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Biology

Illustrating के गतिशील kinetochore प्रोटीन और रहने में क्रोमोजोम प्रस्ताव व्यवहार के द्वारा mitotic चेकप्वाइंट अध्ययन Published: June 14, 2012 doi: 10.3791/3763
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Cell and Molecular Biosciences, University of Newcastle, United Kingdom

Summary

kinetochore है जहां सैक अपनी बहन क्रोमेटिडों की mitotic अलगाव की निगरानी के संकेत शुरू की. एक विधि के लिए में गुणसूत्र गति के साथ भर्ती और kinetochore प्रोटीन और उसके समन्वय के कारोबार कल्पना में वर्णित है

Abstract

धुरी विधानसभा चौकी तंत्र (एसएसी) के एक सक्रिय संकेत है, जो गुणसूत्र kinetochores और तकला सूक्ष्मनलिकाएं के बीच बातचीत पर नज़र रखता है जब तक गुणसूत्रों ठीक से जुड़े हुए हैं पश्चावस्था शुरुआत को रोकने के है. कोशिकाओं aneuploidy या जीनोमिक अस्थिरता, और इसलिए कैंसर और जन्म दोष और अल्जाइमर एक जैसे अन्य मानव रोगों को रोकने के लिए इस तंत्र का उपयोग करने के लिए. Mad1 जैसे सैक घटकों के एक नंबर, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, रॉड और अरोड़ा बी kinase की पहचान की गई है और वे सभी kinetochore गतिशील प्रोटीन कर रहे हैं 2. प्रमाण बताते हैं कि kinetochore जहां सैक संकेत शुरू की है. सैक प्रधानमंत्री नियामक लक्ष्य Cdc20 है. Cdc20 आवश्यक APC / सी (ए पी naphase romoting ग omplex या सी yclosome के) 3 activators में से एक है और भी kinetochore गतिशील 4-6 प्रोटीन है. सैक, जब सक्रिय एक की गतिविधि को रोकता हैपीसी / सी के दो प्रमुख substrates, cyclin बी securin के विनाश को रोकने के लिए, जिससे लिए 7,8 संक्रमण पश्चावस्था मेटाफ़ेज़ रोकने. बिल्कुल सही कैसे सैक संकेत शुरू की है और इकट्ठे और kinetochores पर APC / सी पर प्रसारित को बाधित करने के लिए अपने कार्य अभी भी मायावी रहता है.

ड्रोसोफिला एक अत्यंत विनयशील प्रायोगिक प्रणाली है, मानव एक है, लेकिन तुलना में एक बहुत सरल और बेहतर - समझ जीव शेयर आम में मौलिक प्रक्रियाओं कि. यह है, शायद, एक सबसे अच्छा जीवों के लिए जीवित कोशिकाओं में जैव इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयोग, अंतरिक्ष और समय में mitotic की घटनाओं के दृश्य के लिए विशेष रूप से, जल्दी भ्रूण के रूप में 13 तेजी से परमाणु विभाजन तुल्यकालित चक्र (8-10 मिनट के माध्यम से चला जाता है 25 ° सी) में प्रत्येक चक्र के लिए और धीरे - धीरे 9 प्रांतस्था नीचे सिर्फ एक monolayer में नाभिक का आयोजन.

यहाँ, मैं एक जैव इमेजिंग ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला अभिव्यक्ति पद्धति का उपयोग करके प्रस्तुतGFP गाना (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या ब्याज और एक Leica टीसीएस SP2 के लेजर confocal स्कैनिंग खुर्दबीन लिए GFP सैक के कुछ घटकों के संलयन प्रोटीन, Cdc20 और Mad2 की छवियाँ दिखा द्वारा मक्खियों में सैक समारोह अध्ययन प्रणाली के संस्करण लक्षित प्रोटीन उदाहरण के रूप में.

Protocol

1. ट्रांसजेनिक मक्खियों और रखरखाव

  1. ट्रांसजेनिक इस प्रदर्शन में इस्तेमाल किया मक्खियों: (द्वितीय) Ubq GFP Cdc20, Ubq - आरएफपी - His2B के (एक्स *); Ubq GFP-Cdc20 (द्वितीय *), Ubq GFP-Cdc20 (द्वितीय), (mad2 EY * तृतीय) और Ubq - GFP Cdc20 ट्रांसजेनिक मक्खियों पहले एक मानक पी तत्व मध्यस्थता ट्रांसजेनिक 10,11 दृष्टिकोण और Ubq - आरएफपी - His2B के UMR 144 / CNRS संस्थान क्यूरी पर Yohanns Belaïche से एक तरह का उपहार है के माध्यम से प्रयोगशाला में उत्पन्न थे, पेरिस, फ्रांस. वे मानक ड्रोसोफिला आनुवंशिकी के माध्यम से एक Mad2 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में पेश किए गए. mad2 EY मूल उत्परिवर्ती लाइन के ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र से खरीदा गया था. हम इस प्रोटोकॉल transformants जुटाने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया पर चर्चा करेंगे.
    नोट: * गुणसूत्र संख्या का प्रतिनिधित्व करता है.
  2. रखरखाव: ट्रांसजेनिक मक्खियों 25 में बनाए रखा गया ° प्लास्टिक शीशियों containin में सीजी खाना उड़ान भरने के लिए और शीर्ष पर अतिरिक्त सूखी खमीर पाउडर के साथ. शीशी नियमित रूप से हर 3-4 सप्ताह बढ़ती शर्तों (चित्रा 1) के आधार पर बदल दिया गया था.

2. भोजन तैयार फ्लाई (लैब पैमाने)

  1. मक्खी खाद्य मिश्रण का एक उचित मात्रा लगातार सरगर्मी के साथ गरम घटकों को भंग किया गया था.
  2. इस माध्यम के बारे में 8-10 मिलीग्राम घोल प्रत्येक प्लास्टिक (2.5 सेमी व्यास x 8 सेमी लंबाई) शीशी Jencons वैज्ञानिक लिमिटेड क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर के रूप में वितरित किया गया.
  3. जब भोजन घोल निर्धारित किया गया था और कमरे के तापमान पर ठंडा, शीशी तो एक कपास फोम प्लग के साथ में खामियों को दूर किया है. इन खाद्य पदार्थों शीशियों कि फिर एक प्लास्टिक की थैली में बंद है और 4 ° सी बाद में उपयोग में रखा एक ट्रे में रखा जाता है.

3. छोटे पैमाने पर अंडे संग्रह

  1. 2-3 दिन पुराने वयस्क मक्खियों के बारे में 50 जोड़े करना के लिए एक ताजा मक्खी भोजन 25 में इसकी सतह पर अतिरिक्त सूखी खमीर पाउडर के साथ आपूर्ति की शीशी डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिया गयाभ्रूण आईएनजी.
  2. मक्खियों तो एक ताजा शीशी के लिए हर घंटे स्थानांतरित कर रहे हैं और शीशी में भ्रूण 30 मिनट के लिए छोड़ करने के लिए सुनिश्चित करें एकत्र भ्रूण के कुछ परमाणु विभाजन चक्र लगभग 8-10 आयु वर्ग के हैं जब नाभिक धीरे - धीरे प्रांतस्था के लिए पलायन कर रहे हैं और एक के रूप में आयोजित एकल monolayer. पहले घंटे संग्रह सामान्य रूप से खारिज कर दिया है के रूप में यह अक्सर वृद्ध भ्रूण कि महिला के शरीर में बनाए रखा गया, जब स्थिति बिछाने के लिए उपयुक्त नहीं थे.

4. Coverslips और स्लाइड्स की तैयारी

  1. बाहर एक 50 x 22 मिमी coverslip लो और थोड़ा नम ठीक कलम ब्रश और यह एक खुर्दबीन स्लाइड पर डाल का उपयोग पानी की एक बहुत छोटी राशि के साथ एक तरफ चार कोनों गीला ताकि coverslip केशिका सतह तनाव की वजह से कदम नहीं करता पतली तरल फिल्म की वजह से है.
  2. Coverslip के बीच भर हेपटैन गोंद की एक पतली पट्टी लागू करें, हेपटैन सेकंड में लुप्त हो जाना coverslip पर गोंद छोड़ देना चाहिए.
  3. छोटे वर्गों (~ 1.5 मिमी 2) में एक हीरे की कलम के साथ एक और coverslip कटौती, एक लेने के लिए और गोंद पट्टी (इस सुई टिप खुला जब microinjection आवश्यक है प्रयोग किया जाता है) के एक छोर पर जगह है और भविष्य के लिए दूसरों को बचाने के का उपयोग करें.
  4. एक और खुर्दबीन स्लाइड ले लो और डबल पक्षीय चिपचिपा टेप के बारे में 2 सेमी लंबी और छील कवर कागज का एक टुकड़ा छड़ी. (चित्रा 2A B & देखें).

5. Dechorionate भ्रूण

  1. एक ताजा भोजन शीशी मक्खियों स्थानांतरण और सिक्त ठीक कलम ब्रश का उपयोग करने के लिए स्लाइड पर के बारे में 50 डबल पक्षीय चिपचिपा टेप पर अंडे हस्तांतरण तरल का एक उचित मात्रा के साथ अंडे बाहर फैल करने के लिए अनुमति. जब तरल हवा हो गया है अंडे टेप करने के लिए छड़ी होगी.
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप स्पर्श के तहत उनके लंबे अक्ष के साथ कई बार अंडे गर्भवष्टन तक चिमटी की एक जोड़ी के एक आधे के बाहर की ओर धीरे टूटा हुआ है और खुला है, लेकिन चोर में भ्रूण छोड़आयन के लिए तेजी से निर्जलीकरण को रोकने के खोल. 10-20 अंडे (अंडे एक ही प्रयोग के लिए आवश्यक की संख्या के आधार पर) का इलाज किया गया है जब तक इस प्रक्रिया को जारी रखें.
  3. भ्रूण तो उठाया जा सकता है और जरायु खोल से हटा दिया और धीरे से एक एक करके गोंद एक स्ट्रिप पर रखा. अंडे और रखा जा सकता है या तो भ्रूण समानांतर या गोंद पट्टी के लंबे पक्ष अगर वे microinjected जा रहे हैं पर निर्भर विरोधी समानांतर के लंबे पक्ष के साथ गठबंधन.
  4. भ्रूण या तो Voltalef 10S तेल का एक उचित मात्रा (700 Holocarbon तेल और तेल 27 के 05:01 मिश्रण, सिग्मा) तत्काल इमेजिंग के लिए आगे शुष्क्ीकरण को रोकने के तुरंत कर सकते हैं कवर किया या करने के लिए 3-8 मिनट के लिए एक शुष्क्ीकरण कक्ष में रखा उन्हें निर्जलीकरण आगे कमरे और प्रयोग का उद्देश्य की नमी के आधार पर. निर्जलित भ्रूण 10S तेल के साथ कवर किया जाना चाहिए जब उचित हो अधिक से निर्जलीकरण को रोकने के लिए अगर microinjection आवश्यक है. (चित्रा -2 सी, डी.एंड ई).

6. इमेजिंग भ्रूण

  1. रहने वाले भ्रूण के समय व्यतीत हो या एकल छवियों HCX पी एल एपीओ सीएस 40X 1.25 तेल विसर्जन उद्देश्य (60 या 100X उद्देश्यों के प्रयोग के उद्देश्य पर भी निर्भर करता है, उच्च किया जा सकता है के साथ एक Leica टीसीएस SP2 के उल्टे confocal माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं बढ़ाई विरंजन हो जाएगा फोटो) का इस्तेमाल किया.
  2. जब इमेजिंग एकाधिक, fluorophores है, और जो स्पेक्ट्रा अतिव्यापी है एक ही भ्रूण में सह व्यक्त प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य क्रमिक रूप से एकत्र किया गया था. Leica टीसीएस SP2 प्रणाली पर उपलब्ध तरंगदैर्य उत्तेजना और उत्सर्जन कर रहे हैं: GFP, λ पूर्व: 488 एनएम और λ उन्हें: 500-600 एनएम. आरएफपी, λ पूर्व: 543 एनएम और λ उन्हें: 555-700 एनएम.
  3. एक एकल छवि आमतौर पर 2 - फ्रेम स्कैन के एक औसत के साथ 2 scanlines की एक औसत के रूप में प्राप्त किया गया था. यह कम से कम 6.3 सेकंड लेता है एक 512x512 पी स्कैनएक साथ स्कैन मोड, एक अनुक्रमिक स्कैन मोड के लिए और 15.44 सेकंड में और ixel के छवि एक अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात का उत्पादन. इन समय को ध्यान में रखा जा सकता है जब समय चूक की छवि एकत्र करने के लिए समय फ्रेम की स्थापना की जरूरत है.
  4. pinhole है सामान्य रूप से 1-2 ए.यू. (हवादार इकाई) स्थापित किया गया था, और लेजर शक्ति सबसे कम संभव स्तर पर किसी भी महत्वपूर्ण photobleaching से बचने के लिए समायोजित किया गया था.

7. उपयुक्त अभिकर्मकों के साथ भ्रूण Microinjecting द्वारा सैक भड़काने

  1. प्रयोग से पहले सुई तैयार करो. हम सुई Siliconised कांच के capillaries (जीसी-100-10 हार्वर्ड,) से खींच पसंद करते ज्वलंत / भूरे रंग micropipette डांड़ी (Sutter साधन, मॉडल: P-97) का उपयोग करने के लिए मानकों के साथ: गर्मी = 600 = 90, vel खींच = 70 , डेल = 150.
  2. इंजेक्शन बफर में अभिकर्मक के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता के 1-2 मिलीग्राम एक ठीक से लोड हो रहा है टिप (है: W215818J 20 μl Eppendorf बहुत) का उपयोग कर के साथ सुई backfill.
  3. सुई में सुई माउंट होlder पर दबाव Eppendorf इंजेक्शन नियंत्रण प्रणाली से जुड़े पाइप के साथ खुर्दबीन.
  4. 40X उद्देश्य के तहत एक भ्रूण का पता लगाएं और देखने के क्षेत्र के केंद्र में सुई चलती है और धीरे - धीरे यह सही फोकल हवाई जहाज़ के लिए कम से फोकल हवाई जहाज़ को बदलने के बिना सुई छाया लगता है.
  5. भ्रूण दूर धीरे स्थानांतरित करने के लिए टूटी हुई coverslip पूर्व गोंद पट्टी के एक छोर पर घुड़सवार के छोटे वर्ग. बहुत धीरे से सुई टिप चाल जब तक यह छोटा सा वर्ग coverslip के किनारे हिट धीरे टूटता है और इसे खोलने के लिए.
  6. भ्रूण वापस देखने में ले जाएँ और इंजेक्शन के लिए सही उम्र का भ्रूण का चयन करें. मैं सामान्य रूप से परमाणु विभाजन चक्र में 5-7 भ्रूण के रूप में इस से पहले नाभिक प्रांतस्था बाहर विस्थापित इंजेक्षन. परमाणु विभाजन चक्र चरणों GFP-Cdc20 या आरएफपी - histone 2B परमाणु संकेत 9 इंजेक्शन के लिए पहले की फ्लोरोसेंट संकेतों के एक त्वरित स्कैन के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
  7. ध्यान से Embry चालओ सुई के करीब है और दोनों भ्रूण और सुई के लिए फोकल हवाई जहाज़ बदल डालना. सुई में भ्रूण ले जाएँ और अभिकर्मक की एक बूंद वांछित स्थिति में इंजेक्षन और भ्रूण दूर स्थानांतरित (या microinjection प्रणाली के लिए निर्देशों का पालन करें). भ्रूण उसके पीछे से या प्रयोग का उद्देश्य के आधार पर की ओर से अंतःक्षिप्त किया जा सकता है.
  8. एक बार भ्रूण इंजेक्शन के लिए उचित समय पर imaged किया जा करने के लिए तैयार है. (चित्रा 2 एफ और जी देखें)

8. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
आकृति 1. आवश्यक सामग्री:. ठीक कलम, ब्रश, ख. छोटे वर्ग कंटेनर टूटा चश्मा, ग. 22 x 50 मिमी coverslip, घ. खुर्दबीन स्लाइड ई. डबल पक्षीय चिपचिपा टेप, च. पर ढक्कन, छ छेद के साथ टेस्ट ट्यूब में सूखी खमीर पाउडर. खमीरइस ग्रेन्युल मक्खी रखरखाव, घंटे के लिए प्रयोग किया जाता है. भोजन शीशी, मैं उड़. एक dechorionate भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया चिमटी के एक आधा, एक जोड़ी चिमटी जम्मू, कश्मीर. हेपटैन गोंद तरल कंटेनर (बड़ा फ्लास्क).

चित्रा 2
चित्रा 2. चित्र और चरण 4, 5 कदम और चरण 7 में microinjection के लिए सुई की तैयारी में भ्रूण dechorionation में coverslips स्लाइड्स की तैयारी दिखाते हैं. ए. शीर्ष तस्वीर अपने मध्य भर में हेपटैन गोंद की एक पट्टी और एक टूटी हुई एक छोर पर अटक coverslip का एक छोटा सा वर्ग के साथ एक coverslip से पता चलता है. नीचे चित्र अपने चारों कोनों पर एक पानी की एक पतली परत को एक coverslip पकड़ के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड दर्शाता है. किसी स्लाइड का उपयोग करने के लिए coverslip पकड़ के लिए कारण लगभग एक ही फोकल दूरी के रूप में पाया गया कि जब आप स्लाइड पर डबल पक्षीय टेप है और इस तरह refocusing की खुर्दबीन से परहेज रखना है जबकि गिरफ्तारी आपई विदारक और के बीच टेप और coverslip भ्रूण स्थानांतरित बी. डबल पक्षीय स्कॉच टेप की एक छोटी लंबाई के साथ एक स्लाइड बंद उसके कवर भ्रूण सी dechorionating के लिए इस्तेमाल कागज छीलने से पहले लागू होता है. बाईं तरफ के तस्वीर चिह्नित पूर्वकाल और कूल्हों के साथ समाप्त होता है बरकरार जरायु गोले के साथ भ्रूण का पता चलता है, सही पर तस्वीर टूट गर्भवष्टन गोले में भ्रूण से पता चलता है कि इससे पहले कि वे coverslip पर गोंद पट्टी के साथ स्थानांतरित कर दिया गया डी और ई दो दिखा आरेख. स्थानांतरित करने, रखने और aligning के गोंद स्ट्रिप्स dechorionated भ्रूण के लिए तरीके. भ्रूण 10S तेल से एक उपयुक्त शुष्क्ीकरण अवधि के बाद कवर किया गया, एफ और जी आरेख दिखा कैसे सुई और स्थिति यह इतना के रूप में इंजेक्षन करने के लिए की नोक को खोलने के लिए.

एकल या समय चूक ऊपर वर्णित प्रयोगों से प्राप्त छवियों सीधे Leica है सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर सकते हैं या एक खुला के लिए के रूप में. TIF फ़ाइलों में सहेजीआगे मात्रा का ठहराव या अन्य छवि जम्मू, फ़ोटोशॉप और Metamorph आदि दो उदाहरण के रूप में आम छवि विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग कर इस उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए संपादन विश्लेषण उपलब्ध rmat नीचे चर्चा कर रहे हैं:

उदाहरण 1: एक फिल्म समय चूक (चित्रा 3) GFP-Cdc20 और ड्रोसोफिला syncytial भ्रूण में रहने वाले गुणसूत्र गति का गतिशील kinetochore भर्ती से पता चलता है. ब्याज की मूल समय चूक अनुक्रम छवियों से क्षेत्र निर्धारित / संपादित और स्वचालित बैच फ़ोटोशॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिवर्तित किया गया था. फिल्म QuickTime के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इकट्ठा किया गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक समय चूक फिल्म GFP-Cdc20 और ड्रोसोफिला syncytial भ्रूण में रहने वाले गुणसूत्र गति का गतिशील kinetochore भर्ती से पता चलता है. (ए) समय चूक छवियों को एक ट्रांसजेनिक syncytial भ्रूण से लिया गया था GFP-Cdc20 (हरा) में सह व्यक्तऔर आरएफपी histone 2B (लाल) में संलयन प्रोटीन और 18 डिग्री सेल्सियस परमाणु विभाजन चक्र के दौरान 7-8 Leica टीसीएस SP2 confocal प्रणाली का उपयोग कर दर्ज किए गए. फ्रेम्स हर 10 सेकंड ले जाया गया. prophase में पहले से ही कोशिकाओं के साथ फ्रेम शून्य समय 10 बिंदु के रूप में इलाज किया जाता है. के चित्रा 3A लिए फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . (बी) GFP-Cdc20 आसानी से पर prophase और prometaphase kinetochores (बी 3 और 4, सफेद तीर) देखा जा सकता है और मेटाफ़ेज़ और पश्चावस्था kinetochores (बी 5 और 6, सफेद तीर) पर बनी हुई है. GFP-Cdc20 अंतराप्रावस्था नाभिक (व्हाइट नोक) से बाहर रखा गया है, जल्दी prophase से नाभिक में प्रवेश. की chromatin morphologies मार्कर (B8-14) के रूप में सह व्यक्त His2BmRFP के का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. बार्स 5mm =.

उदाहरण 2: सैक कार्यों microinjecting एंटीबॉडी, fluorescently लेबल प्रोटीन या chemica द्वारा भ्रूण जोड़ तोड़ द्वारा अध्ययन किया जा सकता हैब्याज की मैं यौगिकों कि संभावित ट्रिगर सैक. Colchicine इंजेक्शन उदाहरण के लिए सूक्ष्मनलिकाएं depolymerize सैक उत्तेजक के रूप में चित्रा 4 10 में संकेत दिया तो.

चित्रा 4
चित्रा 4. Mad2 colchicine लागू सैक 10 समारोह के लिए आवश्यक है. GFP-cdc20, mad2 / + +, GFP cdc20, mad2 EY (mad2 / अशक्त उत्परिवर्ती) और GFP mad2, mad2 EY ने भ्रूण microinjection द्वारा colchicine साथ इलाज किया गया. समय चूक confocal छवियों (07 01, और 13) से पहले या इंजेक्शन के बाद ले जाया गया (02-06, शीर्ष पैनल, 08-12, मध्य पैनल, 14-18, नीचे पैनल). GFP-Cdc20 (शीर्ष और मध्यम पैनल) या (नीचे पैनल) GFP-Mad2 के kinetochore संकेत सेल चक्र प्रगति मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया गया. शीर्ष पैनल, तीर 02-06 में गिरफ्तार kinetochores से संकेत मिलता है. 01 में एक तीर से चिह्नित क्षेत्र colchicine उपचार, GFP सी से पहले कि इंगित करता हैdc20 देर अंतराप्रावस्था नाभिक से बाहर रखा गया है. मध्य पैनल, Mad2 अंतर्जात के अभाव में, GFP-Cdc20 संकेत नाभिक के अंदर और बाहर हिलाना जारी है, और पर और kinetochores के बंद, हालांकि कोशिका विभाजन में कोशिकाद्रव्य का दो भागों में अलग - अलग हो जाना करने के लिए खराब हो गया लगता है, के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं कमी भ्रूण में उम्मीद की जाएगी उपस्थिति में, colchicine (07-12 में तीर द्वारा संकेत) colchicine उपचार के लिए प्रतिक्रिया में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने में विफल सैक समारोह के सुझाव. बेटी नाभिक की जुदाई 10 चित्र में विफल रही है. नीचे पैनल, 14-18 में तीर संचित-में GFP Mad2 संलयन प्रोटीन के साथ गिरफ्तार kinetochores से संकेत मिलता है सैक Mad2 उत्परिवर्ती भ्रूण में दोष phenotype के बचाव में कार्यात्मक GFP Mad2 सुझाव. 13 में Arrowhead के एक देर अंतराप्रावस्था नाभिक में GFP-Mad2 संचय इंगित करता है. = 5mm बार. भ्रूण ~ 1% 1 एक्स पीबीएस में एक 100mg/ml colchicine स्टॉक समाधान के अंडे की मात्रा के साथ microinjected गया.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल इमेजिंग syncytial एक Leica टीसीएस SP2 के लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग भ्रूण मक्खी और अन्य खुर्दबीन सिस्टम के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है और भी अन्य जीन ड्रोसोफिला syncytial भ्रूण का उपयोग कर कार्यों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए एक सामान्य तरीका है. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है धुरी विधानसभा जांच की चौकी, प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन ट्रांसजेनिक मक्खियों या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए जीवित या फिक्स्ड 4,6,12-14 नमूनों में प्रोटीन स्थानीयकरण कल्पना proteolysis के कई पहलुओं का अध्ययन.

यह सरल है ताजा मक्खी भोजन शीशियों में मक्खियों रखने के लिए जब अंडे की छोटी संख्या (~ 10 - 100) का संग्रह है. यह बनाने और अन्य 15,16 प्रकाशनों में वर्णित के रूप में अतिरिक्त सेब का रस अगर प्लेटें और अंडे संग्रह कक्षों की तैयारी की परेशानी को कम कर देता है. coverslip पर गोंद पट्टी के एक छोर पर टूटी हुई coverslip कांच का एक छोटा सा वर्ग के अलावा यह एक बहुत आसान बना देता हैसुई को खोलने के लिए और इंजेक्शन की मात्रा का निर्धारण microinjection प्रणाली सेटिंग्स समायोजित जबकि सुई 10S तेल में डुबो रहा है. भ्रूण के शुष्क्ीकरण की डिग्री इंजेक्शन की चोरी से बचने और उन प्रयोगों जो समय की एक लंबी अवधि की आवश्यकता होती है या इंजेक्शन के बाद जब transformants जुटाने के लिए विशेष रूप से भ्रूण व्यवहार्यता को बनाए रखने में सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, वहाँ वास्तव में कितनी देर तक सुखाना की आवश्यकता है के लिए कोई सुनहरा नियम है. इस प्रयोग से प्रयोग करने के लिए भिन्न होता है और इंजेक्शन समाधान और काम वातावरण की नमी की मात्रा पर निर्भर करता है.

ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन का कार्य एक विशिष्ट प्रोटीन, दूत शाही सेना या जंगली प्रकार या आनुवंशिक उत्परिवर्तन पृष्ठभूमि के तहत fluorescently लेबल पेप्टाइड्स के खिलाफ मोनो या पाली clonal एंटीबॉडी विशिष्ट प्रोटीन inhibitors, microinjecting द्वारा चालाकी से किया जा सकता है. इन उत्परिवर्ती लाइनों या GFP टैग ट्रांसजेनिक लाइनों के कई सार्वजनिक av हैंड्रोसोफिला स्टॉक केन्द्रों और उनमें से ज्यादातर से ailable Flybase (पर सूचीबद्ध हैं http://flybase.org/~~V ) और ऑनलाइन के लिए खोजा जा सकता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल वेलकम ट्रस्ट अनुदान के तहत विकसित किया गया था. हम मक्खी के शेयरों को बनाए रखने और पिछले कुछ वर्षों में मक्खी भोजन को तैयार करने के लिए सुश्री मॉरीन Sinclair धन्यवाद. हम भी उसके और इस प्रोटोकॉल के विकास में तकनीकी सहायता की मदद के लिए धन्यवाद श्री माइकल Aitchison चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Essential equipment and reagents:

Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems.

Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens.

Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97).

Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used.

Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump.

Reagents:
Maize meal SUMA, UK 100.0g
Brown sugar Billington’s, UK 50.0g
Dry yeast DCL YEAST Ltd. UK 25.0g
Agar Fisher Scientific 106556 12.5g
Sorbic acid BDH, VWR International Ltd. UK 8829310 0.4g
Benzoic acid Fisher Scientific 1019599 2.9g
Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) BDH, VWR International Ltd. UK K35969015 0.9g
H2O up to 1L

Table 1. Fly food ingredients.

Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma.

Dry yeast: Thomas Allison, UK.

Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope.
  • Coverslip: BDH, VWR International Ltd. UK
  • Microscope slide: BDH, VWR International Ltd. UK
  • Siliconised glass capillaries: GC-100-10, Harvard
  • Fine loading tip: 20μl eppendorf lot: W215818J
  • Tweezers
  • Fine pen brush

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 64 विकास जीवविज्ञान तकला विधानसभा (एसएसी) जांच की चौकी सूत्रीविभाजन लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी प्रणाली kinetochore,
Illustrating के गतिशील kinetochore प्रोटीन और रहने में क्रोमोजोम प्रस्ताव व्यवहार के द्वारा mitotic चेकप्वाइंट अध्ययन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Syncytial भ्रूण
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Sinclair, M., Huang, J. Y. Studying… More

Sinclair, M., Huang, J. Y. Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos. J. Vis. Exp. (64), e3763, doi:10.3791/3763 (2012).

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