Summary
Den kinetochore er, hvor SAC indleder sit signal overvåge mitotiske adskillelse af de søsterkromatider. En metode er beskrevet til at visualisere rekruttering og omsætning af en af de kinetochore proteiner og sin samordning med kromosomet bevægelse i
Abstract
Den spindel checkpoint (SAC) mekanisme er et aktivt signal, som overvåger samspillet mellem kromosom kinetochores og spindel mikrotubuli at forhindre anaphase debut indtil kromosomerne er tilsluttet korrekt. Celler bruge denne mekanisme til at forhindre aneuploidi eller genomisk ustabilitet, og dermed kræft og andre humane sygdomme som fosterskader og Alzheimers 1. En række af de SAC komponenter såsom Mad1, MAD2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10 har Rod og Aurora B kinase er blevet identificeret, og de er alle kinetochore dynamiske proteiner 2. Tyder på, at kinetochore er, hvor SAC signal initieres. SAC primære reguleringsmæssige mål er Cdc20. Cdc20 er en af de væsentlige APC / C (A naphase P REMME C omplex eller C yclosome) aktivatorer 3 og er ligeledes en kinetochore dynamisk protein 4-6. Ved aktivering SAC inhiberer aktiviteten af APC / C for at forhindre ødelæggelsen af to vigtige substrater cyclin B og Securin, hvorved den metafase til anafase overgangen 7,8. Nøjagtigt hvordan SAC signal initieres og samles på de kinetochores og videresendes på APC / C for at inhibere dens funktion stadig vanskeligt.
Drosophila er en yderst medgørlige eksperimentelt system en meget enklere og bedre forstået organisme i forhold til det menneskelige men som deler fundamentale processer til fælles. Det er måske en af de bedste organismer, der skal bruges til bio-billeddiagnostiske undersøgelser i levende celler, især for visualisering af de mitotiske begivenheder i tid og rum, som det tidlige foster går gennem 13 hurtige kernedeling cykler synkront (8-10 minutter for hver cyklus ved 25 ° C) og gradvist organiserer kernerne i en enkelt monolag lige under cortex 9.
Her vil jeg præsentere en bio-imaging-metoden ved hjælp af transgene Drosophila udtryksing GFP (grønt fluorescerende protein) eller dets variant-målrettede proteiner af interesse og en Leica TCS SP2 konfokalt laserscanningmikroskop mikroskop for at undersøge SAC funktion i fluer, ved at vise billeder af GFP fusionsproteiner af nogle af de SAC komponenter, Cdc20 og MAD2 Som eksempel.
Protocol
1. Transgene Fluer og Vedligeholdelse
- Den transgene fluer, der anvendes i denne demonstration Ubq-GFP-Cdc20 (II), Ubq-RFP-His2B (X *) Ubq-GFP-Cdc20 (II *), Ubq-GFP-Cdc20 (II *) MAD2 EY ( III *) og Ubq-GFP-Cdc20 transgene fluer blev tidligere genererede i laboratoriet ved hjælp af en standard P-element-medieret transgene fremgangsmåde 10,11 og Ubq-RFP-His2B er en venlig gave fra Yohanns Belaïche på UMR 144 CNRS / Institute Curie, Paris, Frankrig. De blev indført i en MAD2 mutant baggrund via standard Drosophila genetik. Den MAD2 EY oprindelige mutant linje blev købt fra Bloomington Stock Center. Vi vil ikke diskutere den procedure, der benyttes til at hæve transformanter i denne protokol.
Bemærk: * repræsenterer kromosomtal. - Vedligeholdelse: Transgene fluer blev holdt ved 25 ° C i plastikvials containing flyve fødevarer og med yderligere tørgær pulver på toppen. Hætteglasset blev rutinemæssigt erstattet hver 3-4 uger afhængigt af vækstbetingelser (fig. 1).
2. Flyv Mad Forberedelse (Lab skala)
- En passende mængde af flyve fødevaren blandingen blev opvarmet under konstant omrøring for at opløse bestanddelene.
- 8-10 ml af dette medium blev fordelt i opslæmningen i hvert plasthætteglas (2,5 cm diameter x 8 cm lang) under anvendelse af en Jencons Scientific Ltd peristaltisk pumpe.
- Når maden opslæmningen blev indstillet, og er afkølet til stuetemperatur, hætteglasset derpå tilproppet med en bomuldsprop skum prop. Disse fødevarer Hætteglassene anbringes i en bakke, som derefter forsegles i en plastpose og holdt ved 4 ° C til senere brug.
3. Mindre Egg Collection
- Omkring 50 par 2-3 dage gamle voksne fluer blev overført til et frisk flue fødevare hætteglas forsynet med yderligere tørgær pulver på sin overflade ved 25 ° C for lægfolkning embryoer.
- Fluerne overføres derefter til et nyt hætteglas hver time og lad embryoner i hætteglasset i 30 minutter for at sikre en del af de indsamlede embryonerne alderen ca kernedeling cyklus 8-10, hvor kernerne er gradvist flytter til cortex og organiseret som en enkelt monolag. Den første time kollektion normalt kasseres, da det ofte indeholder gamle embryoner, der blev tilbageholdt i de kvindelige organer, når forholdene var ikke egnet til om.
4. Forberedelse Dækglas og dias
- Tegne en 50 x 22 mm dækglas og let befugte de fire hjørner på den ene side med en meget lille mængde vand under anvendelse af en fugtig fin pen børste og sætte det på et objektglas, således at dækglasset ikke bevæge sig på grund af den kapillære overfladespænding forårsaget af den tynde væskefilm.
- Anvende en tynd strimmel af heptan lim over midten af dækglasset, bør heptan inddampes i sekunder for at forlade lim på dækglasset.
- Skær anden dækglasset med en diamant pen i små firkanter (~ 1,5 mm 2), afhente en og placere den på den ene ende af lim strimmel (dette bruges til at åbne nålespidsen, når mikroinjektion er påkrævet), og gemme de andre til senere brug.
- Tag en anden objektglas og stikke et stykke dobbeltsidet tape ca 2 cm lang til det, og skræl dækslet papiret. (Se figur 2A og B).
5. Dechorionate Embryoner
- Overfør fluerne til friske fødevarer hætteglas og anvende en fugtet fin pen pensel til at overføre omkring 50 æg på dobbeltklæbende tape på objektglasset med en passende mængde væske til at tillade de æg, der skal spredes ud. Når væsken er fordampet æggene vil holde sig til båndet.
- Under et dissektionsmikroskop strejf æggene flere gange langs deres lange akse ved hjælp af ydersiden af den ene halvdel af en pincet forsigtigt indtil chorion er knækkede og åben, men lad embryo i Chorion Shell for at forhindre hurtig dehydrering. Fortsætte denne fremgangsmåde, indtil 10-20 i æggene er blevet behandlet (afhængigt af antallet af æg, der kræves for et enkelt eksperiment).
- Embryonerne kan derefter opsamles og fjernes fra chorion skallen og forsigtigt placeret på limstrimmel én efter én. Æg kunne placeres og på linie med enten den lange side af embryonet parallelt eller anti-parallelt med den lange side af limstrimmel afhænge hvis de skal mikroinjiceres.
- Embryonerne kan enten være dækket straks med en passende mængde Voltalef 10S olie (en 5:1 blanding af Holocarbon 700 olie og 27 olie, Sigma) for at forhindre yderligere tørring til øjeblikkelig billeddannelse eller anbringes i en udtørring kammer i 3-8 minutter til dehydrere dem yderligere afhængigt af fugtigheden i rummet og formålet med forsøget. De tørrede embryoer skal dækkes med 10S olie, når det er hensigtsmæssigt for at undgå over-dehydrering, hvis mikroinjektion er påkrævet. (Se figur. 2C, D& E).
6. Imaging Embryoner
- Time-lapse eller enkelt billeder af levende embryoner, som er indsamlet ved hjælp af en Leica TCS SP2 omvendt konfokal mikroskopi-system med en HCX PL APO CS 40X 1,25 olieimmersionslinse mål (60 eller 100X mål kan bruges alt afhængig af formålet med forsøget er, jo højere forstørrelsen anvendt mere fotoblegning vil forekomme).
- Når billeddannelse flere fluoroforer, som har overlappende spektre og co-udtrykkes i den samme embryo, blev hver fluorescerende protein emissionsbølgelængde opsamlet sekventielt. De excitations-og emissionsbølgelængderne tilgængelige på Leica TCS SP2 system er: GFP, λ Ex: 488 nm og λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm og λ Em: 555-700 nm.
- Et enkelt billede blev sædvanligvis opnået som et gennemsnit af 2 scanlines med et gennemsnit på 2 rammen-scanninger. Dette tager et minimum af 6,3 sekunder at scanne en 512x512 pixel billede i en samtidig scanning, og 15,44 sekunder for en sekventiel scanning og frembringer et godt signal-støj-forhold. Disse tider skal tages i betragtning ved oprettelsen af de tidsrammer for time-lapse billede indsamling.
- Pinhole blev normalt indstillet til 1-2 AU (luftig enhed), og lasereffekt blev justeret til det lavest mulige niveau for at undgå enhver væsentlig fotoblegning.
7. Provokere SAC ved mikroinjektion af embryoner med passende reagenser
- Forberede nålen før forsøget. Vi foretrækker at trække nålen fra silikoniseret glas kapillærer (GC-100-10, Harvard) ved hjælp af flammende / brune mikropipette aftrækker (Sutter Instrument, Model: P-97) med parametre: varme = 600, træk = 90, Vel = 70 , del = 150.
- Efterfylde nålen med 1-2 ml af en passende koncentration af reagenset i injektionen puffer med en fin belastning spids (20 ul Eppendorf parti: W215818J).
- Monter nålen i nålen Holder på mikroskopet med trykrøret forbundet til Eppendorf injektionen styresystemet.
- Finde en embryo under 40X objektiv og finde nålen skyggen uden at ændre brændplanet ved at bevæge nålen ind i midten af synsfeltet og gradvist sænke den til højre brændplanet.
- Bevæge embryo let væk for at finde det lille kvadrat med den stiplede dækglasset på forhånd er monteret ved den ene ende af lim strimlen. Meget forsigtigt at flytte nålens spids, indtil den rammer kanten af det lille torv dækglasset og forsigtigt bryder den op.
- Flyt embryoner tilbage i udsigt, og vælg kimen til den rigtige alder til injektion. Jeg normalt injicere embryoet på kernedeling cyklus på 5-7, da dette er før kerner vandrer udad til cortex. De kernedeling cyklus trin kan bestemmes ved en hurtig scanning af de fluorescerende signaler for GFP-Cdc20 eller nukleare signalet fra RFP-histon 2B før injektion 9.
- Omhyggeligt bevæge Embryo tæt på nålen og rejustere fokusplan for både embryo og nålen. Flyt foster til nålen og sprøjt en dråbe af reagenset i den ønskede position og flytte embryo væk (eller følg instruktionerne for mikroinjektion systemet). Embryoet kan injiceres fra en bageste eller fra siden, afhængigt af formålet med forsøget.
- Når injiceret embryoet er klar til at blive afbildet på det rette tidspunkt. (Se figur 2F & G)
8. Repræsentative resultater
Figur 1. Nødvendige materialer:. fin pen børste, b. lille kvadrat brudt glas beholder, ca. 22 x 50 mm dækglas, d. objektglas, e. dobbeltsidet tape, f. tørgær pulver i reagensglas med huller på låget, g. gærgranul anvendes til fly vedligeholdelse timer. flyve mad hætteglas, jeg. halvdelen af en pincet, der anvendes til dechorionate embryoer, j. et par pincet, k. heptan lim væskebeholderen (målekolbe).
Figur 2. Diagrammet viser fremstillingen af de dækglassene og glider i trin 4, embryo dechorionation i trin 5 og broderede forberedelserne til mikroinjektion i trin 7. A. Det øverste billede viser en dækglas med en strimmel af heptan lim på tværs af sin midte og en lille kvadrat af en brækket dækglas holdt sig til den ene ende. Nederste billede viser et objektglas med et tyndt lag vand ved sine fire hjørner til at holde et dækglas. Grunden til at bruge et dias til at holde dækglasset er at holde nogenlunde samme fokusafstand som der findes, når du har dobbeltklæbende tape på de slides, og dermed undgår omlægningen af mikroskopet, mens du are dissekere og overføre de befrugtede æg mellem tape og dækglas. B. En glider med en kort længde af dobbeltsidet Scotch tape påføres før afrivning sin omslagspapir anvendes dechorionating embryoet. C. Billedet til venstre viser embryoner med intakte chorion skaller med markeret forreste og bageste ender, billedet til højre viser de embryoner i de ødelagte chorion granater, inden de blev overført på dækglasset med limstrimmel D & E diagrammer, som viser to.. måder til at overføre, placere og tilpasse de dechorionated embryoner på lim strimler. De embryoner blev dækket af 10S olie efter en passende udtørringen periode. F & G. Diagrammer der viser hvordan du åbner spidsen af nålen, og placer den, så at injicere.
Enkelt-eller time-lapse billeder opnået fra de ovenfor beskrevne eksperimenter direkte kan analyseres ved hjælp af Leica software eller gemt i. TIF-filer som et åbent format til rådighed for yderligere kvantificering eller redigering analyser ved hjælp af andre almindelige billedformater analyse programmer såsom Billede J, Photoshop og MetaMorph mv To eksempler til at illustrere dette diskuteres nedenfor:
Eksempel 1: En time-lapse film (Figur 3) viser den dynamiske kinetochore rekruttering af GFP-Cdc20 og kromosom bevægelse i levende Drosophila syncytial embryoner. Regionen af interesse fra originale time-lapse sekvens billeder var bestemt / redigeret og automatiserede-batch omregnet ved hjælp af Photoshop software. Filmen blev samlet ved hjælp af QuickTime-software.
Figur 3. En time-lapse film viser den dynamiske kinetochore rekruttering af GFP-Cdc20 og kromosom bevægelse i levende Drosophila syncytial embryoner. (A) Time-lapse billeder blev taget fra et transgent syncytial embryon co-udtrykker GFP-Cdc20 (i grøn)og RFP-histon 2B (rød) fusionsproteiner og blev registreret ved anvendelse af et Leica TCS SP2 konfokalt systemet ved 18 ° C under kernedeling cyklusser 7-8. Frames blev taget hver 10 sekunder. Rammen med de celler, der allerede i prophase behandles som nul tidspunkt 10. Klik her for at se filmen for figur 3A . (B) GFP-Cdc20 let kan observeres på prophase og prometaphase kinetochores (B3 & 4, hvide pile) og fortsætter på metafase og anaphase kinetochores (B5 & 6, hvide pile). GFP-Cdc20 er udelukket fra interfase kerne (White pilespids), ind i kernen i begyndelsen af prophase. Chromatin morfologier blev bestemt under anvendelse co-udtrykte His2BmRFP som markører (B8-14). Barer = 5mm.
Eksempel 2: SAC funktioner kan studeres ved at manipulere de embryoner mikroinjektion antistoffer fluorescensmærkede proteiner eller chemical forbindelser af interesse, der potentielt udløser SAC. For eksempel intravenøs colchicin at depolymerisere de mikrotubuli således fremkalder SAC som vist i figur 4. 10.
Figur 4. MAD2 er afgørende for colchicin-påberåbt SAC funktion 10. GFP-cdc20, MAD2 + / +, GFP-cdc20, MAD2 EY (MAD2 - / - null mutant) og GFP-MAD2, MAD2 nyuddannet embryoer blev behandlet med colchicin ved mikroinjektion. Time-lapse konfokal billeder blev taget før (01, 07 & 13) eller efter injektion (02-06, top paneler; 08-12, mellemledere paneler, 14-18, bund paneler). GFP-Cdc20 (øverste og midterste panel) eller GFP-MAD2 (nederste panel) kinetochore signaler blev anvendt som cellecyklusprogression markører. Top panel, pilene angiver de anholdte kinetochores i 02-06. Området markeret med en pil i 01 angiver, at før colchicin behandling GFP-CDC20 er udelukket fra slutningen af interfase kerne. Midterste panel, i fravær af endogen MAD2, fortsætter GFP-Cdc20 signaler til at oscillere i og ud af kernen, og til og fra de kinetochores, selv cytokinese synes at være defekt Som det kunne forventes i embryoner der mangler mikrotubuli i nærvær colchicin (angivet ved pile i 07-12), hvilket antyder en ikke SAC funktion i standsning celler som respons på colchicin behandlingen. Adskillelse af datter kerne mislykkedes i billedet 10. Bundplade, pilespidser i 14-18 indikerer anholdt kinetochores med akkumuleret GFP-MAD2 fusionsproteinerne at foreslå funktionelle GFP-MAD2 i redning SAC defekt fænotype i MAD2 mutant embryo. Pilespids i 13 indikerer GFP-MAD2 akkumulering i en sen interfase kerne. Bar = 5 mm. Embryoner blev mikroinjiceret med ~ 1% æg volumen af en 100mg/ml colchicin stamopløsning i 1 x PBS.
Discussion
Protokollen beskrevet her er en generisk fremgangsmåde til billeddannelse flyve syncytial embryoer ved hjælp af et Leica TCS SP2 konfokalt laserscanningmikroskop mikroskop og kan tilpasses til andre mikroskop systemer og kan også tilpasses til at studere andre genfunktioner hjælp Drosophila syncytial embryoer. Vi har brugt denne protokol til at studere mange aspekter af spindel samling checkpointet, protein dynamik og protein proteolyse ved hjælp af transgene fluer eller polyklonale antistoffer til at visualisere protein lokalisering i levende eller faste prøver 4,6,12-14.
Det er lettest at holde fluerne i friske flyve fødevarer hætteglas, når opkrævning af små numre (~ 10 - 100) af æg. Dette reducerer besværet med at gøre og forberede yderligere æblesaft agarplader og indsamling af æg kamre, som er beskrevet i andre publikationer 15,16. Tilsætning af en lille kvadrat knuste dækglas glas ved den ene ende af limstrimmel på dækglasset gør det meget nemmereat åbne nålen og bestemme injektionsvolumen ved at justere mikroinjektion systemets indstillinger, mens nålen er nedsænke i 10S olien. Graden af udtørring af embryoet er vigtig for succes injektion undgå udsivning og opretholde embryoner levedygtigheden især de eksperimenter, der kræver en lang tid, eller når forøgelse transformanter efter injektion. Men der er ingen gylden regel for præcist, hvor lang tid udtørringen er påkrævet. Dette varierer fra eksperiment til eksperiment og afhænger af mængden af injiceret opløsning og fugtigheden af arbejdsmiljøet.
Funktioner af et specifikt protein af interesse, kan manipuleres ved mikroinjektion specifikke protein-inhibitorer, mono-eller poly-klonale antistoffer mod et specifikt protein, messenger-RNA eller fluorescens-mærkede peptider under vildtype eller genetisk mutation baggrund. Mange af disse mutant linjer eller GFP-tagget transgene linier er offentligt available fra Drosophila lager centre og de fleste af dem er noteret på Flybase ( http://flybase.org/~~V ) og kan søges online.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne protokol blev udviklet under en Wellcome Trust tilskud. Vi takker Ms Maureen Sinclair for at opretholde fluen lagre og forberede flyve mad over året. Vi vil også gerne takke hr. Michael Aitchison for hans hjælp og teknisk support i udvikling af denne protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Essential equipment and reagents: |
|||
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems. |
|||
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens. |
|||
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97). |
|||
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used. |
|||
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump. |
|||
Reagents: |
|||
| Maize meal | SUMA, UK | 100.0g | |
| Brown sugar | Billington’s, UK | 50.0g | |
| Dry yeast | DCL YEAST Ltd. UK | 25.0g | |
| Agar | Fisher Scientific | 106556 | 12.5g |
| Sorbic acid | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 | 0.4g |
| Benzoic acid | Fisher Scientific | 1019599 | 2.9g |
| Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 | 0.9g |
| H2O up to 1L | |||
Table 1. Fly food ingredients. |
|||
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma. |
|||
Dry yeast: Thomas Allison, UK. |
|||
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope. |
|||
|
|||
References
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).
- Zekanowski, C., Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).
- Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).
- Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).
- Huang, J., Raff, J. W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).
- Xia, G. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).
- Lorca, T. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).
- Howell, B. J. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).
- Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
- Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).
- Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. DNA cloning: A practical approach. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).
- Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).
- Huang, J. Y., Raff, J. W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).
