Studera Mitotisk Checkpoint genom att illustrera Dynamic kinetochore Protein beteende och kromosomer Motion i levande Published: June 14, 2012 doi: 10.3791/3763

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Maureen Sinclair¹, Jun-Yong Huang¹

¹Institute for Cell and Molecular Biosciences, University of Newcastle, United Kingdom

Summary

Den kinetochore är där SAC initierar sin signal övervaka mitotiska segregation av systerkromatider. En metod beskrivs för att visualisera rekrytering och omsättning av en av de kinetochore proteiner och dess samordning med kromosomen rörelsen i

Abstract

Spindeln montering checkpoint (SAC) mekanism är en aktiv signal, som övervakar samspelet mellan kromosomavvikelser kinetochores och mikrotubuli spindel för att förhindra anafas debut tills kromosomerna är korrekt anslutna. Celler använder denna mekanism för att förhindra aneuploidi eller genomisk instabilitet och därmed cancer och andra mänskliga sjukdomar som fosterskador och Alzheimers ^1. Ett antal av de SAC komponenter såsom Mad1, MAD2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10 har Rod och Aurora B-kinas har identifierats och de är alla kinetochore dynamiska proteiner ^2. Tyder på att den kinetochor är där SAC signalen initieras. SAC främsta rättsliga mål är Cdc20. Cdc20 är en av de väsentliga APC / C (A naphase P RÄMJA C OMPLEX eller C yclosome) aktivatorer ³ och är också en dynamisk kinetochor protein ^4-6. När den aktiveras, inhiberar SAC aktiviteten hos enPC / C för att förhindra förstörelse av två viktiga substrat, cyklin B och securin därmed förhindra metafas att anafas övergången ^7,8. Exakt hur SAC signalen initieras och monteras på kinetochores och reläas till APC / C för att inhibera dess funktion fortfarande svåra att uppnå.

Drosophila är en extremt lätthanterlig experimentellt system, ett mycket enklare och bättre kunskaper organism jämfört med den mänskliga men som har samma grundläggande processer i gemensamt. Det är kanske en av de bästa organismer som ska användas för bio-imaging studier i levande celler, särskilt för visualisering av de mitotiska händelser i tid och rum, som det tidiga embryot går igenom 13 snabba nukleära division cykler synkront (8-10 minuter För varje cykel vid 25 ° C) och gradvis anordnar kärnorna i en enda monoskikt precis under barken ^9.

Här presenterar jag en bio-imaging-metoden att använda transgena Drosophila uttrycksing GFP (Green Fluorescent Protein) eller dess variant-riktade proteiner av intresse och en Leica TCS SP2 konfokala laserscanningsmikroskop för att studera SAC funktion i flugor, genom att visa bilder av GFP fusionsproteiner av några av de SAC komponenter, Cdc20 och MAD2 Såsom exempel.

Protocol

1. Transgena Flugor och underhåll

1. Den transgena flugor som används i denna demonstration UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-RFP-His2B (X *); UBQ-GFP-Cdc20 (II *), UBQ-GFP-Cdc20 (II *), MAD2 ^EY ( III *) och UBQ-GFP-Cdc20 transgena flugor tidigare genereras i labbet via en vanlig P-element medierad transgena tillvägagångssätt ^10,11 och UBQ-RFP-His2B är en slags gåva från Yohanns Belaïche på UMR 144 CNRS / Institute Curie, Paris, Frankrike. De infördes i en MAD2 mutant bakgrund via vanlig Drosophila genetik. Den MAD2 ^EY ursprungliga mutant linjen köptes från Bloomington beståndet centrum. Vi kommer inte att diskutera det förfarande som används för att höja transformanter i detta protokoll.
   Obs: * representerar antalet kromosomer.
2. Underhåll: Transgena Flugorna hölls vid 25 ° C i plastampuller containing flyga mat och med ytterligare torr jäst pulver på toppen. Den lilla flaskan rutinmässigt ut var 3-4 veckor beroende på odlingsförhållanden (figur 1).

2. Fly Food Preparation (Lab skala)

1. En lämplig mängd av flugor mat blandning upphettades under konstant omröring för upplösning av komponenterna.
2. Ca 8-10 ml av detta medium fördelades i uppslamningen i varje plastampull (2,5 cm diameter x 8 cm längd) med användning av en Jencons Scientific Ltd peristaltisk pump.
3. När maten slurryn in och har svalnat till rumstemperatur flaskan sedan ansluten med bomull skum plugg. Dessa livsmedel flaskor placeras i ett fack som sedan försluts i en plastpåse och förvaras vid 4 ° C för senare användning.

3. Småskalig insamling av ägg

1. Cirka 50 par 2-3 dagar gamla vuxna flugor överfördes till en ny fluga mat flaskan levereras med ytterligare torrjäst pulver på sin yta vid 25 ° C för lekmänning embryon.
2. Flugorna överförs sedan till en ny flaska varje timme och lämna embryon i flaskan i 30 minuter för att säkerställa en del av de insamlade embryona årsåldern nukleära 8-10 division cykel när kärnan gradvis flyttar till cortex och organiseras som en enda monoskikt. Den första timmen kollektionen normalt kastas eftersom den ofta innehåller gamla embryon som behölls i kvinnokroppar när förhållandena inte var lämpliga till värphöns.

4. Förbereda Täckglas och bilder

1. Ta ut ett 50 x 22 mm täckglas och något blöta dess fyra hörn på en sida med en mycket liten mängd vatten med en fuktig fin penna pensel och lägg den på ett objektglas så att täckglaset inte flytta på grund av kapillär ytspänningen orsakas av den tunna vätskefilmen.
2. Applicera en tunn remsa av heptan lim över mitten av täckglaset bör heptan förångas i sekunder för att lämna limmet på täckglaset.
3. Skär ett täckglas med en diamant pennan i små fyrkanter (~ 1,5 mm ^2), plocka upp en och placera den på ena änden av limmet remsan (detta används för att öppna nålspetsen då mikroinjektion behövs) och spara de andra för framtida använda.
4. Ta ett annat objektglas och hålla fast en bit dubbelhäftande tejp ca 2 cm lång till den och dra av locket papperet. (Se Fig. 2A och B).

5. Dechorionate Embryon

1. Överför flugorna till ett nytt livsmedel flaska och använda en fuktad fin penna pensel för att överföra omkring 50 ägg på den dubbelhäftande tejp på bilden med en lämplig mängd vätska för att äggen ska spridas ut. När vätskan har indunstades äggen fastnar tejpens.
2. Under ett dissektionsmikroskop kontakt äggen flera gånger längs den långa axeln med den yttre sidan av ena halvan av en pincett försiktigt tills chorion är trasig och öppen men lämna embryot i Chorjon skalet för att förhindra snabb uttorkning. Fortsätta processen tills 10-20 av äggen har behandlats (beroende på antalet ägg som krävs för en enda experiment).
3. Embryona kan därefter plockas upp och tas bort från chorion skalet och placeras försiktigt på klisterremsa en efter en. Äggen kan placeras och inriktas med antingen den långa sidan av embryot parallella eller anti-parallellt med den långa sidan av limremsan beror på om de skall mikroinjiceras.
4. De embryon kan antingen täckas omedelbart med en lämplig mängd Voltalef 10S olja (en 5:1 blandning av Holocarbon 700 olja och 27 olja, Sigma) för att förhindra ytterligare uttorkning för omedelbar avbildning eller placeras i en uttorkning kammare under 3-8 minuter torka dem vidare beroende på fuktigheten i rummet och syftet med försöket. De torkade embryon bör täckas med 10S olja vid behov för att förhindra över-uttorkning vid mikroinjektion krävs. (Se figur. 2C, D& E).

6. Bildgivande Embryon

1. Time-lapse eller enkel bilder av levande embryon samlas in genom en Leica TCS SP2 inverterad konfokalmikroskopi system med en HCx PL APO CS 40X 1,25 oljeimmersion mål (60 eller 100X mål kan användas för beroende på syftet med experimentet, desto högre förstoringen användes desto fotoblekning kommer att inträffa).
2. När avbildning flera fluoroforer, vilka har överlappande spektra och samuttrycks i samma embryo, fick varje fluorescerande protein emissionsvåglängd uppsamlades sekventiellt. De excitations-och emissionsvåglängder som finns på Leica TCS SP2 system är: GFP, λ _Ex: 488 nm och λ _Em: 500-600 nm. RFP, λ _Ex: 543 nm, och _Em λ: 555-700 nm.
3. En enda bild som vanligen erhölls som ett genomsnitt av 2 Scanlines med ett genomsnitt på 2 ram-skanningar. Detta tar minst 6,3 sekunder för att scanna en 512x512 pixel bild i en samtidig skanningsläge och 15,44 sekunder för en sekventiell avsökning och ger en bra signal-brus-förhållande. Dessa tider måste tas i beaktande när du upp tidsramar för time-lapse bilden insamling.
4. Den hål var vanligtvis inställda till 1-2 AU (luftigt enhet) och lasereffekten justerades till lägsta möjliga nivå för att undvika betydande fotoblekning.

7. Provocera SAC genom mikroinjektion de embryon med lämpliga reagens

1. Framställ nålen före experimentet. Vi föredrar att dra nålen från silikoniserad glaskapillärer (GC-100-10, Harvard) med flammande / brun mikropipett avdragare (Sutter Instrument, Modell: P-97) med parametrar: värme = 600, dra = 90, Vel = 70 , del = 150.
2. Återfyllning nålen med 1-2 ml av en lämplig koncentration av det reagens i injektionsteknik buffert med en fin laddning tips (20 pl Eppendorf Vara: W215818J).
3. Montera nålen i nålen holder på mikroskopet med tryckröret ansluten till Eppendorf-injektion styrsystemet.
4. Hitta ett embryo enligt 40X mål och hitta nålen skuggan utan att ändra fokalplanet genom att flytta nålen i mitten av synfältet och gradvis sänka den till höger fokalplanet.
5. Flytta embryot iväg försiktigt för att hitta den lilla kvadraten på trasiga täckglaset förmonterade i ena änden av limmet remsan. Mycket försiktigt flytta nålspetsen tills den träffar kanten av den lilla torget täckglaset och försiktigt bryter upp den.
6. Flytta embryona tillbaka till vyn och välj embryot till rätt ålder för injektion. Jag injicerar normalt embryot vid kärntekniska avdelning cykeln vid 5-7 eftersom det är innan kärnorna migrera utåt till cortex. De kärntekniska division cykel steg kan bestämmas genom en snabb scanning av de fluorescerande signaler från GFP-Cdc20 eller nukleära signalen från RFP-Histon 2B före injektion ^9.
7. Försiktigt flytta Embryo nära nålen och justera fokalplanet för både embryot och nålen. Flytta embryot i nålen och injicera en droppe av reagens till önskat läge och flytta embryot bort (eller följ instruktionerna för mikroinjektion systemet). Embryot kan injiceras från dess bakre eller från sidan beroende på ändamålet med försöket.
8. När injicerade embryot är redo att avbildas vid lämplig tidpunkt. (Se figur 2F & G)

8. Representativa resultat

Figur 1. Obligatoriska material: en. bra penna pensel, B. liten kvadrat brutna-glas behållare, C. 22 x 50 mm täckglas, d. objektglas, e. dubbelhäftande tejp, f. torrjäst pulver i provrör med hål på locket, gram. jästgranulat som används för fluga underhåll, h. flyger mat flaskan, jag. en halv av en pincett som används för dechorionate embryon, j. ett par pincetter, k. heptan lim vätskebehållare (mätkolv).

Figur 2. Diagrammen visar framställningen av täckglasen och diabilder i steg 4, embryo dechorionation i steg 5 och förberedelser nål för mikroinjektion i steg 7. A. Den övre bilden visar ett täckglas med en remsa av heptan lim över dess mitten och en liten fyrkant av en trasig täckremsa fastnat ena änden. Botten Bilden visar ett mikroskopobjektglas med ett tunt skikt av vatten vid dess fyra hörn för att hålla ett täckglas. Anledningen till att använda en bild för att hålla täckglaset är att hålla ungefär samma brännvidd som den som finns när du har dubbelhäftande tejp på bilderna och på så sätt undvika en ny inriktning av mikroskopet medan du are dissekera och överföring av embryon mellan tejp och täckglas. B. En bild med en kort längd av dubbelhäftande tejp appliceras innan dra bort locket papper som används till dechorionating embryot. C. Bilden till vänster visar embryon med intakta chorion skal med markerade främre och bakre ändar, bilden till höger visar embryona i de trasiga chorion skalen innan de överfördes på täckglaset med lim remsan D & E Diagram som visar två.. sätt för att överföra, placering och rikta dechorionated embryon på lim remsor. De embryon omfattades av 10S olja efter en lämplig uttorkning tid. F & G. Diagram som visar hur man öppnar toppen av nålen och placera den så att injicera.

Enstaka eller tidsförlopp bilder som kommer från de ovan beskrivna experimenten kan analyseras direkt med Leica programvara eller sparas i. TIF-filer som ett öppet format tillgänglig för ytterligare kvantifiering eller analyser redigering med andra gemensamma program bildanalys som Bild J, Photoshop och MetaMorph etc. Två exempel för att illustrera detta diskuteras nedan:

Exempel 1: En time-lapse film (Figur 3) visar den dynamiska kinetochore rekrytering av GFP-Cdc20 och kromosom rörelse i levande Drosophila syncytiala embryon. Regionen av intresse från ursprungliga tidsförlopp sekvens bilder bestämdes / redigeras och automatiska batch konverteras med Photoshop. Filmen har sammanställts med hjälp QuickTime.

Figur 3. En time-lapse film visar den dynamiska kinetochore rekrytering av GFP-Cdc20 och kromosom rörelse i levande Drosophila syncytiala embryon. (A) Time-lapse bilder togs från en transgen syncytial embryo samuttrycka GFP-Cdc20 (i grönt)och RFP-Histon 2B (i rött) fusionsproteiner och registrerades med hjälp av en Leica TCS SP2 konfokala system vid 18 ° C under nukleära division cykler 7-8. Ramar togs var 10 sekunder. Ramen med cellerna redan profas behandlas som noll tidpunkten ^10. Klicka här för att visa filmen för figur 3A . (B) GFP-Cdc20 lätt kan observeras på profas och prometaphase kinetochores (B3 & 4, vita pilar) och kvarstår på metafas och anafas kinetochores (B5 & 6, vita pilar). GFP-Cdc20 är undantagna från interfas kärnan (White pilspets), in i kärnan i början av profas. Kromatin morfologier bestämdes med användning av samuttryckt His2BmRFP som markörer (B8-14). Staplar = 5 mm.

Exempel 2: SAC funktioner kan studeras genom att manipulera de embryon genom mikroinjektion antikroppar, fluorescensmärkta proteiner eller Chemical föreningar av intresse som eventuellt utlöser SAC. Till exempel injicera kolkicin att depolymerisera mikrotubuli så provocerande att SAC som visas i figur 4 ^10.

Figur 4. MAD2 är viktigt för colchicin-åberopade SAC-funktionen ^10. GFP-cdc20; MAD2 ^{+ / +,} GFP-cdc20; MAD2 ^EY (MAD2 ^{- / -} null-mutant) och GFP-MAD2; MAD2 ^EY embryon behandlades med kolchicin genom mikroinjektion. Time-lapse konfokala bilder togs före (01, 07 & 13) eller efter injektion (02-06, krönskivor, 08-12, mitt paneler, 14-18, botten paneler). GFP-Cdc20 var (topp och mitten paneler) eller GFP-MAD2 (nedre panelen) kinetochor signaler som används som cellcykelprogressionen markörer. Ovanpanelen, pilarna indikerar de gripna kinetochores i 02-06. Området markeras med en pil i 01 indikerar att före kolchicin behandling, GFP-CDC20 är utesluten från slutet av interfas kärnan. Mittpanelen, i frånvaro av endogen MAD2, GFP-Cdc20 signaler fortsätter att oscillera i och ut ur kärnan, och till och från de kinetochores, även cytokines verkar fungera dåligt, skulle som kan förväntas i embryon som saknar mikrotubuli, i närvaro av kolchicin (indikerad med pilar i 07-12) vilket antyder en misslyckades SAC funktion för att gripa celler som svar på kolchicin behandling. Separation av dottern kärnan inte i bild 10. Bottenpanelen, pilspetsar i 14-18 visar greps kinetochores med ackumulerad GFP-MAD2 fusionsproteiner att föreslå den funktionella GFP-MAD2 räddningsläge SAC felet fenotypen i MAD2 mutant embryo. Arrowhead i 13 indikerar GFP-MAD2 ackumulering i ett sent interfas kärna. Bar = 5 mm. Embryona mikroinjicerades med ~ 1% ägg volym av en 100mg/ml kolchicin stamlösning i 1 x PBS.

Discussion

Protokollet som beskrivs här är en generisk metod för avbildning flyger syncytiala embryon med hjälp av en Leica TCS SP2 konfokala laserskanning mikroskop och kan modifieras för att passa andra mikroskop system och kan även anpassas för att studera andra genfunktioner med Drosophila syncytiala embryon. Vi har använt detta protokoll för att studera många aspekter av spindelenhet checkpoint, dynamik och protein proteolys med hjälp av transgena flugor eller polyklonala antikroppar för att visualisera det protein lokalisering i levande eller fasta prover ^4,6,12-14.

Det är enklast att hålla flugorna i nya flaskor fly mat när de samlar in små mängder (~ 10 - 100) av ägg. Detta minskar krångel att göra och förbereda ytterligare äpple plattor juice agar och ägg kammare insamling som beskrivs i andra publikationer ^15,16. Tillsatsen av en liten fyrkant av trasigt täckglas glaset i ena änden av limmet remsa på täckglaset gör det mycket lättareför att öppna nålen och bestämma injektionsvolymen genom att justera inställningarna mikroinjektion systemet medan nålen nedsänkning i 10S oljan. Graden av uttorkning av embryot är viktig för framgång injektion för att undvika läckage och underhåll av embryon livskraft, särskilt för de experiment som kräver en lång tid eller när höja tränsformanter efter injektion. Det finns dock inget gyllene regel för exakt hur lång tid uttorkning krävs. Detta varierar från experiment till experiment och beror på mängden av den injicerade lösningen och fuktigheten av arbetsmiljön.

Funktionerna hos en specifik protein av intresse kan manipuleras genom mikroinjektion specifika proteininhibitorer, mono-eller poly-klonala antikroppar mot ett specifikt protein, budbärar-RNA eller fluorescensmärkta peptider under vildtyp eller genetisk bakgrund mutation. Många av dessa muterade linjer eller GFP-märkta transgena linjer är offentligt AVAILABLE från Drosophila lager centrum och de flesta av dem är noterade på Flybase ( http://flybase.org/~~V ) och kan sökas på nätet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essential equipment and reagents:
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems.
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens.
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97).
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used.
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump.
Reagents:
Maize meal	SUMA, UK		100.0g
Brown sugar	Billington’s, UK		50.0g
Dry yeast	DCL YEAST Ltd. UK		25.0g
Agar	Fisher Scientific	106556	12.5g
Sorbic acid	BDH, VWR International Ltd. UK	8829310	0.4g
Benzoic acid	Fisher Scientific	1019599	2.9g
Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate)	BDH, VWR International Ltd. UK	K35969015	0.9g
H2O up to 1L
Table 1. Fly food ingredients.
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma.
Dry yeast: Thomas Allison, UK.
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope.
Coverslip: BDH, VWR International Ltd. UK Microscope slide: BDH, VWR International Ltd. UK Siliconised glass capillaries: GC-100-10, Harvard Fine loading tip: 20μl eppendorf lot: W215818J Tweezers Fine pen brush