Summary
Den kinetochore er der SAC innleder sitt signal overvåke mitotiske segregering av søsterkromatider. En metode er beskrevet for å visualisere rekruttering og omsetning av en av de kinetochore proteiner og koordinering med kromosom bevegelse i
Abstract
Spindelen forsamlingen sjekkpunkt (SAC) mekanismen er en aktiv signal, som overvåker samspillet mellom kromosom kinetochores og spindel mikrotubuli å hindre anaphase utbruddet til kromosomene er riktig tilkoblet. Celler bruker denne mekanismen for å forhindre Aneuploidy eller genomisk ustabilitet, og dermed kreft og andre sykdommer hos mennesker som fødselsskader og Alzheimers 1. En rekke av de SAC komponenter som Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, har Rod og Aurora B kinase blitt identifisert og de er alle kinetochore dynamiske proteiner to. Tyder på at kinetochore er der SAC signalet er igangsatt. Den SAC Prime regulatoriske målet er Cdc20. Cdc20 er en av de grunnleggende APC / C (A naphase P romoting C omplex eller C yclosome) aktivatorer 3 og er også en kinetochore dynamisk protein 4-6. Når aktivert, hemmer SAC aktiviteten i APC / C for å hindre ødeleggelse av to viktige substrater, cyclin B og securin, og hindrer dermed metafase til anaphase overgangen 7,8. Nøyaktig hvordan SAC signalet er initiert og montert på kinetochores og videreformidlet på APC / C for å hemme sin funksjon likevel fortsatt ukjent.
Drosophila er en ekstremt medgjørlig eksperimentelt system, en mye enklere og bedre forstått organisme i forhold til den menneskelige, men en som deler fundamentale prosesser i felles. Det er kanskje en av de beste organismer til bruk for bio-imaging studier i levende celler, spesielt for visualisering av mitotiske hendelsene i rom og tid, som den tidlige embryoet går gjennom 13 raske kjernefysiske divisjon sykluser synkront (8-10 minutter for hver syklus ved 25 ° C) og gradvis organiserer kjerner i én monolayer like under cortex 9.
Her presenterer jeg en bio-imaging-metoden bruker transgene Drosophila uttrykksing GFP (grønt fluorescerende protein) eller dets variant målrettede proteiner av interesse og en Leica TCS SP2 confocal laserskanning mikroskop for å studere SAC-funksjonen i fluer, ved å vise bilder av GFP fusjon proteiner av noen av de SAC komponenter, Cdc20 og Mad2 , som eksempel.
Protocol
1. Transgene fluer og Vedlikehold
- Transgene fluene som brukes i denne demonstrasjonen: Ubq-GFP-Cdc20 (II), Ubq-RFP-His2B (X *); Ubq-GFP-Cdc20 (II *), Ubq-GFP-Cdc20 (II *); mad2 EY ( III *) og Ubq-GFP-Cdc20 transgene fluer tidligere ble generert i laboratoriet via en standard P-element mediert transgen tilnærming 10,11 og Ubq-RFP-His2B er en slags gave fra Yohanns Belaïche på UMR 144 CNRS / Institute Curie, Paris, Frankrike. De ble introdusert i en Mad2 mutant bakgrunn via standard Drosophila genetikk. Den mad2 EY opprinnelige mutant linje ble kjøpt fra Bloomington lager senteret. Vi vil ikke diskutere prosedyre som brukes for å heve transformants i denne protokollen.
Merk: * representerer kromosom nummer. - Vedlikehold: transgene fluer ble opprettholdt ved 25 ° C i plast ampuller containing fly mat og med ekstra tørr gjær pulver på toppen. Hetteglasset ble rutinemessig byttes hver 3-4 uker avhengig vekstforhold (Figur 1).
2. Fly Matlaging (Lab skala)
- En passende mengde på flua maten mix ble varmet opp med konstante stirring å oppløse komponentene.
- Om 8-10 ml av dette mediet ble fordelt som slurry i hvert plast hetteglass (2,5 cm diameter x 8 cm lengde) ved hjelp av en Jencons Scientific Ltd peristaltiske pumpen.
- Når maten slurry ble satt, og er avkjølt til romtemperatur, blir flasken, og plugget med en bomull skum plugg. Disse matvarer ampuller er plassert i en skuff som er så forseglet i en plastpose og oppbevares ved 4 ° C for senere bruk.
3. Småskala Egg Collection
- Ca 50 par 2-3 dagers gamle voksne fluene ble overført til en fersk flue mat hetteglass leveres med ekstra tørr gjær pulver på overflaten ved 25 ° C for layIng embryoer.
- Fluene blir deretter overført til en ny ampulle hver time og la embryoene i hetteglasset i 30 minutter for å sikre noen av de innsamlede embryoer er i alderen rundt kjernefysiske divisjon syklus 8-10 når kjernene blir gradvis migrere til hjernebarken og organisert som en enkelt monolayer. Den første timen Samlingen er normalt forkastet da det ofte inneholder gamle embryoer som ble beholdt i de kvinnelige organer når forholdene ikke var egnet for legging.
4. Forbereder Dekkglass og lysbilder
- Ta ut en 50 x 22 mm dekkglass og litt fuktig de fire hjørnene på den ene siden med en svært liten mengde vann ved hjelp av en fuktig fin penn pensel og legg den på et objektglass slik at dekkglass ikke beveger seg på grunn av kapillær overflatespenningen forårsaket av tynn væske film.
- Påfør en tynn stripe av heptan lim over midten av dekkglass, bør heptan fordampe i løpet av sekunder til å forlate limet på dekkglass.
- Skjær et dekkglass med en diamant penn i små firkanter (~ 1,5 mm 2), plukke opp en og legg den på den ene enden av lim stripe (denne brukes til å åpne nålespissen når mikroinjeksjon er nødvendig) og lagre de andre for fremtidig bruk.
- Ta et annet objektglass og stikke et stykke dobbeltsidig tape ca 2 cm lang til det og skrelle av omslagspapir. (Se figur 2A og B).
5. Dechorionate Embryoer
- Overfør fluene til en fersk mat hetteglass og bruke en fuktet fin penn pensel til å overføre rundt 50 egg på dobbeltsidig tape på lysbildet med en passende mengde væske slik at eggene skal legges ut. Når væsken har fordampet eggene vil holde seg til tape.
- Under en dissekere mikroskop preg eggene flere ganger langs den lange aksen med yttersiden av halvparten av en pinsett forsiktig til den chorion er knust og åpent, men la embryoet i Chorion shell for å forhindre rask uttørking. Fortsett denne prosessen til 10-20 av eggene har blitt behandlet (avhengig av antall egg som kreves for en enkelt eksperiment).
- Embryoene kan deretter bli plukket opp og fjernes fra chorion skallet og forsiktig plassert på limet stripe én etter én. Eggene kan plasseres og justeres enten med den ene langsiden av embryoet parallell eller anti-parallell med langsiden av lim stripen avhenge hvis de skal microinjected.
- Embryoene kan enten dekkes umiddelbart med en passende mengde Voltalef 10S olje (en 05:01 blanding av Holocarbon 700 olje og 27 olje, Sigma) for å hindre ytterligere uttørking for umiddelbar avbildning eller plassert i en uttørking kammer for 3-8 minutter til dehydrere dem videre avhengig av fuktigheten i rommet og formålet med forsøket. De tørkede embryo bør dekkes med 10S olje når det er hensiktsmessig for å hindre over-dehydrering hvis mikroinjeksjon er nødvendig. (Se figur. 2C, D& E).
6. Imaging Embryoer
- Time-lapse eller enkelt bilder av levende embryoer samles ved hjelp av en Leica TCS SP2 invertert konfokalmikroskopi system med en HCX PL APO CS 40X 1,25 oljeneddyppingsobjektivet (60 eller 100X målsettinger kan brukes altfor avhengig av formålet med forsøket, jo høyere forstørrelsen brukte mer bildet bleking vil skje).
- Når bildebehandling flere fluorophores, som har overlappende spektra og er co-uttrykkes i samme embryo, ble hver fluorescerende protein utslipp bølgelengde samlet sekvensielt. Eksitasjon og emisjon bølgelengder tilgjengelige på Leica TCS SP2 systemet er: GFP, λ Ex: 488 nm og λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm og λ Em: 555-700 nm.
- Et enkelt bilde ble ofte hentet som et gjennomsnitt av 2 scanlines med et gjennomsnitt på 2 ramme-skanninger. Dette tar minst 6,3 sekunder å skanne en 512x512 pixel bilde i en simultan skannemodus, og 15.44 sekunder for en sekvensiell skanning modus og produserer en god signal-til-støy-forhold. Disse tidene må tas hensyn til når du setter opp de tidsrammene for time-lapse bilde innsamling.
- Den pinhole ble normalt satt til 1-2 AU (luftig enhet), og laseren makt ble justert til et lavest mulig nivå for å unngå vesentlig fotobleking.
7. Provosere SAC ved Microinjecting embryoer med riktige reagenser
- Forbered nålen før forsøket. Vi foretrekker å trekke nålen fra silikonisert glass kapillærer (GC-100-10, Harvard) med flammende / brun mikropipette avtrekker (Sutter Instrument, Modell: P-97) med parametere: varme = 600, trekk = 90, Vel = 70 , del = 150.
- Etterfylle nålen med 1-2 ml av en passende konsentrasjon av reagensen i injeksjon buffer med en fin lasting tips (20 mL Eppendorf mye: W215818J).
- Monter nålen i nålen holder på mikroskopet med trykkrør koblet til Eppendorf injeksjon kontrollsystemet.
- Finn et foster under 40X objektiv og finne nålen skyggen uten å endre fokalplanet ved å flytte nålen inn i midten av synsfeltet og gradvis senke den til høyre fokusplanet.
- Flytt fosteret vekk forsiktig for å finne det lille torget i den ødelagte dekkglass pre-montert i den ene enden av lim stripen. Svært forsiktig flytte nålespissen inntil den treffer kanten av den lille plassen dekkglass og forsiktig bryter den åpen.
- Flytt embryoene tilbake til syne, og velg embryo av riktig alder for injeksjon. Jeg pleier injisere embryo ved kjernefysiske divisjon syklus på 5-7 da dette er før kjerner vandrer utover til hjernebarken. De kjernefysiske divisjon sykle etapper kan bestemmes ved en rask skanning av de fluorescerende signaler fra GFP-Cdc20 eller kjernefysiske signal av RFP-histone 2B før injeksjon 9.
- Flytt forsiktig den Embryo nær nålen og justere fokusplanet for både fosteret og nålen. Flytt embryoet inn nålen og injisere en dråpe av reagens i ønsket posisjon og flytte embryo bort (eller følg instruksjonene for mikroinjeksjon system). Embryoet kan injiseres fra bakre sin eller fra siden, avhengig av formålet med forsøket.
- Når injisert embryoet er klar til å bli fotografert på riktig tidspunkt. (Se figur 2F & G)
8. Representative Resultater
Figur 1. Nødvendig materiale: ett. fin penn pensel, f.. liten firkant brutt briller container, c. 22 x 50 mm dekkglass, d.. objektglass, e. dobbeltsidig tape, f. tørrgjær pulver i reagensrør med hull på lokket, g. gjærgranule brukes for flue vedlikehold, h. fly mat hetteglass, jeg. en halvparten av en pinsett brukes til dechorionate embryoer, j. en par pinsett, k. heptan lim flytende container (målekolbe).
Figur 2. Diagrammene viser utarbeidelsen av Dekkglass og lysbilder i trinn 4, embryo dechorionation i trinn 5 og nål forberedelsene til mikroinjeksjon i trinn 7. En. Det øverste bildet viser en dekkglass med en stripe av heptan lim på tvers midten og en liten firkant av et ødelagt dekkglass fast til den ene enden. Det nederste bildet viser et objektglass med et tynt lag med vann på de fire hjørnene for å holde en dekkglass. Bakgrunnen for å benytte et lysbilde å holde dekkglass er å holde omtrent samme brennvidde som finnes når du har dobbeltsidig tape på lysbildene og dermed unngå refocusing mikroskopet mens du are dissekere og overføre de embryoer mellom tape og dekkglass. B. Et lysbilde med en kort lengde på dobbeltsidig teip søkt før peeling av sin omslagspapir brukes dechorionating embryoet. C. Bildet til venstre viser embryoer med intakte chorion skjell med merket fremre og bakre ender, bildet til høyre viser embryoene i de ødelagte chorion skjellene før de ble overført på dekkglass med limet stripen D & E Diagrams viser to.. måter for overføring, plassere og justere de dechorionated embryoene på lim strimler. Embryoene ble dekket av 10S olje etter en passende uttørking periode. F & G. Diagrams viser hvordan du åpner nålespissen og plasser den slik som å injisere.
Enkle eller time-lapse bilder hentet fra de ovennevnte beskrevne forsøkene direkte kan analyseres ved hjelp av Leica programvare eller lagret i. TIF-filer som en åpen FOrmat tilgjengelig for ytterligere kvantifisering eller redigering analyser ved hjelp av andre vanlige bildeanalyse programmer som for eksempel Bilde J, Photoshop og MetaMorph etc. To eksempler for å illustrere dette er omtalt nedenfor:
Eksempel 1: En time-lapse film (figur 3) viser den dynamiske kinetochore rekruttering av GFP-Cdc20 og kromosom bevegelse i levende Drosophila syncytial embryoer. Regionen interesse fra originale tid-lapse sekvens bilder var bestemt / redigert og automatisert-batch konvertert ved hjelp av Photoshop programvare. Filmen ble satt sammen ved hjelp av QuickTime-programvare.
Figur 3. En time-lapse film viser det dynamiske kinetochore rekruttering av GFP-Cdc20 og kromosom bevegelse i levende Drosophila syncytial embryoer. (A) Time-lapse bildene ble tatt fra en transgen syncytial embryo co-uttrykke GFP-Cdc20 (i grønt)og RFP-histone 2B (i rødt) fusion proteiner og ble registrert med en Leica TCS SP2 confocal system ved 18 ° C i løpet av kjernefysiske divisjon sykluser 7-8. Rammer ble tatt hvert 10. sekund. Rammen med cellene allerede i prophase behandles som null tidspunktet 10. Klikk her for å vise film for Figur 3A . (B) GFP-Cdc20 lett kan observeres på prophase og prometaphase kinetochores (B3 & 4, hvite piler) og vedvarer på metafase og anaphase kinetochores (B5 og 6, hvite piler). GFP-Cdc20 er ekskludert fra interfase nucleus (White pilspiss), inn i kjernen av tidlig prophase. Chromatin morfologi ble bestemt med co-uttrykkes His2BmRFP som markører (B8-14). Bars = Ikke 5mm.
Eksempel 2: SAC funksjoner kan studeres ved å manipulere embryoene ved microinjecting antistoffer, fluorescensmerkede proteiner eller chemical forbindelser av interesse at potensielt utløser SAC. For eksempel injiserer kolkisin til depolymerize mikrotubuli så provoserer SAC som angitt i figur 4 10.
Figur 4. Mad2 er avgjørende for kolkisin-påkalte SAC funksjon 10. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 EY (mad2 - / - null mutant) og GFP-mad2; mad2 EY embryoene ble behandlet med kolkisin ved mikroinjeksjon. Time-lapse confocal bildene ble tatt før (01, 07 & 13) eller etter injeksjon (02-06, topplater, 08-12, mellomledere paneler; 14-18, nedre paneler). GFP-Cdc20 (øvre og midtre paneler) eller GFP-Mad2 (nederst panel) kinetochore signalene ble brukt som cellesyklusprogresjon markører. Top panel, pilene viser de arresterte kinetochores i 02-06. Området merket med en pil i 01 indikerer at før kolkisin behandling, GFP-CDC20 er ekskludert fra slutten av interfase kjernen. Midtre panelet, i fravær av endogent Mad2, GFP-Cdc20 signaler fortsetter å svinge inn og ut av kjernen, og av og på kinetochores, men cytokinese ser ut til å være defekt, ville som forventet i embryoer mangler mikrotubuli, i nærvær av kolkisin (angitt med piler i 07-12) tyder på en mislykket SAC funksjon i arrestere celler som respons på kolkisin behandling. Separering av datteren kjernen mislyktes i bilde 10. Bunnpanel, pilspisser i 14-18 indikerer arrestert kinetochores med akkumulert GFP-Mad2 fusion proteiner å foreslå funksjonelle GFP-Mad2 i redning på SAC mangelen fenotypen i Mad2 mutant embryo. Arrowhead i 13 indikerer GFP-Mad2 akkumulering i en sen interfase kjerne. Bar = 5mm. Embryoene ble microinjected med ~ 1% egg volum av en 100mg/ml kolkisin stamløsning i 1 x PBS.
Discussion
Protokollen er beskrevet her er en generisk metode for avbildning fly syncytial embryo ved hjelp av en Leica TCS SP2 confocal laserskanning mikroskop og kan bli endret for å passe andre mikroskop systemer, og kan også tilpasses til å studere andre genet funksjoner ved hjelp av Drosophila syncytial embryoer. Vi har brukt denne protokollen til å studere mange aspekter av spindelen forsamlingen sjekkpunkt, protein dynamikk og protein proteolyse bruker transgene fluer eller polyklonale antistoffer til å visualisere protein lokalisering i levende eller faste prøver 4,6,12-14.
Det enkleste er å holde fluene i ferske fluefiskere mat ampuller ved innsamling små tall (~ 10 - 100) av egg. Dette reduserer stresset med å lage og forberede ytterligere eplejuice agar plater og egg samling kamre som beskrevet i andre publikasjoner 15,16. Tillegg av en liten firkant av knust dekkglass glass i den ene enden av lim stripe på dekkglass gjør det mye enklereå åpne nålen og bestemme injeksjonsvolum ved å justere mikroinjeksjon systeminnstillingene mens nålen er fordype i 10S olje. Graden av uttørking av embryo er viktig for suksessen til injeksjon for å unngå lekkasjer og vedlikehold av embryoer levedyktighet spesielt for de eksperimentene som krever en lang periode eller når heve transformants etter injeksjon. Men det er ingen gylden regel for hvor lenge uttørking er nødvendig. Dette varierer fra eksperiment til eksperiment og avhenger av mengden av løsningen injisert og fuktigheten av arbeidsmiljøet.
Funksjonene til et bestemt protein av interesse kan manipuleres av microinjecting bestemt protein-hemmere, mono-eller poly-klonal antistoffer mot et bestemt protein, messenger RNA eller fluorescensmerkede peptider henhold villtype eller genetisk mutasjon bakgrunn. Mange av disse muterte linjer eller GFP-merkede transgene linjer er offentlig AVailable fra Drosophila lager sentre og de fleste av dem er notert på Flybase ( http://flybase.org/~~V ) og kan søkes på nettet.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne protokollen ble utviklet under et Wellcome Trust stipend. Vi takker Ms Maureen Sinclair for å opprettholde flua bestander og forberede flua mat gjennom årene. Vi ønsker også å takke Mr. Michael Aitchison for hans hjelp og teknisk støtte i utviklingen av denne protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Essential equipment and reagents: |
|||
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems. |
|||
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens. |
|||
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97). |
|||
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used. |
|||
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump. |
|||
Reagents: |
|||
| Maize meal | SUMA, UK | 100.0g | |
| Brown sugar | Billington’s, UK | 50.0g | |
| Dry yeast | DCL YEAST Ltd. UK | 25.0g | |
| Agar | Fisher Scientific | 106556 | 12.5g |
| Sorbic acid | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 | 0.4g |
| Benzoic acid | Fisher Scientific | 1019599 | 2.9g |
| Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 | 0.9g |
| H2O up to 1L | |||
Table 1. Fly food ingredients. |
|||
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma. |
|||
Dry yeast: Thomas Allison, UK. |
|||
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope. |
|||
|
|||
References
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).
- Zekanowski, C., Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).
- Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).
- Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).
- Huang, J., Raff, J. W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).
- Xia, G. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).
- Lorca, T. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).
- Howell, B. J. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).
- Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
- Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).
- Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. DNA cloning: A practical approach. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).
- Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).
- Huang, J. Y., Raff, J. W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).
