Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Radyoaktif In situ Hibridizasyon

Published: April 27, 2012 doi: 10.3791/3764
Automatic Translation
1, 2, 1
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

Summary

Bu protokol başarıyla kantitatif omurgalı türlerin birden çok doku tipleri düzeyleri ve mRNA mekansal kalıpları tespit etmek için kullanılır. Yöntem, düşük bolluk transkript algılamak ve aynı anda slayt yüzlerce işleme izin edebilirsiniz. Biz örnek olarak kuş embriyonik beyin oluşumu ekspresyon profili kullanarak bu protokolü sunarız.

Abstract

Bir gen ile ifade edilen bir zamanlama, seviye, hücresel yerleşimi ve hücre tipi bilmek genin işlevinin anlayışımıza katkıda bulunmakta. Bu özelliklerin her biri hücre içinde mRNA in situ hibridizasyon ile gerçekleştirilebilir. Burada Clayton ve ark. (1988) 1 özellikle yetişkin omurgalı beyinleri 2-5 için, yıllardır bizim laboratuarımızda başarıyla çalışmaktadır modifiye in situ hibridizasyon yöntemi radyoaktif bir sunuyoruz. Hedef diziyle uzun tamamlayıcı RNA (cRNA) probları düşük bolluk transkript 6,7 tespiti için izin verir. CRNA problar radyoaktif nükleotidlerin Kuruluş düşük bolluğu transkript ve kantitatif analizleri daha da algılama hassasiyetini sağlar, ya da ışığa duyarlı x-ray film veya doku üzerinde kaplı emülsiyon tarafından. Bu yöntemler hedef gen ekspresyonunun uzun vadeli bir kaydın sağlar. Radyoaktif olmayan prob met ile karşılaştırıldığındaBöyle DIG-etiketleme gibi ODS, radyoaktif prob hibridizasyon metodu düşük bolluğu transkriptlerin algılamak için HRP-antikorları ve / veya TSA kiti kullanılarak çok sayıda amplifikasyon adımları gerektirmez. Bu nedenle bu yöntem kantitatif analiz için sinyal şiddeti ve hedeflenen mRNA miktarları arasında doğrusal bir ilişki sağlar. Aynı anda 100-200 slaytlar işleme izin verir. Bu embriyolar farklı gelişim evreleri için de çalışıyor. Embriyonik doku zor doku bölümleri ile hücre popülasyonu arasındaki sınırları görmek için yapım, hücreler arasında daha az uyum ile, yetişkin dokuya göre daha kırılgan olduğu için gen ekspresyonu pek çoğu gelişimsel çalışmaları kısmen insan embriyosu ve radyoaktif olmayan yaklaşımlar 8,9 kullanın. Buna karşılık, hassasiyet büyük aralığı nedeni ile radyoaktif yaklaşımı, daha kolay popülasyonlar arasındaki sınırları görmek için yapım, doku bölgeleri arasında gen ekspresyonu çözünürlükte yüksek kontrast elde edebilmektedir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar ortaya koyabilirBir yeni tanımlanan gen mümkün önemi, ve daha da ilgi genindeki fonksiyonu tahmin.

Protocol

1. Doku Hazırlama

  1. Taze dokular Harvest. Kuş embriyolar için, dikkatle yumurta açmak ve 1xPBS, iki kez olan bir tabak içinde embriyo temizleyin. Yetişkin beyinleri için, hızlı beyin kaldırın ve yavaşça 1 x PBS ile yıkayın.
  2. Kesit için gerektiği gibi doku orientating OCT doku tek tam gömülü bir kalıp içine embriyo veya yetişkin beyin Embed ve hızlı bloğunun içinde karışım elde etmek için dikkatli olmak, etanol ve kuru buz karışımı içine yerleştirerek blok dondurmak .
  3. 10-12 mikron kalınlığında kesitler içine kriyostat içinde donmuş örnek dilimleyin. Beyin ve embriyonik doku için iyi kesme ılıman -20 ° C ile -18 ° C aralığı içindeki bir
  4. Süper plus cam lamlara frozen monte edin.
  5. -80 ° C'de bir kayar kutusuna bölümleri depolamak

2. Radyoaktif Riboprobes oluşturma (kurumunuzun radyasyon güvenliği prosedürleri kullanın)

  1. Saflaştırılmış lineer DN üretYa bir plazmid DNA veya RNA polimerazın promotor bağlanma yerlerinin bağlı ucun PCR ile RNA polimeraz organizatörü mekanlarıyla çevrili klonlanmış bir parçası enzim kısıtlı özet tarafından ilgi cDNA bir şablon. Bu, 3 've 5' PCR primerleri bir parçası olarak RNA polimeraz arttırıcılar ile PCR parçaları oluşturmak için de mümkündür. Jeller GENECLEAN jel saflaştırma kiti ile kısıtlı veya PCR üretilen parçaları arındırmak.
  2. 0,5 ml Eppendorf tüp için, istenen miktarda hacim getirmek için 0.5-1 lineer DNA örneğinin saflaştırılmış mikrogram, transkripsiyon tampon, DTT, RNasin, AGC nükleotid karışımı çözümü ve RNaz ücretsiz su ekleyin. Sonra antisens veya mantıklı riboprobes ya yapmak için S 35-UTP ve uygun RNA polimeraz ekleyin.
  3. Bir 37 ° C'de su banyosunda 1 saat süreyle inkübe karışımı. RNA polimeraz başka bir alikotu ekleyin ve bir 1 saat boyunca inkübe edilir.
  4. 3M sodyum asetat çözeltisi (toplam hacminin 0.1 katı) ve% 100 EtOH (2.5 fo eklemeEppendorf tüp içine toplam hacminin ld) sentezlenen RNA Spastine Özgü Riboprop çöktürmek için.
  5. Kuru buz veya -80 ° C'de 15 dakika veya en fazla 3 saat boyunca yağış yardımcı olarak inkübe edin.
  6. Pelet RNA 4 santrifüj ° C ve 30 dakika için bir masa üstü Eppendorf santrifüj 15.000 rpm.
  7. Süpernatantı ve% 70 EtOH ile pelet yıkayın, iyi pelet karıştırmak için parmağınızla dokunun.
  8. Pelet yeniden RNA 4 santrifüj ° C ve 30 dakika süreyle 15.000 rpm.
  9. Pipeting tamamen süpernatantı alın ve daha sonra 40 ul hibridizasyon çözüm ekleyin. Ve dışarı pipeting tarafından iyice karıştırınız.
  10. Iyi sintilasyon flakon, mix 3 ml Emniyet çözün çözüm içine çözeltinin 1 ul koyun ve kıvılcım sayacı içinde sayar ölçmek.
  11. Bir hafta içinde kullanım için -20 ° C'da Spastine Özgü Riboprop ile Eppendorf yerleştirin.

3. Doku Tedavi

  1. Bir kukuleta, taze PBS% 4 paraformaldehy tamponlu hazırlamak3-5 ° C oda sıcaklığının üzerinde de bir çözüm. -80 Dan Slaytları ° C depolama kuru buz üzerinde bir metal raf, kaputun altında çalışma alanına taşıyacak ve sonra% 4 paraformaldehit çözüm içine raf yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
  2. 15 dips her (dip başına 1 saniye civarında) yaklaşık 1 x PBS ile 3 kez yıkayın.
  3. Kaputu, asetilasyon tampon ve 10 saniye içinde kuvvetlice sallayın. Hemen slaytlar raf içeren bir tepsiye dökün ve 10 dakika inkübe edilir, Spastine Özgü Riboprop bağlayıcı arka azaltmak için.
  4. 15 dips için 2 x SSPE 3 kez yıkayın.
  5. % 70,% 95 ve her adımda 2 dakika süreyle% 100 EtOH seri kurutmak (kaput olmak zorunda değildir).
  6. En az 10-15 dakika için kaputun altında slaytlar kurulayın.

4. Melezleme

  1. Spastine Özgü Riboprop miktarı (slayt başına 0.5-1x10 6 dk) ​​ve tüm slaytlar için gerekli hibridizasyon solüsyonu (slayt başına 100 ul) hesaplayın. Prewa65, RM Spastine Özgü Riboprop-hibridizasyon karışımı ° C'de 5 dakika boyunca Spastine Özgü Riboprop denatüre için.
  2. Spastine Özgü Riboprop-hibridizasyon slayt boyunca bir çizgi çözüm ve doku ve kapak üzerine eşit bir şekilde yaymak için bir bardak coverslip kullanmak pipetleyin 100 ul. Place 4 saat en az 65 ° C yağ banyosu ve 16 saat maksimum yavaşça dik bir metal raf ve yerine rafa dik bakacak, yatay kayar. Yağ lamelleri çevresinde hava geçirmez bir mühür oluşturur.
  3. Yağ banyosu metal raflar çıkarın ve kağıt mendil ile rafa etrafında fazla yağı silin.
  4. Kapalı slaytlar ve kloroform, iki kez içeren cam veya metal tepsilere metal raf petrol yıkayın. 2. kloroform yıkama sonraki deney için, ilk olarak kullanılabilir.
  5. % 0.1 β-merkaptoetanol + 2 x SSPE çözümü ile bir tepsi içine kapalı kaydıraklı rafa aktarın ve lamelleri gevşetin ve çıkarın aşırı hibridizasyon çözüm çözmek için bir kaç dip ve aşağı yukarı hareket ettirinTION.
  6. % 0.1 β-merkaptoetanol + 2 x SSPE taze çözüm kaplı slaytlar ile rafa aktarın ve sonra doku kesitlerinde çizilmemesi için çözüm bir RNaz ücretsiz forseps ile lamelleri kaldırın. 2 x SSPE% 0.1 β-merkaptoetanol bir çözüm, bir tepsi yatay slayt raf tutucu taze rafa örtünmemiş slaytlar aktarın.
  7. Taze% 0.1 β-merkaptoetanol slaytlar ile raf + 2 aşırı ilişkisiz RNA probu kaldırmak için 1 saat boyunca oda sıcaklığında x SSPE çözüm. Inkübe Bu ve radyoaktif atık olarak önceki sulu yıkama çözeltiler, yanı sıra lamelleri, atın.
  8. , 65 yaşında bir ısıtması 2x SSPE çözüm ° C slaytlar ile rafa aktarın% 0.1 konsantrasyonda bir final için β-merkaptoetanol ekleyin ve 1 saat boyunca 65 ° C'de inkübe edin. Radyoaktif atık olarak atın.
  9. Aktarın ve 30 dakika her biri için 65 ısıtması 0,1 x SPPE slaytlar iki kez rafa ° C'de inkübe edin. Çıkarıldı radyoaktivite miktarı,Bu adım çok küçük ve artık bu aşamadan sonra aşırı radyoaktif atık olarak.
  10. Raf ve slaytlar% 70,% 95 ve 2 dakika her biri için% 100 EtOH kurutmak.
  11. En az 30 dakika kaputu slaytlar kurulayın.

5.. Radyoaktif Sinyal Görselleştirme

  1. Bir film kaset içine kuru slaytlar yerleştirin ve karanlık bir odada, slaytlar üzerinde x-ray film (Kodak BioMax MR film) yerleştirin ve kaset kapatın. Slaytlar x-ray film emülsiyon tarafı gördüğünden emin olun. Transkript beklenen bolluk bağlı olarak ~ 1-7 gün için slaytlar Açığa.
  2. Standart geliştirici ve fixer, x-ray film geliştirin. Hibridizasyon sinyali film üzerinde siyah (emülsiyon gümüş taneleri maruz) (Şekil 1) olarak gözüküyor.
    1. (İsteğe bağlı) hücresel çözünürlüğünü belirlemek ve doku sinyal görmek için, slayt fotografik emülsiyon batırılmış ve zıt gerekir.En sonunda cresyl mor counterstain şart ise, daha sonra iki kez,% 100, 100,% 95,% 95,% 70 ve% 50% EtOH içinde, her biri 1 dakika rehidre oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iksilen içerisinde kuluçkaya alarak bölümleri delipidize ve daha sonra deiyonize su içerisinde. Eğer delipidization gerektirmeyen bir boya ile leke olacak değildir, daha sonra delipidization gerekli değildir. De en az 2-3 saat için bir başlık altında Kuru slaytlar.
    2. Güvenli bir ışık kullanarak karanlık oda, cam daldırma konteyner boyuna yarım slayt (doku) kapsayacak kadar Kodak NTB emülsiyon oymak ve ardından 20-30 dakika süreyle 42 ° C su banyosunda eritin. Ardından 1:1 oranında distile su ile sulandırın. Emülsiyon seviyesi artık slayt batırılmış bir slayt tüm bölümleri kapsaması gerekir. Slayt bir sürü varsa, ekstra emülsiyon hazırlamak gerekebilir.
  4. 42 ° C su banyosu ve kapalı bir ışık geçirmez bir kapta kuru daldırma slaytlar overnig içinde sulandırılmış emülsiyon batırın slaytlarKaranlık bir odada ya da farları kapalı 2-3 saat 37 ° C'de bir fırın içinde ht.
  5. Birbirine temas ve böylece eserler yaratmak için değil slaytlar için dikkatli olmak, Desiccators içeren siyah kutular içinde rafları yuvalarına slaytlar aktarın. Yavaş statik bağlı hafif kıvılcımları önlemek ve daha sonra alüminyum folyo ile sarın kutuları siyah elektrik bandı ile kutularının kenarları kapatılmalıdır. 4 de kutuları ° C'nin birkaç günden birkaç haftaya kadar (x-ray film hakkında 1 gün sinyal emülsiyon altında 5 gün benzer).
  6. 1 saat boyunca oda sıcaklığına ısınmaya kaydırma kutularını.
  7. Karanlık odada, kaydıraklı raf kaldırma (ya da metal bir raf yer slaytlar halinde slayt yuvaları kutularını kullanarak) kutularından ve 3.5 dakika 16 ° C'de Kodak D-19 geliştirici onları geliştirmek.
  8. 1 dakika boyunca oda sıcaklığında musluk suyunda geliştirilmiş slaytlar yıkanır.
  9. 6 dakika her biri için 19 ° C'de fixer iki kez kuluçkaya bırakın. Işıklar ikinci fixer inkübasyon sırasında açılabilir. En azından 30 dakika için oda sıcaklığında akar su içinde slaytlar yıkayıp 'ıslak' da cam çizilmemesi bir ustura sürgünün arka tarafı ile emülsiyon sıyırmak.
  10. 5 dakika musluk suyunda% 0.3 cresyl menekşe ile doku Leke.
  11. ~ 15 dips için taze musluk suyu ilave cresyl menekşe çözüm yıkayın.
  12. % 50,% 70,% 95,% 95,% 100 ve% 100 EtOH: ~ her bir alkol çözeltisi içinde 15 eğim için slaytlar kurutmak.
  13. Iki kez, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iksilen içerisinde kuluçkaya bırakın.
  14. Tutkal daha slaytlar temizlemek için yeterince güçlü olduğunu daha önce birkaç gün sürer; Permount slayt üzerinde orta ve (> 16 saat) bir gece kaputu kapalı slayt kuruması ile Coverslip.

6. Darkfield Renkli Görüntüler oluşturuluyor

  1. Su ile ıslatma ve bir jilet ile kazıma tarafından slayt arka (doku olmadan non-coversliped tarafında) gerekli, daha temiz, aşırı emülsiyon halinde.
    2. <li>% 80 EtOH solüsyonu ile slaytlar durulayın ve enkaz ve toz kurtulmak için hafifçe 1-2 kez silin.
  2. Karanlık alan veya aydınlık aydınlatma altında fotoğraflar çekin. Adımlar 6.2 ve 6.3 kolay bir mikroskop altında karanlık alan görülen toz parçacıkları olmadan iyi bir görüntü elde etmek için 2-3 kez tekrar edilmesi gerekebilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

1) dia veya 2 üzerine yerleştirilen x-ray film) emülsiyon slaytlar üzerinde kaplanmıştır: S 35 radyoaktif prob ile hibridize doku kesitlerinde in situ hibridizasyon sonuçları görüntülemenin iki ana yolu vardır. Üçüncü bir yaklaşım slaytlar üzerine yerleştirilen bir phosphorimager ekran kullanıyor, ama biz bu yaklaşımın çözünürlüğü ile tatmin edilememiştir. X-ray filmleri hızlı bir sonucu ve melezleşme genel durumunun analizler sağlar. X-ışını filmine veriler ayrıca geniş anatomik çözünürlük göstermektedir ve nicel analizi çalışan için kullanılabilir10'dur. FoxP1 ve CoupTF2 gen ekspresyonu için antisens probları ile hibridize geç kuş embriyo başkanları x-ray film görüntü örnekleri Şekil 1A ve B'de yer alır. Her iki gen spesifik beyin alt bölümleri oldukça bol miktarda bulunmaktadır. İyi bir röntgen filmi sonucu keskin olması (bulanık değil) ve yüksek sinyal-zemin oranı olmalıdır. Bir bulanık görüntü bir röntgen filmi ve melezleşmiş doku ile cam slayt arasındaki eşitsiz temas nedeniyle olabilir.

Emülsiyon daldırma slaytlar için, emülsiyon x-ray film plastik olmak apposed olarak doku üzerine kaplanmış ışığa duyarlı gümüş tuzları içerir. Sırasında gelişen, S 35-maruz gümüş tuzları çok röntgen filmi gibi gümüş taneleri metalik dönüştürülür. Ancak, gümüş yatakları mikroskop altında gözlenen ve niteliksel ölçülebilir gen ekspresyonu temsil hücreleri üzerinde doğrudan görülebilir. Metalik gümüş taneleri aracılığıyla doğrudan ışık blokeve aydınlık görünümü altında siyah noktalar olarak görünür. Cresyl menekşe counterstain (Şekil 3A, 3C, ve Şek. 4) mor renkte görünür. Karanlık alan olarak, gümüş taneleri tarafından gelen ışığı yansıtır ve beyaz noktalar (Şekil 1C, 1D, 3B ve 3D) olarak görünür. Bu durumda, cresyl mor leke kırmızı renkte görünür. Aydınlık olarak, hibridizasyon sinyali Darkfield olarak, ek olarak, hibridizasyon sinyali tamamını doku üzerinde daha düşük büyütme altında görülebilir ise, hücresel çözünürlükte Yüksek büyütme altında görüntülemek için daha kolaydır. Karanlık alan görüntüsü biz bunlara genel gen ifade deseninin göstermek için kullanabileceğiniz bir yaklaşımdır. Ancak, x-ray filmlerin elde hızlı sonuca göre, emülsiyon daldırma slaytlar uzun zaman alır (birkaç hafta bir) ve arka plan elde etmek için daha duyarlıdır.

Güçlü bir arka plan dört ortak kaynağı vardır: 1) tüm x-ray film üzerinde Arkaplan genellikle yapmak edilirgeliştirici veya fixer, kısmen veya pozlanmış film ile ilgili sorunlar; cam lamlara 2) Arkaplan genellikle ticari kaynak veya öz-hazırlanmış slaytları uygunsuz silination olarak yıkama veya cam slayt hazırlama, sorunlar nedeniyle, 3) Emülsiyon maruz kalma ve kalkınma plan, bir melezleşme sıcaklığının çok düşük dikkatli sonrası hibridizasyon yıkama adımları eksikliği gibi nedenlere bağlı bölüm, melezleşme çözüm kalitesiz, problar kalıcı çapraz bağ neden yıkama yemekler paraformaldehit kirlenme ve 4) Arkaplan , non-spesifik doku S-di sülfit bağları 35-RNA probları çapraz bağlanma ile sonuçlanan inaktif DTT ya da β-merkaptoetanol doku etiketleme ve asetilasyon için çok uzun bekleme küçük moleküller yol dokusu, Spastine Özgü Riboprop bozulmasına. Bu, asetik anhidrit ve trietanolamin karıştırma saniye içinde asetilasyon çözelti içinde slaytlar olması kritik önem taşır. Birkaç dakika ezelî geçerseniznon-spesifik RNA bağlamak ardından t, slaytlar çözüm ekleyerek sonra asetil grupları verimli silinmeyecek ve. Diğer faktörler bir sinyal çok güçlü oluşturabilir 20 saat içinde melezleme, ve dokusu üzerinde radyoaktif lekeler ile sonuçlanan, sulu yıkama süresince slaytlar üzerinde hibridizasyon çözüm çekilmek slaytlar, aşırı yağı damlacıkları içerir ve karanlık bir arka plan sinyalleri veren slaytlar. Çok slaytları (100'den fazla dilim) ile çalışan, bir 3. kloroform yıkamak veya değiştirmek kloroform yıkar, slaytlar üzerinde kalan fazla yağı partikülleri önlemek için ekleyin. Dikkatsiz doku işlem, yani yeterince hızlı dondurma (diseksiyonu sonrası 5-10 dakika içinde) veya çözülme ve yeniden dondurma da bozulması mRNA'ya nedeniyle arka arttırmaktadır. Aşkın poz için arka plan karıştırmamak için dikkatli olun.

Hassas yüksek ışık ve karanlık uzun pozlama gerektirir, çünkü daldırma slaytlar üzerinde emülsiyon arka plan için mümkündür. Com mon arka sorunlar geliştirici ve fixer için sıcaklık çok yüksek bulunmaktadır. Sıcaklık, 19 ° C daha yüksek yakın veya oda sıcaklığında daha sıcak olduğunda, daha gümüş tahıl arka elde edilir. Karanlık oda sızması ışık düşük düzeyde maruz kalma emülsiyon arka plan neden olur. (Akan su ile en az 30 dk) yeterince uzun fixer yıkanarak değil, daha sonra emülsiyon boyunca kahverengimsi bir çökelti oluşturmak için cresyl menekşe ile reaksiyona fixer bırakacaktır. Slaytlar cresyl mor leke önce tespit sonra 90 dakika daha uzun süre suda yıkanır Ancak, bu emülsiyon gevşek ve zayıf leke bölümleri neden olabilir. 30 dakika yıkamadan sonra, tespit ve yıkamadan sonra bir 30-90 dakika penceresi içinde slaytlar leke için yeterli zaman yoksa, gecede slayt kurulayın ve ertesi gün lekelenme cresyl menekşe ile devam edin. Arka sinyal daha düzgün iken Genellikle, çoğu mRNA, belirli bir gen ekspresyonu var.

e_content "> Katlanmış doku koyu sinyali olan bir bölgeye giden, x-ray film üzerinde gen ekspresyonu sonuçları için yanıltıcı olabilir. doku katlanmış, aydınlık altında karanlık alan veya cresyl mor lekeli bölümleri altında olmayan kesitlerin incelemek belirlemek. Cresyl menekşe counterstaining doku durumu incelemek için daha iyi bir yol sağlar.

Prob özgüllük daha iyi yorumlamak için, kontrol duygusu probları birkaç komşu bölümler uygulanmalıdır. Çoğu anlamda probları bir sinyal görünmüyor, ama bazı şeyleri, ve bunu yaptıklarında, bunu sık sık antisens sinyal farklı olduğunu bulmak. Bu sentez ya da genomun antisens iplikçik başka bir gen antisens ile ilgili olabileceğini düşünüyoruz. Biz bir örnek Pax6 duygusu ve antisens probları (Şekil 2A ve B) sunuyoruz. Antisens iplikçik beklendiği gibi ön beyin, beyincik ve göz (Şekil 2A) ve ventriküler zon boyunca etiketleme ortaya çıkarır ama bu anlamda la ortayaretinanın pigment tabakası (Şek. 2B) içinde beling.

Prob boyutları için, 300-5000 bps aralıkta herhangi cDNA probları kullanın. Problar az 300 bps çalışır, ancak sinyalleri genellikle zayıftır. Biz 5000 bps daha büyük prob denemedim. Mümkünse aynı türden dokusu üzerinde probları kullanmak en iyisidir. Değilse, biz diğer türlerin bölümlerde problar çapraz melezleşme ve hibridizasyon azaltmak ve 3-5 de biliniyorsa, dizi kimliğine dayalı ° C artışlarla sıcaklıklarda yıkayın. Bilinmiyorsa, o zaman deneme yanılma hibridizasyon gerçekleştirmek ve sıcaklıklarda yıkayın. Sıcaklık çok daha alçaltılmış edilirse, cDNA prob türler arasında ya da aynı türden 11 benzer sekansları diğer mRNA'lar çapraz hibridleşmek olabilir. Uygulamada, dokuda mRNA hedefi, sıkı hibridizasyon ve yıkama sıcaklığı (65 ° C) koşulları ~% 95 aynı veya daha fazladır cDNAlarının iyi işe yaradığını bulabilirsiniz. Rang bulunmaktadır dizilerini~ özdeş% 85-94, hibridizasyon ve yıkama sıcaklığı es 60 ° C'ye ~ 50 aralığında azaltılmış gerekebilir

Adımları çoğunda, bir metal raf kullanılmasının nedeni, kloroform yıkama ve ksilen kullanımıdır. Hem organik plastik birçok türde eritebilir. Cam ve plastik bazı tür bu organik dayanıklıdır. Ancak cam kırmak kolay, ve ilk önce dirençli olması bazı plastikler organik maruz kalma, uzun süreler boyunca eriyecek.

Şekil 1
Şekil 1. X-ray filmler ve emülsiyon daldırma slaytları in-situ hibridizasyon görüntülerin Otoradyografi. (AB) X-ray film bir mikroskop altında aydınlık aydınlatma ile alınan (A) FoxP1 veya (B) CoupTF2 için antisens riboprobes ile hibridize embriyonik 10. günde zebra ispinoz bülbül sagittal tüm başı bölümden görüntüler. MRNA ekspres gösteren filmde Siyah, maruz tahıllariyon. Ölçek çubuğu = 500 mikron. (CD) Emülsiyon (C) FoxP1 ve (D) bir diseksiyon mikroskop altında karanlık alan aydınlatma ile çekilen CoupTF2. Için antisens riboprobes ile hibridize sonrası ambar günde 6 zebra ispinoz sagital tüm başı bölümden slayt görüntüleri bandırılmış Beyaz, mRNA ekspresyonu gösteren doku üzerinde emülsiyon gümüş taneleri maruz. Kırmızı, mor leke cresyl. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bütün resim için, gaga sol rostral olduğunu. X-ray film görüntüleri 3 gün boyunca bir gün, daldırma slaytlar için maruz bırakılmıştır. FoxP1 prob mRNA 1544-1711 bp kısmına 178 bps olduğu; CoupTF2 mRNA 1-545 bp kısmına 545 bps olduğunu. Önbeyin FoxP1 mRNA CoupTF2 nidopallium (N), arcopallium (A) zenginleştirilmiş ise, mesopallium (M), striatum (St) ve dorsal talamus (DT) zenginleştirilmiş ve daha ventral talamus edilir içinde görülebileceği gibi . Maruz kalma türleri (ve yaş) arasında ifade tutarlılık yoktur. Daldırma slaytlar ile, ancak, daha yüksek bir çözünürlük, bir etiketleme, görülürd doku sınırları ve alt bölümlerine doğrudan tanımlanır. Bunlar ve kağıt gösterilen tüm diğer görüntüler standart 65 ° C yüksek darlığı hibridizasyon kullanarak bölümleri gelmektedir.

Şekil 2
Şekil 2. Antisens ve farklı desenler gösterir anlamda etiketleme karşılaştırılması. (A) Pax6 bir antisens strand beyin, özellikle ventriküler bölgesi (beyaz ok) olarak ifade edildi. Embriyonik günde 12 zebra ispinoz alınan sagittal tüm başı dilim x-ray filmlerde otoradyografi gösterilmez. (B) Pax6 duygusu iplikçik ile hibridize Komşu bölüm arka plan embriyo baş boyunca ifadesi, ancak antisens iplikçik olarak retina pigment tabakası (siyah oklar) içinde belirgin ifadesi ortaya koymaktadır. Kesikli çizgi, bütün beyin konturu gösterir. C: Beyincik.

Şekil 3
rong> Şekil 3. aydınlık ve karanlık alan görünümler altında geç evrelerinde zebra ispinoz beyin alınan emülsiyon daldırma slaytlar gen ekspresyonu in situ sinyalleri olarak. Emülsiyon için normal bir maruz embriyonik 10. günde D1B ifade (A) aydınlık görüntüsü. Etiket (siyah) ancak bu büyütmede görülebilir. Probe mRNA 1-625 bp kısmına 625 bps olduğunu. (B) (A) ama gibi Özdeş bölüm ve büyütme karanlık alan striatumda etiketi gösteren bakış (beyaz) (St) ve talamus (TH) geçti. Emülsiyonu ile bir fazla maruz embriyonik günde 12 az Slit3 ifade (C) aydınlık görüntüsü. Etiket (siyah) kolayca görülebilir. Probe mRNA 1243-2021 kısmına 779 bps olduğunu. (B) (A) gibi Özdeş bölüm ve büyütme aydınlık görüntü eşleşen spinal kord (SC) olarak karanlık alan görünümü gösteren etiket (beyaz) geçti. Rostral sol aydınlatmaktadır. Cb: Beyincik.

/ 3764/3764fig4.jpg "alt =" Şekil 4 "/>
Şekil 4. Hücresel düzeyde gümüş tahıl çözünürlük. Gösterilen Şekil 1A ve 1C düşük güç görüntüleri ile karşılaştırıldığında, beynin farklı bölgelerinde ve yaş hücreleri yukarıda gümüş taneleri (siyah noktalar) (cresyl mor) ile zebra ispinoz önbeyin yılında FoxP1 mRNA etikettir. Yetişkin zebra ispinoz mesopallium tek tek hücrelerin içinde (A) Yüksek bolluğu ifade (siyah oklar). Aynı bölümün bitişik nidopallium tek tek hücrelerin (siyah ok başları) üzerinden (B) Düşük bolluk ifade. Embriyonik günde 12 mesopallium hücreler üzerinde (C) Yüksek FoxP1 mRNA (siyah oklar). Aynı bölümün bitişik nidopallium hücreler üzerinde (D) Düşük bolluğu ifade (siyah ok başları). Örnek hücreleri sarı bir çizgi ile çember vardır. Embriyonik hücreleri (C ve D) daha küçük ve daha sıkı bir yetişkin için hücreleri (A ve B) ile karşılaştırıldığında paketlenir. Hücreler ve emülsiyon arasında biraz boşluk, maruz si alanında var yanaG 35 probu ile lver taneler hücre organlarının alanı biraz daha büyüktür. Ölçek çubuğu = 10 mikron.

Discussion

MRNA in situ hibridizasyon Radyoaktif yaygın bölgesel doku organizasyonu, hücre tipi ve beyin fonksiyonel aktivite 2-5,10,12-14 eğitim dahil olmak üzere farklı amaçlar için kullanılır. Daha sonra kullanmak olan mRNA beyinde artan sinirsel aktivite, sık sık adı verilen aktivite bağımlı genler veya erken genler bağlıdır genler üzerinde. Yavruların / yenidoğan, gençler de dahil olmak üzere ve çoklu yaş; birden dokularda, beyin, deri ve kas dahil olmak üzere; bu kullanımlar ile, yöntem memeliler (örneğin insan), balık ve amfibiler, kuşlar da dahil olmak üzere, birden fazla tür arasında uygulanmış , yetişkin ve burada bütün embriyo bölümlerde 2,3,5,15-17. Bizim protokolünün özel özellikleri şunlardır: (1) Bu anatomik özgüllük ve nicel özgüllük arasında bir denge oluşturur. X-ray film üzerinde gen ekspresyonu ölçmek için, görüntülerin dijital resimler (. Örn: Şekil 1A ve 1B) almak, Pho kullanınilgi bölgelerinde piksel yoğunluğu ölçmek ve doku dışında film arka plan seviyeleri çıkarmak ama hala cam slayt 2,4 açık olarak toshop (Adobe) histogram fonksiyonu. Hücresel düzeyde ifade ölçmek için, yüksek büyütme (; Şekil 4 40-100X) altında hücreleri üzerinde gümüş taneleri görüntüleri çekin. Daha sonra cam slayt üzerine hücreler olmadan benzer bir alanda arka sayımı dışarı çıkarmak, görüntü gümüş tanelerinin sayısını saymak için NIH at Wayne Rasband tarafından Image J eşik ve tedbir işlevlerini kullanın, hücrelerin sayısına göre bölmek hücre başına ifade. 4,18 bir değerleri (2), aynı anda 100-200 slayt işleme izin, mineral yağ banyosu tarafından oluşturulan sıkı coverslip mühür nedeniyle nispeten yüksek verimlilik olabilir. elde etmek için Standart in-situ hibridizasyon yöntemleri parafilm, oje ve slaytlar çok yer kaplayacak diğer araçlar ile slaytlar imzalamak için uzun sürer; (3) yüksek olduğuDekstran sülfat ve hibridizasyon tamponu 2,13 olarak Denhardt çözümü sayesinde düşük bolluk transkript için hassas; (4) karanlık alan içinde görüntüleme yaklaşımı 4,5 bir mikroskop üzerinde karanlık alan aydınlatma altında fotoğraf çekerken nedeniyle yüksek kontrastlı görüntüler verir. Ayrıca, bu tür faaliyetlere bağlı gen ekspresyonu olarak gen ekspresyonu küçük değişiklikler, hassas algılama 19 özel davranış algı ve üretim sırasında aktive spesifik beyin bölgelerinde belirlemenizi sağlar. Radyoaktif olmayan protokoller göre sınırlamalar ikinci hücresel çözünürlük ve hücre içinde mRNA konumunu daha net olduğunu, ve emülsiyon ile çalışan manipülasyon ve ışığa karşı çok duyarlıdır. Aynı doku 10,17,20 birden fazla genin mRNA etiketlemek için in situ hibridizasyon gibi radyoaktif olmayan gibi diğer yöntemlerle birlikte bizim yöntemi birleştirmek mümkündür. Bu immünsitokimya ile kombine edilebiliramacıyla aynı örnek RNA ve protein ifadesini hem etiketlemek için belirli bir hücre tipleri ile 10 mRNA co-lokalize. Bu çifte etiketleme deneyler için gerekli olan protokol modifikasyonlar bahsedilen referanslarda tarif edilmektedir.

Özetle, bizim yaklaşım bölge örgütü, doku fonksiyonel aktivite ve gen fonksiyonu anlamak için zamanlama ve gen ekspresyon hücresel konumun anlamayı kolaylaştırır.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar yılda protokolü geliştirilmiş tüm Jarvis laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride VWR MK242002
Chloroform VWR BDH1109
Cresyl violet acetate Sigma C5042
Cryostat Thermo scientific Microm HM550
Deionized formamide Sigma F9037
DTT Promega P1171 100mM
EDTA Sigma ED
Embedding mold VWR 15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide Fisher Scientific 22-034-979
Formaldehyde VWR BDH0506-4LP
Formamide Sigma F7508
GENECLEAN kit Q-Bio gene 1001-200
Kodak BioMax MR film Sigma Z350370
Kodak NTB Emulsion Carestream Health 8895666
Kodak Professional developer D19 Kodak 1462593
Kodak professional Fixer Kodak 1971746
β-mercapt–thanol Calbiochem 444203
Mineral oil VWR IC15169491
NaOH VWR SX0600-1
Paraformaldehyde Sigma 76240
Poly A Invitrogen POLYA.GF
rATP Promega P1132 10mM
rCTP Promega P1142 10mM
rGTP Promega P1152 10mM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
Safety-Solve solution Safety Solve Research Products International 111177
Sodium Acetate Sigma S7899 3M
Sodium phosphate dibasic Sigma S3264
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
SP6 RNA polymerase Promega P1085
Staining metal rack Electron Microscopy Sciences 70312-54
T7 RNA polymerase Promega P2075
Tissue-Tek OCT Sakura 4583
5x Transcription buffer Promega P1181
Triethanolamine VWR IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) VWR 101449-446
tRNA Roche 10109509001

Solutions:
  1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S35 UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
  2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
  3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S35 UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
  4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart's solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55 °C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20 °C, which is good for ~6 months.
  5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50 °C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
  6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
  7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
  8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na2HPO4, and 2.4g of KH2PO4 in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
  9. Second wash solution: 0.1% β-mercapt–thanol and 50% formamide in 2x SSPE
  10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363 (2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768 (2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

Tags

Nörobilim Sayı 62, radyoaktif riboprobes omurgalı embriyo gümüş emülsiyon karanlık alan genetik
Radyoaktif<em> In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. … More

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. J. Vis. Exp. (62), e3764, doi:10.3791/3764 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter