Summary
Este protocolo se utiliza con éxito para detectar cuantitativamente los niveles y los patrones espaciales de la expresión del ARNm de múltiples tipos de tejidos a través de las especies de vertebrados. El método puede detectar transcripciones baja abundancia y permite el tratamiento de cientos de diapositivas simultáneamente. Se presenta el protocolo de uso de perfiles de expresión de la formación del cerebro del embrión aviar como ejemplo.
Abstract
Conociendo el tiempo, nivel, localización celular, y el tipo de células que un gen se expresa en contribuye a la comprensión de la función del gen. Cada una de estas características se puede lograr con la hibridación in situ a ARNm en las células. Aquí les presentamos una radiactivo en el método de hibridación in situ modificado a partir de Clayton et al. (1988) 1, que ha estado trabajando con éxito en nuestro laboratorio desde hace muchos años, especialmente para los adultos cerebro de un vertebrado 2-5. Los largos ARN complementario (cRNA) sondas a la secuencia diana permite la detección de las transcripciones de baja abundancia 6,7. La incorporación de nucleótidos radiactivos en las sondas cRNA permite la sensibilidad de detección adicional de las transcripciones de baja abundancia y análisis cuantitativos, ya sea por la luz sensible película de rayos X o emulsión revestido sobre el tejido. Estos métodos de detección de proporcionar un registro a largo plazo de un gen determinado. En comparación con los no radiactivo de la sonda de metanfetaminamétodos, como DIG-etiquetado, el método de sonda de hibridación radiactiva no requiere de varios pasos de amplificación utilizando HRP-anticuerpos y / o kit de la TSA para detectar la transcripción de baja abundancia. Por lo tanto, este método proporciona una relación lineal entre la intensidad de señal y las cantidades específicas de mRNA para el análisis cuantitativo. Se permite el tratamiento 100-200 diapositivas simultáneamente. Funciona bien para diferentes etapas de desarrollo de los embriones. Mayoría de los estudios de desarrollo de la expresión génica utilizar embriones enteros y los enfoques no radiactivos 8,9, en parte porque el tejido embrionario es más frágil que el tejido adulto, con una menor cohesión entre las células, lo que hace difícil ver los límites entre las poblaciones de células con las secciones de tejido. En contraste, el enfoque radiactivos, debido a la mayor gama de sensibilidad, es capaz de obtener un mayor contraste en la resolución de la expresión génica entre las regiones de tejido, por lo que es más fácil de ver los límites entre las poblaciones. El uso de este método, los investigadores podrían revelar laposible significado de un gen recién identificado, y además predecir la función del gen de interés.
Protocol
1. Preparación de tejidos
- Obtención de los tejidos frescos. Para los embriones de aves, abra con cuidado los huevos y limpiar el embrión en un plato con 1XPBS, dos veces. Para los cerebros adultos, eliminar rápidamente el cerebro y lavar suavemente con 1 x PBS.
- Insertar los embriones o el cerebro adulto en un molde incorporado llena de octubre Tissue Tek, orientando el tejido según sea necesario para el corte, y rápidamente se congela el bloque mediante la colocación en una mezcla de etanol y hielo seco, teniendo cuidado de no conseguir la mezcla en el interior del bloque .
- Cortar la muestra congelada en un criostato en secciones gruesas 10-12 micras. Para el tejido cerebral y embrionario, la mejor templado de corte está dentro del intervalo de -18 ° C a -20 ° C.
- Montar las secciones congeladas de las diapositivas de Super Plus de vidrio.
- Almacene las secciones en una caja de portaobjetos a -80 ° C.
2. Generación de ribosondas radiactivos (Utilice los procedimientos de seguridad radiológica de su institución)
- Generar un DN lineal purificadaUna plantilla de su cDNA de interés, ya sea por la enzima restringida compendio de un fragmento clonado rodeado por sitios de ARN polimerasa del promotor de un plásmido de ADN o por PCR del inserto adjunto a los sitios de unión del promotor RNA polimerasa. También es posible generar fragmentos de PCR con los promotores de ARN polimerasa, como parte de la 3 'y 5' cebadores de PCR. Geles purificar sus fragmentos generados restringidas o PCR con el kit de purificación de gel de GENECLEAN.
- Para un tubo Eppendorf de 0,5 ml, añadir 0.5-1 mg de plantilla purificó ADN lineal, tampón de transcripción, la TDT, RNasin, solución AGC mezcla de nucleótidos, y el agua libre de RNasa para llevar el volumen hasta la cantidad deseada. A continuación, agregue S 35-UTP y la ARN polimerasa adecuada para hacer bien riboprobes antisentido o sentido.
- Incubar la mezcla durante 1 hora en un baño de agua a 37 ° C. Añadir otra parte alícuota de la ARN polimerasa y se incuba durante otra hora 1.
- Añadir sodio 3M solución de acetato (0,1 veces del volumen total) y 100% de EtOH (2,5 FOld de volumen total) en el tubo de Eppendorf para precipitar el ARN sintetizado ribosonda.
- Incubar en hielo seco o -80 ° C durante 15 minutos o las horas de más de 3 para ayudar a la precipitación.
- ARN precipitado por centrifugación a 4 ° C y 15.000 rpm en una centrífuga de mesa Eppendorf durante 30 minutos.
- Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con EtOH al 70%, toque con el dedo para mezclar la pastilla también.
- ARN precipitado de nuevo por centrifugación a 4 ° C y 15000 rpm durante 30 min.
- Eliminar el sobrenadante por completo pipetear y luego añadir 40 l solución de hibridación. Mezclar bien por dentro y fuera pipetear.
- Ponga 1 ml de la solución en 3 ml de Seguridad-Solve solución en el vial de centelleo, mezclar bien y medir las cuentas en el contador de centelleo.
- Coloque el Eppendorf con la ribosonda a -20 ° C para su uso dentro de una semana.
3. El tratamiento de tejidos
- En una campana, preparar PBS fresco tamponado al 4% paraformaldehyde solución a aproximadamente 3-5 ° C por encima de la temperatura ambiente. Colocar los portaobjetos de almacenamiento de -80 ° C en una rejilla de metal en hielo seco, llevar al espacio de trabajo bajo el capó, y luego colocar la rejilla en la solución de paraformaldehído al 4%, y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces en 1 x PBS sobre 15 inmersiones cada uno (alrededor de 1 segundo por inmersión).
- En la capilla, que buffer de acetilación y agitar enérgicamente durante 10 segundos. Inmediatamente se vierte en una bandeja que contiene el bastidor de diapositivas y se incuba durante 10 minutos, para reducir la unión de fondo de ribosonda.
- Enjuagar 3 veces en 2 x SSPE durante 15 inmersiones.
- Deshidratar en 70%, 95% y 100% de serie EtOH durante 2 min en cada paso (no tiene que estar en la campana).
- Secar los portaobjetos debajo del capó por lo menos 10-15 minutos.
4. Hibridación
- Calcular la cantidad de ribosonda (0,5-1x10 6 cpm por diapositiva) y la solución de hibridación (100 l por diapositiva) necesarios para todas las diapositivas. Prewarm la mezcla ribosonda-hibridación a 65 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar la ribosonda.
- Pipetear 100 l de solución de hibridación ribosonda en una línea a través de la diapositiva, y utilizar un cubreobjetos de vidrio de difundirla de manera uniforme sobre el tejido y el cubreobjetos. Colocar desliza horizontalmente, colocado verticalmente en un bastidor de metal y la cremallera lugar lentamente en posición vertical en el 65 ° baño de aceite C durante un mínimo de 4 horas y un máximo de 16 horas. El aceite crea un sello hermético en torno a los cubreobjetos.
- Retire bastidores de metal del baño de aceite y limpie el exceso de grasa alrededor de rack con un pañuelo de papel.
- Lavar el aceite de las diapositivas y las cubiertas del bastidor de metal en las bandejas de vidrio o de metal que contienen cloroformo, dos veces. La 2 ª cloroformo lavado puede utilizarse como la primera para el siguiente experimento.
- Transferir el bastidor con toboganes cubiertos en una bandeja con en el 0,1% β-mercaptoetanol + 2 x solución de SSPE y se mueven arriba y abajo durante unos pocos huecos para aflojar y retirar los cubreobjetos disolver el exceso de solución de hibridaciónción.
- Transferir el rack con diapositivas incluidas en una solución fresca de 0,1% β-mercaptoetanol + 2 x SSPE, y luego retire los cubreobjetos con una pinza RNasa libre en la solución para evitar rayar las secciones de tejido. Transferir los portaobjetos descubiertas en estante fresco en una bandeja horizontal titular rejilla deslizante, en una solución de 0,1% β-mercaptoetanol en 2 x SSPE.
- Incubar el bastidor con las diapositivas de la fresca 0,1% β-mercaptoetanol + 2 x SSPE solución a temperatura ambiente durante 1 hora para eliminar el exceso no unido sonda de ARN. Desechar esta y las soluciones acuosas de lavado anteriores, así como cubreobjetos, como los residuos radiactivos.
- Transferir el bastidor con diapositivas a una solución precalentada 2x SSPE a 65 ° C, añadir β-mercaptoetanol a un final de 0,1% de concentración, y se incuba a 65 ° C durante 1 h. Desechar como residuo radiactivo.
- Transfiera e incubar el bastidor con las diapositivas dos veces en 0,1 x SPPE precalentado a 65 ° C durante 30 minutos cada uno. La cantidad de radiactividad eliminado eneste paso es muy pequeño y no se consideran residuos radiactivos excesiva después de este paso.
- Deshidratar el bastidor y se desliza en el 70%, 95% y 100% de EtOH durante 2 minutos cada uno.
- Seque las diapositivas de la campana por lo menos durante 30 minutos.
5. La visualización de la señal radiactivos
- Coloque las diapositivas en seco en un cartucho de la película y en una habitación oscura, poner la película de rayos X (Kodak Biomax MR película) sobre las diapositivas, y cerrar la bandeja. Asegúrese de que las diapositivas se enfrentan a la cara de la emulsión de la película de rayos x. Exponer las diapositivas de ~ 1-7 días, dependiendo de la abundancia esperada de las transcripciones.
- Desarrollar la película de rayos X en el estándar del revelador y fijador. La señal de hibridación se muestra como negro (expuestos granos de plata en la emulsión) en la película (fig. 1).
- (Opcional) Para determinar la resolución celular y ver la señal en el tejido, las diapositivas deben ser sumergidas en emulsión fotográfica y counterstained.Si se va a contratinción eventualmente con violeta de cresilo, entonces delipidize secciones incubando en xileno durante 5 min a temperatura ambiente dos veces, rehidratar 1 min cada uno en 100%, 100%, 95%, 95%, 70%, y 50% de EtOH y luego en agua desionizada. Si no se va a manchar con un tinte que no requiere deslipidización, entonces deslipidización no es necesario. Portaobjetos secos y bajo una campana de por lo menos 2-3 horas.
- En el cuarto oscuro con una luz fuerte, saca lo suficiente Kodak NTB emulsión para cubrir la mitad de la corredera longitudinal (es decir, el tejido) en envase de vidrio por inmersión, y luego se funden en un baño de agua 42 ° C durante 20-30 min. Luego se diluye con agua destilada a una relación de 1:1. El nivel de la emulsión ahora debe cubrir todas las secciones sobre un portaobjetos cuando la corredera se sumerge en ella. Si usted tiene un montón de diapositivas, puede ser necesario para preparar la emulsión extra.
- Dip se desliza en la emulsión diluida en la 42 ° C baño de agua y secar los portas de cruce en un recipiente hermético cerrado la luz OvernigHT en el cuarto oscuro o en un horno a 37 ° C durante 2-3 horas, con las luces apagadas.
- Transferencia de las diapositivas en las ranuras de bastidores en cajas negras, que contienen desecadores, teniendo cuidado de las diapositivas no se toquen entre sí y por lo tanto crear artefactos. Selle los bordes de las cajas con cinta aislante color negro poco a poco para evitar la electricidad estática inducida por las chispas de luz y luego envolver las cajas en papel de aluminio. Guarde las cajas a 4 ° C desde varios días a la semana (la señal de un día de película de rayos X es similar al de 5 días en emulsión).
- Caliente las cajas de diapositivas a temperatura ambiente durante 1 h.
- En el cuarto oscuro, retirar la parrilla con diapositivas (o coloque los portaobjetos en una rejilla de metal, si el uso de cajas con ranuras de diapositivas) de las cajas y las desarrollan en la Kodak D-19 a los 16 ° C durante 3,5 minutos.
- Lavar las diapositivas desarrollados en el agua del grifo a temperatura ambiente durante 1 min.
- Incubar los portaobjetos dos veces en el fijador a 19 ° C durante 6 minutos cada uno. Las luces se pueden encender durante la incubación fijador de segundo. Lavar los portaobjetos en agua corriente a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y raspe la emulsión de la parte trasera de la corredera, mientras que en "húmedo" con una hoja de afeitar para evitar que se raye el cristal.
- Mancha de tejido con 0,3% violeta de cresilo en agua del grifo durante 5 min.
- La solución de lavado extra de cresil violeta en el agua fresca del grifo durante aproximadamente 15 inmersiones.
- Deshidratar las diapositivas de ~ 15 caídas en cada solución de alcohol: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% y 100% de etanol.
- Incubar los portaobjetos en xileno durante 5 min a temperatura ambiente dos veces.
- Cubreobjetos con un medio de Permount en la diapositiva y diapositiva secar la cubierta de la capilla durante la noche (> 16 horas), que tomará varios días antes de que el pegamento es lo suficientemente resistente como para limpiar las diapositivas más.
6. La generación de imágenes de campo oscuro de color
- Si es necesario, además emulsión limpia exceso en la parte posterior de las diapositivas (no coversliped lado sin tejido) mojando con agua y raspando con una cuchilla de afeitar. <li> Lavar los portaobjetos con una solución de EtOH 80% y limpie suavemente 1-2 veces para deshacerse de los escombros y el polvo.
- Tome fotos en campo oscuro o iluminación de campo claro. Pasos 6,2 y 6,3 puede tener que repetirse 2-3 veces a fin de obtener unas buenas imágenes sin partículas de polvo, que se ve fácilmente en campo oscuro bajo un microscopio de disección.
7. Los resultados representativos
Existen dos maneras principales de ver en los resultados de hibridación in situ en secciones de tejidos hibridados con sondas radiactivas S 35: 1) la película de rayos X que se coloca sobre las diapositivas o 2) emulsión que se aplicó en las diapositivas. Un tercer enfoque se utiliza una pantalla PhosphorImager coloca sobre las diapositivas, pero no hemos quedado satisfechos con la resolución de este enfoque. Películas de rayos X proporciona un resultado rápido y el análisis de la situación general de la hibridación. La película de datos de rayos X revela también la resolución anatómica amplia y puede ser utilizado para Analys cuantitativoses 10. Ejemplos de imágenes de la película de rayos X de finales de cabezas de embriones aviares hibridaron con sondas antisentido para la expresión génica y FOXP1 CoupTF2 están en las figuras 1A y B. Ambos genes son muy abundantes en las subdivisiones específicas del cerebro. Una buena calidad de rayos X resultado de la película debe ser agudo (no borrosa) y tienen una alta relación señal-a-fondo de relación. Una imagen borrosa puede ser debido al contacto desigual entre una película de rayos X y el portaobjetos de vidrio con el tejido hibridada.
Para las diapositivas emulsión de cruce, la emulsión contiene sales de plata sensibles a la luz recubierta por el tejido como adosados a estar en el plástico de la película de rayos x. Durante el desarrollo, el S 35 expuestos sales de plata se convierten en granos de plata metálica, al igual que en la película de rayos x. Sin embargo, los depósitos de plata son visibles directamente sobre las células que representan la expresión de genes que se pueden observar y medir cualitativamente bajo un microscopio. Los granos de plata metálica bloquear la luz directa a través dey aparecen como los puntos negros en vista de campo claro. La contratinción violeta de cresilo aparece de color púrpura (fig. 3A, 3C y 4 fig.). En campo oscuro, los granos de plata reflejar la luz que viene desde el lado y aparecen como los puntos blancos (Fig. 1C, 1D, 3B y 3D). En esta situación, el violeta de cresilo mancha aparece de color rojo. En claro, la señal de hibridación es más fácil de ver con gran aumento en la resolución celular, mientras que en campo oscuro, además, la señal de hibridación puede ser vista bajo menor aumento sobre todo el tejido. El punto de vista de campo oscuro es el enfoque que comúnmente usamos para mostrar el patrón de expresión génica global. Sin embargo, en relación con el resultado obtenido rápida de películas de rayos X, las diapositivas emulsión cruce tarda más tiempo (una a varias semanas) y es más sensible a la obtención de fondo.
Existen cuatro fuentes comunes de gran experiencia: 1) Antecedentes en toda la película de rayos X se suelen hacer paraproblemas con el desarrollador o el fijador, o una película parcialmente expuesto, 2) Antecedentes sobre los portaobjetos de vidrio es generalmente debido a problemas con la preparación de los portaobjetos de lavado o de vidrio, tales como silination indebido de las diapositivas de la fuente comercial o auto preparado; 3) Emulsión la exposición y el fondo de desarrollo, y 4) Antecedentes de la sección ya sea debido a la falta de pasos de lavado cuidadoso post-hibridación, demasiado bajo de una temperatura de hibridación, la mala calidad de la solución de hibridación, la contaminación de paraformaldehído en platos de lavado causando sondas para permanentemente reticular a la degradación del tejido ribosonda, dando lugar a pequeñas moléculas de etiquetado del tejido no-específicamente, la TDT inactivo o β-mercaptoetanol resultante en la reticulación de S 35-ARN sondas en enlaces di-sulfuro al tejido, y espera demasiado tiempo para la acetilación. Es crítico para tener las diapositivas de la solución dentro de acetilación segundo de mezclar el anhídrido acético y trietanolamina. Si pasan varios minutos without adición de la solución a las diapositivas, a continuación, los grupos acetilo no será eliminado de manera eficiente y luego se unen al ARN no específica. Otros factores incluyen la hibridación durante 20 horas, lo que puede generar demasiado fuerte de una señal, y las gotas de exceso de aceite en las diapositivas, que secuestran solución de hibridación en las diapositivas en soluciones acuosas, resultando en manchas radiactivas en el tejido y se desliza dando señales de fondo oscuro. Si se trabaja con varias diapositivas (más de 100 cortes), agregue un 3 de cloroformo, lavar o cambiar los lavados de cloroformo, para evitar el exceso de partículas de aceite de permanecer en las diapositivas. Tratamiento de los tejidos sin cuidado, es decir, no la congelación con la suficiente rapidez (dentro de 5-10 minutos después de la disección) o la descongelación y recongelación también aumenta el fondo debido a la degradación del ARNm. Tenga cuidado de no confundir el fondo de una exposición superior.
Para el fondo de emulsión en las diapositivas de cruce es posible, porque es muy sensible a la luz y requiere de larga exposición en la oscuridad. Com problemas comunes de antecedentes incluyen demasiado alto de la temperatura para el revelador y el fijador. Cuando la temperatura es superior a 19 ° C, cerca o más caliente que la temperatura ambiente, más fondo grano de plata se obtiene. La exposición a bajos niveles de luz con fugas a un cuarto oscuro hará que el fondo de emulsión. No lavado fijador tiempo suficiente (por lo menos 30 minutos en agua corriente), dejará fijador que reacciona entonces con violeta de cresilo para generar un precipitado marrón a lo largo de la emulsión. Sin embargo, si los portaobjetos se lavaron en agua ya que 90 minutos después de la fijación antes de la tinción violeta de cresilo, esto puede provocar que la emulsión se aflojen y las secciones a manchar mal. Si no hay tiempo suficiente para teñir las diapositivas en una ventana de 30-90 minutos después de la fijación y el lavado, después del lavado de 30 minutos, secar los portaobjetos durante la noche y continuar con violeta de cresilo manchar el día siguiente. Generalmente, la mayoría de los ARNm específicos tienen patrones de expresión génica, mientras que la señal de fondo es más uniforme.
e_content "> pañuelo doblado podría inducir a error a los resultados de expresión génica en la película de rayos X, dando lugar a una región más oscura de la señal. Para determinar si el tejido se pliega, no examinar secciones teñidas con campo oscuro o violeta de cresilo secciones teñidas en campo claro. cresilo counterstaining violeta ofrece una mejor manera de examinar el estado del tejido.Para una mejor interpretación de la especificidad de la sonda, sondas de control de los sentidos debe ser aplicado en varias secciones adyacentes. La mayoría de las sondas de los sentidos no muestran una señal, pero algunos lo hacen, y cuando lo hacen, nos encontramos con que a menudo es diferente de la señal antisentido. Creemos que esto podría estar relacionado con la síntesis antisentido u otro gen en la hebra antisentido del genoma. Se presenta un ejemplo Pax6 sentido y antisentido sondas (Figura 2A y B). La cadena antisentido revela etiquetado a lo largo de la zona ventricular del cerebro anterior, el cerebelo y los ojos como se esperaba (Figura 2A), pero revela el sentido de laBeling en la capa de pigmento de la retina (Fig. 2B).
Para tamaños de sonda, se utiliza sondas de ADNc en cualquier lugar en el intervalo de 300-5000 pb. Las sondas de trabajo de menos de 300 puntos básicos, pero las señales son generalmente más débil. No hemos intentado sondas más grandes de 5000 bps. Es mejor utilizar sondas sobre el tejido de la misma especie, si es posible. Si no, las sondas de hibridación cruzada en las secciones de otras especies y disminuir la temperatura de hibridación y lavado de 3.5 ° C sobre la base de incrementos de identidad de secuencia, si se conoce. Si no se conoce, entonces llevamos a cabo la hibridación de ensayo y error, y temperaturas de lavado. Si la temperatura es demasiado baja, la sonda de ADNc puede hibridación cruzada con otros mRNAs de secuencias similares a través de especies o en las mismas especies 11. En la práctica, nos encontramos con que ADNc que son ~ 95% idéntica o mayor a la meta mRNA en el tejido, la hibridación rigurosas y temperatura de lavado (65 ° C) las condiciones funciona bien. Para las secuencias que se encuentran en la sonóes de ~ 85 a 94% idénticos, la hibridación y la temperatura de lavado puede ser necesario reducir en el intervalo de ~ 50 a 60 ° C.
La razón para utilizar una rejilla de metal en la mayoría de los pasos es el uso de lavados de cloroformo y xileno. Ambos compuestos orgánicos fundir muchos tipos de plásticos. El vidrio y algunos tipos de plásticos son resistentes a estos productos orgánicos. Pero el vidrio es más fácil de romper, y algunos plásticos que al principio son resistentes se derretirá más larga de los períodos de exposición a los compuestos orgánicos.
Figura 1. Autorradiografía de las imágenes de hibridación in situ de las radiografías y diapositivas de emulsión de cruce. (AB) película de rayos X imágenes de secciones sagitales toda la cabeza del pájaro cantante pinzón cebra en el día embrionario 10, se hibridó con riboprobes antisentido (A) o FOXP1 CoupTF2 (B), se toma con iluminación de campo claro con un microscopio de disección. Granos negros, expuestas en la película que muestra ARNm expresaiónico. Barras de escala = 500 micras. (CD) Emulsión bajó de diapositivas de imágenes de secciones sagitales toda la cabeza del pinzón cebra en el día después de compuerta 6, se hibridó con riboprobes antisentido (C) FOXP1 y (D) CoupTF2, tomada con una iluminación de campo oscuro con un microscopio de disección. El blanco, los granos de plata expuestos en emulsión por encima de los tejidos que muestra la expresión del mRNA. Violeta Rojo, cresil mancha. Barras de escala = 200 micras. Por todo imagen, el pico es rostral a la izquierda. Las imágenes de la película de rayos X fueron expuestos durante un día, se desliza por inmersión durante 3 días. La sonda es FOXP1 178 bps a la parte 1544-1711 pb del ARNm; CoupTF2 es 545 bps a la parte 1-545 pb del ARNm. Como puede verse, en el ARNm prosencéfalo FOXP1 se enriquece en la mesopallium (M), el cuerpo estriado (St) y tálamo dorsal (dt), mientras que CoupTF2 se enriquece en la nidopallium (N), arcopallium (A), y más tálamo ventrales . Es necesaria la coherencia en la expresión entre los tipos de exposición (y edades). Con las diapositivas de cruce, sin embargo, un etiquetado mayor resolución se ve, unad límites y subdivisiones de tejido están directamente identificados. Estas y todas las otras imágenes que aparecen en el documento son de secciones usando el estándar de 65 ° C hibridación de alta rigurosidad.
Figura 2. Comparación de antisentido y sentido etiquetado que muestra diferentes patrones. (A) La hebra antisentido de Pax6 se expresó en el cerebro, especialmente la zona ventricular (flecha blanca). Se muestra la autorradiografía en películas de rayos X de la cabeza sagital rebanadas enteras tomadas del pinzón cebra en el día embrionario 12. (B) sección adyacente hibridó con la hebra de sentido de Pax6 revela ninguna expresión de fondo a lo largo de la cabeza del embrión, pero la expresión aparente en la capa de pigmento de la retina (flechas negras) como la hebra antisentido. La línea de trazos indica el contorno de todo el cerebro. C: Cerebelo.
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Figura 4. Resolución de plata del grano a nivel celular. Se muestra FOXP1 etiqueta de ARNm en el cerebro anterior del pinzón cebra, con los granos de plata (puntos negros) por encima de las células (cresil violeta) en diferentes regiones del cerebro y la edad en comparación con las imágenes de baja potencia de la Figura 1A y 1C. (A) la expresión de gran abundancia en las células individuales (flechas negras) en el adulto mesopallium pinzón cebra. (B) la expresión de la abundancia a baja altura sobre las células individuales (puntas de flecha negras) en el nidopallium adyacente de la misma sección. (C) de alta FOXP1 la expresión de ARNm en las células (flechas negras) en el día embrionario 12 mesopallium. (D) la expresión de la abundancia a baja altura sobre las células (puntas de flecha negras) en el nidopallium adyacente de la misma sección. Ejemplo, las células están rodeados con una línea amarilla. Las células embrionarias (C y D) son más pequeños y más compactos en comparación con las células adultas (A y B). El puesto que existe un cierto espacio entre las células y en emulsión, el área de exposición sigranos LVER de la sonda S 35 son ligeramente grande que el área de los cuerpos celulares. Barras de escala = 10 micras.
Discussion
Radiactivos hibridación in situ de la expresión del ARNm es ampliamente utilizado para múltiples propósitos, incluyendo para el estudio de la organización del tejido regional, tipos de células, y la actividad funcional del cerebro 2-5,10,12-14. El uso posterior está en los genes cuya expresión de ARNm en el cerebro depende de una mayor actividad neuronal, a menudo llamados los genes dependientes de la actividad o de genes tempranos inmediatos. Con esta finalidad, nuestro método ha sido aplicado a través de múltiples especies, en particular en las aves, los mamíferos (humanos), los peces y los anfibios; en varios tejidos, incluyendo cerebro, piel y músculo, y de edades múltiples, incluyendo los neonatos o recién nacidos, menores de edad , los adultos, y aquí, en secciones de embriones enteros 2,3,5,15-17. Las características especiales de nuestro protocolo incluyen: (1) Se produce un equilibrio entre la especificidad anatómica y la especificidad cuantitativa. Para cuantificar la expresión génica en la película de rayos X, tomamos fotografías digitales de las imágenes (por ejemplo:. Fig. 1A y 1B), utilice el Photoshop (Adobe) la función de histograma para medir la densidad de píxeles en las regiones de interés y restar los niveles de fondo de la película fuera de los tejidos, pero todavía en el portaobjetos de vidrio 2,4. Para cuantificar la expresión a nivel celular, tomamos las imágenes de los granos de plata sobre las células con gran aumento (40-100X, Fig. 4). A continuación, utilizamos el umbral y las funciones de medida de la J de la imagen de Wayne Rasband en los NIH para contar el número de granos de plata en la imagen, se resta el recuento de fondo en un área similar sin células de la lámina de vidrio, se divide por el número de células, para obtener valores de expresión por célula. 4,18 (2) Se puede medirse el flujo relativamente alta, permitiendo el procesamiento de 100-200 diapositivas simultáneamente, debido a la junta de cubreobjetos apretado creado por el baño de aceite mineral. Standard in situ los métodos de hibridación tomar más tiempo para sellar los portaobjetos con parafina, esmalte de uñas, y otros medios, donde las diapositivas ocupan mucho espacio, (3) Es muysensible para transcripciones de baja abundancia debido a sulfato de dextrano y solución de Denhardt en el tampón de hibridación 2,13; (4) El enfoque de imágenes en campo oscuro produce imágenes de alto contraste, debido a la toma de fotografías bajo iluminación en campo oscuro en un microscopio de disección 4,5. Además, permite la detección sensible de los pequeños cambios en la expresión génica, tales como en la expresión génica dependiente de la actividad para identificar regiones específicas del cerebro activadas durante la percepción y la producción de comportamientos específicos 19. Las limitaciones relativas a no radiactivos protocolos son que los últimos son más clara en la resolución celular y la localización del ARNm dentro de la célula, y trabajando con emulsión es muy sensible a la manipulación y la luz. Es posible combinar nuestro método con otros métodos, tales como no radiactivos en hibridación in situ para etiquetar la expresión del ARNm de más de un gen en el mismo tejido 10,17,20. Se puede combinar con inmunocitoquímicapara etiquetar ambos ARN y la expresión de proteínas en la misma muestra con el fin de co-localizar el ARNm con ciertos tipos de células 10. Las modificaciones de protocolo necesarios para tales experimentos de marcaje doble se describen en las referencias citadas.
En resumen, nuestro enfoque facilita la comprensión del momento y la localización celular de la expresión génica con el fin de entender la organización la región, la actividad del tejido funcional, y la función del gen.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a todos los miembros de Jarvis de laboratorio que mejoraron el protocolo a través de los años.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Cryostat | Thermo scientific | Microm HM550 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
| DTT | Promega | P1171 | 100mM |
| EDTA | Sigma | ED | |
| Embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Fisher brand Superfrost plus slide | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | |
| Formamide | Sigma | F7508 | |
| GENECLEAN kit | Q-Bio gene | 1001-200 | |
| Kodak BioMax MR film | Sigma | Z350370 | |
| Kodak NTB Emulsion | Carestream Health | 8895666 | |
| Kodak Professional developer D19 | Kodak | 1462593 | |
| Kodak professional Fixer | Kodak | 1971746 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | |
| NaOH | VWR | SX0600-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | |
| rATP | Promega | P1132 | 10mM |
| rCTP | Promega | P1142 | 10mM |
| rGTP | Promega | P1152 | 10mM |
| RNasin | Promega | N2111 | 40Units/μl |
| S35 UTP | PerkinElmer | NEG039C001MC | |
| Safety-Solve solution | Safety Solve Research Products International | 111177 | |
| Sodium Acetate | Sigma | S7899 | 3M |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| SP6 RNA polymerase | Promega | P1085 | |
| Staining metal rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2075 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 5x Transcription buffer | Promega | P1181 | |
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | VWR | 101449-446 | |
| tRNA | Roche | 10109509001 | |
Solutions: |
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References
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