раз вдоль длинной оси использованием внешней стороне половину пинцетом осторожно до хориона нарушается и открытым, но оставить эмбриона в хорионной оболочки, чтобы предотвратить быстрое обезвоживание. Продолжайте этот процесс до 10-20 яиц была обработана (в зависимости от числа яиц, необходимых для одного эксперимента).
- Эмбрионы могут быть подобраны и удаляется из корпуса и хорион осторожно положил на клей полосы одну за другой. Яйца могут быть размещены и приведены в соответствие либо с длинной стороной параллельно эмбриона или анти-параллельно длинной стороне полосы клея зависит от того, если они будут microinjected.
- Эмбрионы могут быть либо покрыты сразу с соответствующим количеством масла Voltalef 10S (5:1 смесь Holocarbon 700 нефтяных и 27 нефть, Sigma), чтобы предотвратить дальнейшее усыхание для немедленного изображений или помещают в камеру высыхания в течение 3-8 минут обезвоживает их дальше в зависимости от влажности помещения и цель эксперимента. Обезвоженный эмбрионов должна быть покрыта маслом 10S в случае необходимости, чтобы предотвратить чрезмерное обезвоживание, если микроинъекции не требуется. (См. Рис. 2С, D& E).
6. Изображения эмбрионов
- Покадровый или одного изображения живых эмбрионов собранные с помощью Leica TCS SP2 перевернутой конфокальной микроскопии с системой HCX PL APO CS 40X 1,25 иммерсионным цель (60 или 100X целей может быть использована также в зависимости от цели эксперимента, тем выше Увеличение использовали еще фото отбеливание будет происходить).
- Когда несколько изображений флуорофоров, которые перекрытия спектров и совместно выражается в тех же эмбрионов, каждый флуоресцентный белок длиной волны излучения была собрана последовательно. Возбуждения и излучения волн доступных в системе Leica TCS SP2 являются: GFP, λ Ex: 488 нм и λ Em: 500-600 нм. ППП, λ Ex: 543 нм и λ Em: 555-700 нм.
- Одно изображение часто получается как в среднем на 2 растровые строки в среднем по 2 кадра-сканирование. Это займет минимум 6,3 секунд для сканирования 512x512 рixel изображение в режиме одновременного сканирования и 15,44 секунды последовательном режиме сканирования и производит хорошее отношение сигнал-шум. Это время необходимо учитывать при создании временных рамок для покадровой изображение коллекционирования.
- Отверстие было обычно устанавливается в 1-2 а.е. (воздушные единицы), а мощность лазера доводят до максимально низкого уровня, чтобы избежать любого значительного фотообесцвечивания.
7. Спровоцировать SAC по Microinjecting Эмбрионы с соответствующими реагентами
- Подготовка иглы до начала эксперимента. Мы предпочитаем, чтобы вытащить иглу из силиконизированная стеклянных капилляров (GC-100-10, Гарвард), используя пламенный / коричневый микропипетки съемник (Саттер инструмент, модель: Р-97) с параметрами: тепло = 600, вытащить = 90, Vel = 70 , Дель = 150.
- Засыпки иглу с 1-2 мл соответствующей концентрации реагента в инъекции буфера с помощью тонкого кончика загрузкой (20 мкл много Эппендорф: W215818J).
- Установите иглу в иглу хоlder на микроскопе с давлением труба, связанных с управлением системой впрыска Эппендорф.
- Найти эмбриона в 40х цель и найти иголку тень без изменения фокальной плоскости путем перемещения иглы в центр поля зрения и постепенно снижая его вправо фокальной плоскости.
- Перемещение эмбрион от нежно, чтобы найти небольшую площадь нарушенных покровное предварительно установлен на одном из концов полосы клея. Очень осторожно двигаться кончик иглы, пока не достигнет края небольшой площади покровного и аккуратно разбивает его открыть.
- Перемещение эмбрионов обратно в поле зрения и выбрать эмбрион подходящего возраста для инъекций. Я обычно вводят эмбриона на ядерном цикле разделения на 5-7, как это до ядра мигрируют наружу в кору головного мозга. Ядерные этапах цикла разделение может быть определена быстрого сканирования флуоресцентных сигналов GFP-Cdc20 или сигнал ядерной ППП-гистонов 2B перед инъекцией 9.
- Тщательно перемещать Эмбрио близких к игле и скорректировать в фокальной плоскости и для эмбриона и иглы. Перемещение эмбриона в иглу и вводят капли реагента в нужное положение и двигаться от эмбриона (или следуйте инструкциям по микроинъекции системы). Эмбрион может быть введен с его задней или боковой в зависимости от цели эксперимента.
- После инъекции эмбрион готовы быть отображены в соответствующее время. (См. рис 2F & G)
8. Представитель Результаты
Рисунок 1. Необходимые материалы:. штраф кисть, б. небольшой площади разбитого стекла контейнера, с. 22 х 50 мм, покровного, г. предметное стекло микроскопа, электронного. двусторонняя клейкая лента, ф. сухой порошок дрожжей в пробирку с отверстиями в крышке, г. дрожжигранулы для мух обслуживания, час. летать еда флаконе, я. половина пинцет для dechorionate эмбрионов, у. пару пинцет, к. гептан клей жидкости контейнер (мерную колбу).
Рисунок 2. Диаграммы показывают подготовки покровные и слайды в шаге 4, эмбрион dechorionation в шаге 5 и иглы подготовки к микроинъекции в шаге 7. . Верхняя картинка показывает, покровное с полосой гептан клей по всей средней и небольшой площади сломанной покровное застряли на одном конце. В итоге картина показывает стекле тонким слоем воды при ее четырех углов провести покровное. Причина для использования слайд провести покровное это держать примерно на том же расстоянии, как найти, когда у вас двухсторонний скотч на слайдах, и таким образом избежать переориентации микроскоп во время арэлектронной рассечения и передачи эмбрионов между лентой и покровное. B. Слайд с короткой длиной двусторонний скотч применяется до отшелушивающим обложке бумага, используемая для dechorionating эмбриона. C. На рисунке слева показан эмбрионы с неповрежденной оболочек хориона с выраженным передним и задним концами, картинка справа показывает эмбрионов в разбитая скорлупа хориона, прежде чем они были переведены на покровное с клеем полосы D и E диаграммы, показывающие два.. пути передачи, размещения и согласования dechorionated эмбрионов на клей полосы. Эмбрионы были покрыты маслом 10S после соответствующего периода высыхания. F и G. диаграммы, показывающий, как открыть кончик иглы и позиции, таким образом, чтобы инъекцию.
Одно-или замедленной изображений, полученных из описанных выше экспериментов может быть непосредственно анализировали с помощью программного обеспечения Leica или сохраняются в формате. TIF файлов, открытых лРМАТ для дальнейшего количественного анализа и редактирования с помощью других общий анализ изображения программ, таких как изображения J, Photoshop и т.д. метаморфизма два примера для иллюстрации этого приведены ниже:
Пример 1: временной промежуток фильма (рис. 3) показывает, динамический набор кинетохора из GFP-Cdc20 и хромосомные движения в живых дрозофил синцитиальный эмбрионов. Область интересов от оригинального покадровой последовательности изображений было определено / Под ред-и автоматизированных партия преобразуется с помощью Photoshop программного обеспечения. Фильм был собран с использованием QuickTime программного обеспечения.
Рисунок 3. Покадровой фильм показывает динамический набор кинетохора из GFP-Cdc20 и хромосомные движения в живых дрозофил синцитиальный эмбрионов. (A) Покадровый изображения были взяты из трансгенных эмбрионов синцитиальный совместного выражения GFP-Cdc20 (зеленый цвет)и RFP-гистонов 2B (в красном) белков слияния и были записаны с помощью Leica TCS SP2 конфокальной системе при 18 ° С при ядерных циклов деление 7-8. Кадры были сделаны каждые 10 секунд. Кадр с клетками уже в профазе рассматривается как нулевой момент времени 10. Щелкните здесь для просмотра фильмов на 3А . (B) GFP-Cdc20 можно легко наблюдать на профазы и прометафазе кинетохоры (B3 и 4, белые стрелки) и сохраняется на метафазе и анафазе кинетохоры (B5 и 6, белые стрелки). GFP-Cdc20 исключен из интерфазных ядер (белая стрелка), входящих в ядро в начале профазы. Хроматина морфологии определяли с помощью со-выраженный His2BmRFP в качестве маркеров (B8-14). Бары = 5мм.
Пример 2: SAC функции могут быть изучены с помощью манипулирования эмбрионов microinjecting антител, флуоресцентно меченых белков или Chemicaл соединений, представляющих интерес, который потенциально вызвать SAC. Например инъекционных колхицин в деполимеризоваться микротрубочек чтобы спровоцировать SAC, как показано на рисунке 4, 10.
Рисунок 4. Mad2 имеет важное значение для колхицина, вызванной функции SAC 10. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 Е.Ю. (mad2 - / - нулевой мутанта) и GFP-mad2; mad2 эмбрионов EY лечили колхицин методом микроинъекции. Покадровый конфокальной снимки были сделаны до (01, 07 и 13) или после введения (02-06, верхние панели, 08-12, средние панели, 14-18, нижняя панель). GFP-Cdc20 (высшего и среднего панели) или GFP-Mad2 (нижняя панель) кинетохора сигналы были использованы в качестве клеточных маркеров прогрессии цикла. Верхняя панель, стрелки указывают арестован кинетохоры в 02-06. Области отмечен стрелкой в 01 указывает, что до колхицина, GFP-CDC20 исключен из ядра конце интерфазы. Средние панели, в отсутствие эндогенного Mad2, GFP-Cdc20 сигналы продолжают колебаться в и из ядра, и на и от кинетохоры, хотя цитокинеза оказывается дефектной, как и следовало ожидать в отсутствие эмбрионов микротрубочки, в присутствии колхицина (указано стрелками на 07-12), что свидетельствует о не удалось SAC функции арест клеток в ответ на прием колхицина. Разделение дочернего ядра не удалось в картине 10. Нижняя панель, наконечники стрел в 14-18 показывают арестован кинетохоры с накопленными GFP-Mad2 белков слияния, чтобы предложить функциональные GFP-Mad2 в спасательных фенотип SAC дефект мутант Mad2 эмбриона. Arrowhead в 13 указывает GFP-Mad2 накоплением в ядре конце интерфазы. Бар = 5мм. Эмбрионы microinjected с ~ 1% яичного объем 100мг/мл маточного раствора колхицина в 1 х PBS.
Discussion
Протокол, описанный здесь, является универсальным методом для работы с изображениями летать синцитиальный эмбрионов с использованием Leica TCS SP2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и может быть изменен в соответствии с другими системами микроскоп, а также может быть адаптирована для изучения других функций генов дрозофилы синцитиальный использованием эмбрионов. Мы использовали этот протокол для изучения многих аспектов контрольно-пропускном пункте шпиндельного узла, динамики белков и белков протеолиза использованием трансгенных мух или поликлональных антител для визуализации белка локализация в живых или фиксированных образцов 4,6,12-14.
Проще всего мух в свежих флаконах пищи лету, собирая небольшое количество (~ 10 - 100) яиц. Это снижает хлопот решений и подготовке дополнительных яблочного сока агаром и камеры сбора яиц, как это описано в других изданиях 15,16. Помимо небольшого квадратного битого стекла покровного на одном конце полосы клея на покровное делает его намного прощеЧтобы открыть иглу и определения объема впрыска, регулируя настройки микроинъекции системы, а игла погружения в масло 10С. Степень высыхания эмбрион имеет важное значение для успешного введения в предотвращении утечек и поддержания жизнеспособности эмбрионов, особенно для тех экспериментов, которые требуют длительного периода времени или при повышении трансформантов после инъекции. Однако, нет золотого правила, сколько времени высыхания требуется. Это зависит от эксперимента к эксперименту и зависит от количества раствора вводят и влажность рабочей среды.
Функции специфического белка интереса можно манипулировать microinjecting специфические ингибиторы белка, моно-или поли-клональных антител против специфического белка, РНК или флуоресцентно меченых пептидов в дикого типа или генетической мутации фона. Многие из этих мутантных линий или GFP с метками трансгенных линий публично пр.ailable от дрозофилы фондовых центров и большинство из них котируются на Flybase ( http://flybase.org/~~V ) и может быть найден в Интернете.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот протокол был разработан в рамках Wellcome Trust грант. Мы благодарим г-жа Морин Sinclair для поддержания лету запасов и подготовке лету пищу на протяжении многих лет. Мы также хотели бы поблагодарить г-на Майкла Aitchison за помощь и техническую поддержку в разработке этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Essential equipment and reagents: |
|||
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems. |
|||
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens. |
|||
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97). |
|||
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used. |
|||
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump. |
|||
Reagents: |
|||
| Maize meal | SUMA, UK | 100.0g | |
| Brown sugar | Billington’s, UK | 50.0g | |
| Dry yeast | DCL YEAST Ltd. UK | 25.0g | |
| Agar | Fisher Scientific | 106556 | 12.5g |
| Sorbic acid | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 | 0.4g |
| Benzoic acid | Fisher Scientific | 1019599 | 2.9g |
| Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 | 0.9g |
| H2O up to 1L | |||
Table 1. Fly food ingredients. |
|||
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma. |
|||
Dry yeast: Thomas Allison, UK. |
|||
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope. |
|||
|
|||
References
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).
- Zekanowski, C., Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).
- Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).
- Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).
- Huang, J., Raff, J. W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).
- Xia, G. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).
- Lorca, T. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).
- Howell, B. J. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).
- Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
- Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).
- Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. DNA cloning: A practical approach. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).
- Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).
- Huang, J. Y., Raff, J. W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).
