Summary
Denne protokollen er med hell brukes til å kvantitativt oppdage nivåer og arealutnyttelse av mRNA uttrykk i flere vevstyper over arter virveldyr. Metoden kan oppdage lav overflod utskrifter og tillater behandling av hundrevis av lysbilder samtidig. Vi presenterer denne protokollen ved hjelp av uttrykk profilering av aviær embryonale hjerne formasjon som et eksempel.
Abstract
Knowing timing, nivå, cellulær lokalisering, og celletype at et gen blir uttrykt i bidrar til vår forståelse av funksjonen av genet. Hver av disse funksjonene kan utføres med in situ hybridisering til mRNA i cellene. Her presenterer vi en radioaktiv in situ hybridisering metode modifisert fra Clayton et al. (1988) en som har jobbet med suksess i vårt laboratorium i mange år, særlig for voksne virveldyr hjerner 2-5. De lange komplementære RNA (Crna) sonder til målet sekvensen tillater påvisning av lav overflod transkripsjoner 6,7. Inkorporering av radioaktive nukleotider inn i Crna sondene åpner for ytterligere følsomhet for lav overflod utskrifter og kvantitative analyser, enten ved lysfølsom x-ray film eller emulsjon belagt over vev. Disse påvisningsmetoder gir en langsiktig oversikt over mål genuttrykk. Sammenlignet med ikke-radioaktive probe methods, slik som DIG-merking, ikke den radioaktive proben hybridisering metoden ikke krever flere forsterker trinn ved hjelp HRP-antistoffer og / eller TSA kit for å påvise lav overflod transkripsjoner. Derfor gir denne metoden en lineær sammenheng mellom signal intensitet og målrettede mRNA mengder for kvantitativ analyse. Det gjør behandlingen 100-200 lysbilder samtidig. Det fungerer godt for ulike utviklingsstadier av embryoer. Mest utviklingsmessige studier av genekspresjon bruke hele embryoer og ikke-radioaktive tilnærminger 8,9, delvis fordi embryonale vev er mer skjør enn voksen vev, med mindre samhold mellom celler, noe som gjør det vanskelig å se grensene mellom celle populasjoner med vevsdelene. I motsetning er vår radioaktivt tilnærming, på grunn av større utvalg av følsomhet, i stand til å oppnå høyere kontrast i oppløsning av genuttrykk mellom vev regioner, noe som gjør det lettere å se grensene mellom populasjoner. Ved hjelp av denne metoden, kan forskerne avsløremulig betydningen av en nylig identifiserte genet, og videre forutsi funksjonen av genet av interesse.
Protocol
1. Tissue Forberedelse
- Høste friske vev. For avian embryoer, forsiktig åpne egg og rengjør embryoet i et fat med 1xPBS, to ganger. For voksne hjerner, raskt fjerne hjernen og forsiktig vask med 1 x PBS.
- Integrer embryoer eller voksne hjernen til et innebygd mold full av oktober vev Tek, orientere vevet som er nødvendig for seksjonering, og raskt fryse blokken ved å plassere det inn i en etanol og tørris blanding, være forsiktig med å få blandingen innsiden av blokken .
- Skjær den frosne prøven i en cryostat inn 10-12 mikrometer tykke seksjoner. For hjernen og embryonale vev, er det beste klipping tempererte innenfor området -18 ° C til -20 ° C.
- Monter frosne seksjoner på super pluss glass lysbilder.
- Oppbevar delene i et lysbilde boks ved -80 ° C.
2. Generasjon av radioaktive Riboprobes (Bruk stråling sikkerhetsrutiner i din institusjon)
- Generer en renset lineære DNEn mal av cDNA av interesse, enten ved enzym begrenset sammendrag av en klonet fragment omgitt av RNA polymerase promoter nettsteder fra ett plasmid DNA eller PCR av innsatsen knyttet til RNA polymerase promoter bindingssteder. Det er også mulig å generere PCR fragmenter med RNA polymerase arrangører som en del av den 3 'og 5' PCR primere. Gels rense dine begrensede eller PCR generert fragmenter med GENECLEAN gel rensing kit.
- Til en 0,5 ml Eppendorf rør, tilsett 0,5 til 1 mikrogram av renset lineære DNA-malen, transkripsjon buffer, DTT, RNasin, AGC nukleotid mix løsning, og RNase fritt vann for å få volumet opp til ønsket beløp. Deretter legger S 35-UTP og riktig RNA polymerase til å gjøre enten antisens eller følelse riboprobes.
- Inkuber blandingen for en time i en 37 ° C vannbad. Legg til en annen delmengde av RNA polymerase og inkuber for en annen en hr.
- Legg 3M natriumacetat løsningen (0,1 fold av totalt volum) og 100% EtOH (2,5 FOld av totalt volum) i Eppendorf rør til å fremkalle det syntetiserte RNA riboprobe.
- Inkuber i tørris eller -80 ° C i 15 min eller mer enn 3 timer for å hjelpe nedbør.
- Pellet RNA ved sentrifugering ved 4 ° C og 15 000 rpm i en table-top Eppendorf sentrifuger i 30 min.
- Fjern supernatanten og vask pellet med 70% EtOH, banke med fingeren for å blande pellets godt.
- Pellet RNA igjen ved sentrifugering ved 4 ° C og 15 000 rpm i 30 min.
- Fjern supernatanten helt ved pipeting og deretter legge 40 mL hybridisering løsning. Bland godt med pipeting inn og ut.
- Sett en mL av løsningen i 3 ml Safety-Løs løsning i scintillation hetteglasset, bland godt, og måle teller i scintillation telleren.
- Plasser Eppendorf med riboprobe ved -20 ° C for bruk innen en uke.
3. Tissue Behandling
- I en hette, forberede frisk PBS bufret 4% paraformaldehyde løsning til ca 3-5 ° C over romtemperatur. Plasser lysbilder fra -80 ° C lagring i et metall stativ på tørris, bære å jobbe plass under panseret, og plasser deretter stativet inn i 4% paraformaldehyde løsning, og inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Vask 3 ganger i 1 x PBS om 15 dips hver (ca 1 sekund per dip).
- I panseret, gjør acetylering buffer og rist det kraftig i løpet av 10 sekunder. Umiddelbart helle i en skuff inneholder rack av lysbilder og inkuber i 10 min, for å redusere bakgrunn binding av riboprobe.
- Skyll 3 ganger i 2 x SSPE for 15 dips.
- Uttørrende på 70%, 95% og 100% EtOH seriell for 2 min på hvert trinn (trenger ikke å være i panseret).
- Tørk lysbildene under panseret i minst 10-15 min.
4. Hybridisering
- Beregn mengde riboprobe (0,5-1 x 10 6 kpm per lysbilde) og hybridisering løsning (100 mL per lysbilde) er nødvendig for alle lysbilder. Prevarme riboprobe-hybridisering mix til 65 ° C i 5 min til denature riboprobe.
- Pipetter 100 mL av riboprobe-hybridisering løsning i en linje over raset, og bruke et glass dekkglass å spre den jevnt over vev og dekkglass. Place glir horisontalt, vender oppreist inn i en metall stativ og sted rack-sakte oppreist i 65 ° C oljebad i minimum 4 timer og maksimum 16 timer. Oljen skaper en lufttett rundt Dekkglass.
- Fjern metall stativer fra oljebad og tørk av overflødig olje rundt stativet med silkepapir.
- Vask av olje fra de dekkede lysbilder og metall rack i glass eller metall skuffer inneholder kloroform, to ganger. 2. kloroform vask kan brukes som den første for neste eksperiment.
- Overfør rack med dekket lysbilder i skuffen med i 0,1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE løsning og flytte opp og ned for noen fall å løsne Dekkglass og fjerne løse overflødig hybridisering såforurensning.
- Overfør rack med dekket lysbilder i frisk løsning på 0,1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE, og deretter fjerne Dekkglass med en RNase frie tang i løsning for å hindre riper vevsdelene. Overfør udekket glir inn frisk rack i en skuff horisontal lysbilde stativ holder, i en løsning av 0,1% β-mercaptoethanol i 2 x SSPE.
- Inkuber rack med lysbilder i den friske 0,1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE løsning ved romtemperatur i 1 time for å fjerne overflødig ubundet RNA probe. Kast denne og de foregående vannholdige vask løsninger, samt Dekkglass, som radioaktivt avfall.
- Overfør stativet med lysbilder til en prewarmed 2x SSPE løsning ved 65 ° C, legg β-mercaptoethanol til en endelig på 0,1% konsentrasjon, og inkuber ved 65 ° C i 1 time. Kast som radioaktivt avfall.
- Overfør og inkuber kurven med lysbilder to ganger i prewarmed 0,1 x SPPE ved 65 ° C i 30 min hver. Mengden av radioaktivitet fjerneti dette trinnet er svært liten og ikke lenger ansett for mye radioaktivt avfall etter dette trinnet.
- Tørke stativet og lysbilder i 70%, 95% og 100% EtOH i 2 min hver.
- Tørk lysbildene i hetten for minst 30 min.
5. Visualisering av radioaktivt Signal
- Plasser tørre lysbilder i en film kassett og i et mørkt rom, plasser X-ray film (Kodak BioMax MR film) over lysbildene, og lukk kassetten. Kontroller at lysbildene vender emulsjonen siden av x-ray film. Avdekke lysbilder for ~~~HEAD=NNS 1-7 dager avhengig av forventet overflod av transkripsjoner.
- Utvikle x-ray film i standard utvikler og fixer. Den hybridisering signal viser seg som svart (utsatt sølv korn i emulsjon) på filmen (Fig. 1).
- (Valgfritt) Hvis du vil finne mobilnettet oppløsning og se signal på vev, lysbildene må dyppes i fotografisk emulsjon og counterstained. Hvis du skal til slutt counterstain med cresyl fiolett, så delipidize deler av inkubasjon i xylen etter 5 min ved romtemperatur to ganger, rehydrate 1 min hver i 100%, 100%, 95%, 95%, 70%, og 50% EtOH og deretter i avionisert vann. Hvis du ikke kommer til å farge med et fargestoff som ikke krever delipidization, da delipidization er ikke nødvendig. Tørre lysbilder godt under en hette i minst 2-3 timer.
- I det mørke rommet med en safe lys, øse ut nok Kodak NTB emulsjon å dekke halve raset langs (dvs. vev) i glass dipping container, og deretter smelte i en 42 ° C vannbad i 20-30 min. Deretter fortynne det med destillert vann til 1:1-forhold. Nivået på emulsjonen skal nå dekke alle seksjonene på et lysbilde når lysbildet dyppet i det. Hvis du har mye av lysbilder, må du kanskje forberede ekstra emulsjon.
- Dyppglass inn i fortynnede emulsjonen i 42 ° C vannbad og tørre dyppet lysbilder i en lukket lys tett beholder overnight i det mørke rommet, eller i en ovn ved 37 ° C i 2-3 timer, med lysene av.
- Overfør lysbildene i stativer spor i svarte bokser inneholder Desiccators, er forsiktig for lysbildene ikke berører hverandre og dermed skape gjenstander. Forsegle kantene på boksene med svart isolasjonstape sakte for å unngå statisk-indusert lys gnister og deretter vikle boksene i aluminiumsfolie. Oppbevar boksene ved 4 ° C fra flere dager til uker (signal fra en dag på x-ray film er lik 5 dager etter emulsjon).
- Varm lysbildet boksene til romtemperatur i 1 time.
- I mørkerommet, fjerne risten med lysbilder (eller stedet lysbilder i en metall stativ hvis du bruker bokser med sklie spor) fra boksene og utvikle dem i Kodak D-19 utvikleren ved 16 ° C for 3,5 min.
- Vask de utviklede lysbildene i springvannet ved romtemperatur i 1 min.
- Inkuber lysbildene to ganger i fixer ved 19 ° C i 6 min hver. Lys kan slås på i løpet av andre fixer inkubering. Vask lysbildene i rennende vann ved romtemperatur i minst 30 min og skrape emulsjonen fra baksiden av lysbildet mens «våt» med et barberblad for å unngå riper i glasset.
- Flekk vev med 0,3% cresyl fiolett i vann fra springen i 5 min.
- Vask ekstra cresyl fiolett løsning i friskt vann fra springen til ~ 15 dips.
- Dehydrere lysbildene for ~ 15 dukkerter i hver alkohol løsning: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% og 100% EtOH.
- Inkuber lysbildene i xylen etter 5 min ved romtemperatur to ganger.
- Dekkglass med Permount medium på lysbildet og tørke dekket lysbildet i hetten over natten (> 16 t), det vil ta flere dager før limet er solid nok til å rengjøre lysbildene videre.
6. Generere Darkfield fargebilder
- Om nødvendig, ytterligere ren overflødig emulsjon på baksiden av lysbildene (non-coversliped side uten vev) ved fukte den med vann og skrape med barberblad.
- Skyll lysbilder med 80% EtOH løsning og tørk 1-2 ganger forsiktig for å bli kvitt rusk og støv.
- Ta bilder under mørkefelt eller lysfelt belysning. Trinn 6.2 og 6.3 kan måtte gjentas 2-3 ganger for å få et godt bilde uten støvpartikler, som er lett synlige i mørkefelt under et dissekere mikroskop.
7. Representative Resultater
Det er to hovedmåter å se in situ hybridisering resultater på vevsdelene hybridisert med S 35 radioaktive prober: 1) x-ray film som ble plassert over lysbilder eller 2) emulsjon som ble belagt på lysbildene. En tredje tilnærming er å bruke en phosphorimager skjerm plassert over lysbildene, men vi har ikke vært fornøyd med løsningen av denne tilnærmingen. X-ray filmer gi en rask resultat og analyser av den generelle tilstanden på hybridisering. Den x-ray film data avslører også bred anatomisk oppløsning og kan benyttes for kvantitativ analysis 10. Eksempler på x-ray film bilder av sene avian embryo hoder hybridisert med antisens prober for FoxP1 og CoupTF2 genuttrykk er i figur 1A og B. Er begge genene svært rik på konkrete hjernen underavdelinger. En god kvalitet x-ray film Resultatet bør være skarp (ikke uskarpt) og har høyt signal-til-bakgrunn ratio. Et uskarpt bilde kan være på grunn av ujevn kontakt mellom en x-ray film og glass-slide med hybridisert vev.
For emulsjon dyppet lysbilder, inneholder emulsjon lysfølsomme sølv salter belagt på vev som apposed å være på plast på x-ray film. Under utvikling, S 35-eksponerte sølv salter blir konvertert til metallisk sølv korn, mye som i X-ray film. Men sølv forekomstene er direkte synlige over cellene representerer genuttrykk som kan observeres og måles kvalitativt under et mikroskop. De metalliske sølv korn blokkere direkte lys Gjennom vårth og fremstå som de sorte prikkene i henhold lysfelt utsikt. Den cresyl fiolett counterstain vises lilla i farge (Fig. 3A, 3C, og fig. 4). I Darkfield, sølv korn reflekterer lyset som kommer fra siden og fremstår som hvite prikker (Fig. 1C, 1D, 3B og 3D). I denne situasjonen synes det cresyl fiolett farge rød i farge. I lysfelt er hybridisering signal lettere å se under høy forstørrelse på cellenivå oppløsning, mens i mørkefelt, i tillegg kan den hybridisering signalet sees ved lavere forstørrelse over hele vev. Den Darkfield syn er den tilnærmingen vi vanligvis bruker til å vise det samlede genuttrykk mønster. Men i forhold til raske resultater hentet fra x-ray filmer, tar emulsjonen dyppet lysbildene lengre tid (en til flere uker) og er mer følsom for innhenting bakgrunn.
Det er fire vanlige kilder til sterk bakgrunn: 1) Bakgrunn hele x-ray film er gjøre vanligvis to problemer med utbygger eller fixer, eller delvis eksponert film, 2) Bakgrunn på glassplater som vanligvis skyldes problemer med vask eller glass lysbilde forberedelse, slik som utilbørlig silination av lysbildene fra den kommersielle kilden eller selvstendig bearbeidd; 3) Emulsjon eksponering og utvikling bakgrunn, og 4) Bakgrunn på strekningen enten skyldes manglende forsiktige post-hybridisering vasker trappen, for lavt av en hybridisering temperatur, dårlig kvalitet på hybridisering løsningen, paraformaldehyde forurensning i oppvasken forårsaker sonder til permanent kryss- kobling til vevet, riboprobe degradering som fører til små molekyler merking vevet ikke-spesifikt, inaktive DTT eller β-mercaptoethanol resulterer i kryss linking av S 35-RNA prober i di-sulfide obligasjoner til vevet, og venter for lenge på acetylering. Det er avgjørende å ha lysbildene i acetylering løsningen løpet av sekunder for å blande eddiksyre og trietanolamin. Hvis flere minutter passere medut å legge løsningen på lysbildene, så acetyl grupper ikke vil være effektivt fjernet og deretter binder seg til RNA ikke-spesifikt. Andre faktorer er hybridisering over 20 hr, noe som kan generere altfor sterkt av et signal, og overflødig oljedråper på lysbildene, som binder hybridisering løsning på lysbildene under vandige vask, noe som resulterer i radioaktive flekker på vev og glir gi mørk bakgrunn signaler. Ved arbeid med mange lysbilder (mer enn 100 stykker), legge til en 3. kloroform vaske eller endre kloroform vask, for å hindre overflødig olje partikler fra gjenværende på lysbildene. Uforsiktig vev behandling, dvs. ikke fryser raskt nok (innenfor 5-10 min etter disseksjon) eller tining og re-frysing øker også bakgrunnen på grunn av mRNA degradering. Vær forsiktig så du ikke forveksle bakgrunn for over eksponeringen.
For emulsjon bakgrunn på de dyppet lysbildene er mulig fordi det er svært lysfølsomt, og krever lang eksponering i mørket. C ommon bakgrunnen problemer med for høy av temperatur for utbygger og fixer. Når temperaturen er høyere enn 19 ° C, nær eller varmere enn romtemperatur, blir mer sølv korn bakgrunn innhentet. Eksponering for lave nivåer av lys lekker inn i et mørkerom vil føre emulsjon bakgrunn. Ikke vaske ut fixer lenge nok (minst 30 min i rennende vann), vil la fixer som så reagerer med cresyl fiolett å generere en brunlig bunnfall hele emulsjon. Men hvis lysbildene er vasket i vann lengre enn 90 min etter fiksering før cresyl fiolett farging, kan dette føre til at emulsjonen å løsne og avsnittene å farge dårlig. Hvis det ikke er nok tid å farge lysbilder i en 30-90 min vindu etter fiksering og vasking etter 30 min vask, tørk lysbildene natten og fortsetter med cresyl fiolett farging neste dag. Vanligvis fleste mRNAs har spesifikke genuttrykk mønstre, mens bakgrunn signal er mer ensartet.
ove_content "> Brettet vev kan være villedende for genuttrykk resultater på x-ray film, fører til en region med mørkere signal. å finne ut om vev er foldet, undersøke ikke-fargete snitt henhold mørkefelt eller cresyl fiolette fargete snitt henhold lysfelt. Cresyl fiolett kontrafarging gir en bedre måte å undersøke vev tilstand.For en bedre tolkning av sonde spesifisitet, bør kontroll fornuft prober brukes på flere tilstøtende seksjoner. Mest fornuftig prober ikke viser et signal, men noen gjør, og når de gjør det, finner vi at det ofte er annerledes enn antisens signal. Vi tror at dette kan være relatert til antisens syntese eller annet gen på antisens strand av genomet. Vi presenterer et eksempel Pax6 fornuft og antisens prober (Fig. 2A og B). Den antisens tråd avslører merking langs ventrikulære sone av forebrain, lillehjernen og øyet som forventet (fig. 2A), men den forstand avslørermerking i pigmentet lag netthinnen (Fig. 2B).
For probe størrelser, bruker vi cDNA prober hvor som helst i området 300-5000 bps. Sonder mindre enn 300 bps arbeid, men signalene er vanligvis svakere. Vi har ikke prøvd sonder større enn 5000 bps. Det er best å bruke sonder på vev fra samme art hvis mulig. Hvis ikke, vi krysser-hybridize sonder på seksjoner av andre arter og redusere hybridisering og vaske temperaturer i 3-5 ° C intervaller basert på sekvens identitet, hvis kjent. Hvis ikke kjent, da vi utfører prøving og feiling hybridisering og vaske temperaturer. Hvis temperaturen senkes for mye, kan cDNA probe kryss-hybridize med andre mRNAs av lignende sekvenser på tvers av arter eller i samme art 11. I praksis finner vi at cDNAs som er ~ 95% identisk eller mer til mRNA målet i vevet, den strenge hybridisering og vasketemperatur (65 ° C) forholdene fungerer godt. For sekvenser som er i ranges av ~ 85 til 94% identisk, den hybridisering og vasketemperatur må kanskje reduseres i størrelsesorden ~ 50 til 60 ° C.
Bakgrunnen for å benytte et metall stativ i de fleste av trinnene er bruken av kloroform vasker og xylen. Begge organiske smelte mange typer plast. Glass og noen typer plast er resistente mot disse organiske. Men glass er enklere å bryte, og noen plast som ved første er resistente vil smelte over lang-perioder for eksponering for organiske.
Figur 1. Autoradiografi av in-situ hybridisering bilder fra x-ray filmer og emulsjoner dyppet sklier. (AB) X-ray film bilder av sagittal hele hodet deler av sebra Finch Songbird på embryonale dag 10, hybridisert med antisens riboprobes til (A) FoxP1 eller (B) CoupTF2, tatt med lysfelt belysning under et dissekere mikroskop. Svart, eksponerte korn i filmen viser mRNA expression. Scale bar = 500 mikrometer. (CD) emulsjon dyppet lysbildene av sagittal hele hodet deler av sebra Finch på post luke dag 6, hybridisert med antisens riboprobes til (C) FoxP1 og (D) CoupTF2, tatt med mørkefelt belysning under et disseksjon mikroskop. Hvit, eksponert sølv korn i emulsjon ovenfor vev viser mRNA uttrykk. Rød, cresyl fiolett farge. Scale bar = 200 mikrometer. For all bilde, er det nebbet rostral til venstre. De x-ray film bildene ble utsatt for en dag, dyppet lysbilder i 3 dager. Den FoxP1 probe er 178 bps til 1544-1711 BP delen av mRNA, CoupTF2 er 545 bps til 1-545 bp delen av mRNA. Som kan sees innenfor forebrain FoxP1 mRNA er beriket i mesopallium (M), striatum (St) og dorsal thalamus (DT), mens CoupTF2 er beriket i nidopallium (N), arcopallium (A), og mer ventral thalamus . Det er konsistens i uttrykk mellom eksponering typer (og aldre). Med de dyppet lysbilder, er imidlertid en høyere oppløsning merking sett,og vev grenser og avdelinger er direkte identifisert. Disse og alle andre bilder som vises i papiret er fra seksjoner ved hjelp av standard 65 ° C høy stringens hybridisering.
Figur 2. Sammenligning av antisens og forstand merking som viser ulike mønstre. (A) antisens tråd Pax6 ble uttrykt i hjernen, spesielt ventrikulære sone (hvit pil). Vist er autoradiografi på x-ray filmer av sagittal hele hodet skiver hentet fra sebra Finch på embryonale dag 12. (B) Like delen hybridisert med sans strand av Pax6 avslører ingen bakgrunn uttrykk gjennom hele embryoet hodet, men tilsynelatende uttrykk i pigmentet lag netthinnen (svarte piler) som antisens strand. Den stiplede linjen viser omrisset av hele hjernen. C: lillehjernen.
< strong> Figur 3. I situ signaler av genuttrykk i emulsjonen dyppet lysbilder hentet fra sebra Finch hjernen under sene embryonale stadier etter lysfelt og mørkefelt utsikt. (A) lysfelt bilde av D1B uttrykk på embryonale dag 10 fra en normal eksponering til emulsjon. Etiketten (svart) kan knapt sees på denne forstørrelse. Probe er 625 bps til 1-625 bp delen av mRNA. (B) Identisk seksjon og forstørrelse som i (A), men byttet til mørkefelt visningen viser etiketten (hvit) i striatum (St) og thalamus (TH). (C) lysfelt bilde av Slit3 uttrykk på embryonale dag 12 fra en over eksponering til emulsjon. Etikett (svart) kan lett bli sett. Probe er 779 bps til 1243-2021 delen av mRNA. (B) Identisk seksjon og forstørrelse som i (A) byttet til mørkefelt visning som viser etiketten (hvit) i ryggmargen (SC) som matcher lysfelt bildet. Rostral er orientert mot venstre. CB: lillehjernen.
ad/3764/3764fig4.jpg "alt =" Figur 4 "/>
Figur 4. Silver korn oppløsning på cellenivå. Vist er FoxP1 mRNA etiketten i Zebra Finch forebrain med sølv korn (svarte prikker) over cellene (cresyl fiolett) i ulike områder av hjernen og aldre sammenlignet med lavere strøm bilder av Figur 1A og 1C. (A) Høy overflod uttrykk over individuelle celler (svarte piler) i den voksne Zebra Finch mesopallium. (B) Lav overflod uttrykk over individuelle celler (svarte pilspisser) i den tilstøtende nidopallium av samme seksjon. (C) Høy FoxP1 mRNA uttrykk enn celler (svarte piler) i embryonale dag 12 mesopallium. (D) Lav overflod uttrykk enn celler (svarte pilspisser) i den tilstøtende nidopallium av samme seksjon. Eksempel celler er sirklet med en gul linje. Embryonale celler (C og D) er mindre og mer tettpakket sammenlignet med de voksne celler (A og B). Det siden det er litt plass mellom cellene og emulsjon området utsattsølv korn fra S 35 sonden er litt stor enn det området av cellen organer. Scale bar = 10 mikrometer.
Discussion
Radioaktiv in situ hybridisering av mRNA uttrykk er mye brukt til flere formål, blant annet for å studere regional vev organisasjon, celletyper, og hjernen funksjonell aktivitet 2-5,10,12-14. Den senere bruken er på gener som mRNA uttrykk i hjernen er avhengig av økt nevral aktivitet, ofte kalt aktivitets-avhengige gener eller umiddelbare tidlige gener. Med disse bruksområdene, har vår metode er brukt på tvers av flere arter, blant annet i fugler, pattedyr (f.eks menneske), fisk og amfibier, og i flere vev, inkludert hjernen, huden, og muskel, og flere aldre, inkludert hatchlings / nyfødte, ungdyr , voksne, og her i hele embryo deler 2,3,5,15-17. De spesielle funksjonene i protokollen vår er: (1) Det gir en balanse mellom anatomisk spesifisitet og kvantitativ spesifisitet. For å kvantifisere genuttrykket på x-ray film, tar vi digitale bilder av bildene (ex:. Fig. 1A og 1B), bruker Photoshop (Adobe) histogram funksjon å måle pikseltetthet i regionene interesse og subtrahere bakgrunnsnivåene på film utsiden av vev, men fortsatt på glass-slide 2,4. For å kvantifisere uttrykk på cellenivå, tar vi bilder av sølv korn enn celler under høy forstørrelse (40-100X, Fig 4). Deretter bruker vi terskelen og måle funksjoner av Image J ved Wayne Rasband på NIH å telle antall sølv korn i bildet, trekker ut bakgrunnen telle i en lignende område uten celler på glass-slide, dividere med antall celler, å oppnå en verdi av uttrykk per celle. 4,18 (2) Det kan være relativt høy gjennomstrømning, slik at behandling av 100-200 lysbilder samtidig, på grunn av den stramme dekkglass forseglingen skapt av mineralolje bad. Standard in-situ hybridisering metodene tar lengre tid å forsegle lysbilder med Parafilm, neglelakk, og andre virkemidler, hvor lysbilder tar opp mye plass, (3) Det er sværtfølsom for lav overflod avskrift grunn dekstransulfat og Denhardt løsning i hybridiseringen buffer 2,13, (4) imaging tilnærming i mørkefelt gir bilder med høy kontrast grunn til å ta bilder under mørkefelt belysning på en dissekere mikroskop 4,5. I tillegg gir det sensitiv deteksjon av små endringer i genuttrykket, for eksempel i aktivitet-avhengige genuttrykk å identifisere spesifikke områder av hjernen aktiveres under persepsjon og produksjon av spesifikke atferd 19. Begrensningene i forhold til ikke-radioaktive protokoller er at sistnevnte er klarere i den cellulære oppløsning og plassering av mRNA i cellen, og arbeider med emulsjon er svært følsom for manipulasjon og lys. Det er mulig å kombinere vår metode med andre metoder, for eksempel ikke-radioaktive i situ hybridisering til å merke mRNA uttrykk for mer enn ett gen i samme vev 10,17,20. Det kan kombineres med immunocytochemistryå merke både RNA og protein uttrykk på samme prøve for å co-lokalisere mRNA med visse celletyper 10. Protokollinnstillingene modifikasjoner som er nødvendige for slike doble merking eksperimenter er beskrevet i de siterte referanser.
I sammendraget, forenkler vår tilnærming forståelse av timing og cellulær lokalisering av genuttrykk for å forstå regionen organisasjon, vev funksjonell aktivitet, og gen-funksjon.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke alle Jarvis lab medlemmer som forbedret protokollen gjennom årene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Cryostat | Thermo scientific | Microm HM550 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
| DTT | Promega | P1171 | 100mM |
| EDTA | Sigma | ED | |
| Embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Fisher brand Superfrost plus slide | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | |
| Formamide | Sigma | F7508 | |
| GENECLEAN kit | Q-Bio gene | 1001-200 | |
| Kodak BioMax MR film | Sigma | Z350370 | |
| Kodak NTB Emulsion | Carestream Health | 8895666 | |
| Kodak Professional developer D19 | Kodak | 1462593 | |
| Kodak professional Fixer | Kodak | 1971746 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | |
| NaOH | VWR | SX0600-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | |
| rATP | Promega | P1132 | 10mM |
| rCTP | Promega | P1142 | 10mM |
| rGTP | Promega | P1152 | 10mM |
| RNasin | Promega | N2111 | 40Units/μl |
| S35 UTP | PerkinElmer | NEG039C001MC | |
| Safety-Solve solution | Safety Solve Research Products International | 111177 | |
| Sodium Acetate | Sigma | S7899 | 3M |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| SP6 RNA polymerase | Promega | P1085 | |
| Staining metal rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2075 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 5x Transcription buffer | Promega | P1181 | |
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | VWR | 101449-446 | |
| tRNA | Roche | 10109509001 | |
Solutions: |
|||
|
|||
References
- Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
- Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
- Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
- Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
- Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
- Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
- Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
- Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
- Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
- Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
- Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363 (2005).
- Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
- Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
- Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768 (2008).
- Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).
