Summary
我们描述了一个协议aldonitrile从土壤中提取的葡萄糖和胞壁酸醋酸衍生物GC为基础的分析方法。对于澄清的化学机制，我们也提出一项战略，以确认衍生工具及电子电离后形成的碎片离子的结构。
Abstract
表征微生物的定量方法是为更广泛地了解微生物生态系统内的地位和功能的关键。微生物分析当前的策略包括传统的实验室培养相关的技术和基于直接提取和测定某些生物标志物1，2。居住在土壤中的微生物物种多样性之间很少可以培养的，所以依赖于文化的方法引进重大偏差，缺席的生物标志物分析的限制。
葡萄糖，半乳糖，甘露和胞壁酸已担任活着和死去的微生物质量的措施，这些葡萄糖最丰富的胞壁酸（唯一从细菌细胞）是最重要的成分在土壤系统3 4。然而，分析知识缺乏制约的科学同行之间的广泛普及。其中所有EXI蜇分析方法，到aldononitrile乙酸酯衍生GC为基础的分析，作为不错的选择，以最佳的平衡精度方面出现的，灵敏度，简单，良好的色谱分离，样品储存5时的稳定性。
在这里，我们提出了一个详细的协议为葡萄糖和胞壁酸的可靠和相对简单的分析，从土壤后，他们转换到aldononitrile醋酸。该协议主要包括四个步骤：酸消化，样品净化，衍生化和气相色谱法测定。根据修改前的出版物6，7分步过程。此外，我们提出了一项战略，以结构验证的分子离子和电子电离后形成的衍生离子碎片。我们采用的GC-EI-MS-SIM卡，的LC-ESI-TOF-MS的同位素标记试剂来确定分子量aldononitrile醋酸衍生物氨基葡萄糖和MUR聚酰胺酸;我们用同位素标记的衍生工具的大规模转移，在调查每个衍生物8离子碎片离子谱。在另外的理论澄清，验证衍生的分子离子和离子碎片将是有益的研究人员使用的δ13 C或离子碎片，这些生物标志物在生物地球化学研究，9，10。
Protocol
1。样品制备和酸的提取
- 冷冻干燥的土壤样品收集后场。
- 使用球磨机，土壤粉碎机，或杵臼研磨，均质土壤样品。
- 25毫升水解瓶称取土壤样品（含0.3毫克ñ）。
- 到每个水解瓶中，加入10毫升6M盐酸，填补紧紧氮2瓶气，帽。
- 在孵化器105°Ç水解为8小时，使用自动定时开关。
2。样品纯化
- 删除从孵化器的烧瓶，冷却至室温。
- 加入100μL的内部标准，每个烧瓶肌肌醇（1毫克毫升水-1）;纷飞组合。
- 成立到200毫升梨ST /生理盐水24/40个关节，稳定的塑料杯形瓶塑料排水渠道。
- 倍滤纸＃2定性到宿舍和集成漏斗圆（直径11厘米）。 漩涡每个水解瓶中，倒入漏斗浆过滤（您可能会进一步〜3毫升水冲洗每个瓶）。
- 〜45℃，采用真空旋转蒸发干燥过滤。
- 干渣悬浮梨瓶从每个3〜5毫升水（如果需要的话，使用超声波浴），倒入40 mL的聚四氟乙烯管;第二等份水冲洗烧瓶。
- pH值调整到6.6 - 6.8使用1M KOH溶液中析出的金属离子和其他有机分子。
- 取出离心沉淀10分钟，在2000 RCF。
- 上清倒入40毫升的玻璃试管，覆盖，然后用封口膜管开放，冻结在-20°C间戳孔的封口膜。
- 冷冻干燥冷冻上清，去除所有的液体。
- 干用3 mL甲醇溶解残渣，彻底涡旋（如果需要的话，使用超声波浴）;管帽，然后在2000离心力离心10分钟解决出盐。
- 将上清转移至3 mL锥形反应瓶; RapidVap机蒸发干燥，在45°C（或温和的干燥氮气流，如果需要的话）。
- 每个小瓶，100μL，恢复标准的N-methylglucamine（1毫克毫升水-1）和1 mL H 2 O，覆盖小瓶嘴巴用封口膜，冻结在-20°C间，穿孔的封口膜，然后冷冻干燥。
- 标准：添加100μL，胞壁酸（0.5毫克毫升甲醇-1），100μL，氨基葡萄糖（1毫克毫升水-1），100μL，肌醇（1毫克毫升水-1），100μL列印methylglucamine（1毫克毫升水-1），1毫升氢澳，封口膜每小瓶，于-20℃冻结，穿孔封口膜，然后冷冻干燥。
3。衍生
- 含有32毫克毫升-1盐酸羟胺和40 mg mL -1的 4 -二甲-PY准备衍生试剂在ridine吡啶甲醇（4:1 V / V）。
- 加入300μL衍生试剂的每个reactivials，盖紧瓶盖，涡旋彻底。
- 小瓶放在75-80℃水浴35分钟（以及密封的小瓶，以避免让任何水进入小瓶）。
- 从水浴，冷却至室温，取出小瓶。
- 加入1 mL醋酸酐到每个3毫升reactivials，盖紧瓶盖，涡彻底，然后再加热75-80℃水浴25分钟。
- 从水浴，冷却至室温，取出小瓶。
4。分离和测量
- 加入1.5 mL二氯甲烷每个小瓶，盖紧瓶盖，涡旋彻底。
- 加入1 mL 1M盐酸每个小瓶，盖紧瓶盖，涡彻底的解决方案允许坐在原状，直到独立的两个短语，吸，并放弃使用1000微升移液器顶部（水）相。
- 在相同的Fashion，提取有机相的3倍，但与1毫升H2O（最后的洗涤步骤，采取特殊照顾，以确保水的顶级阶段已被删除）。
- 干燥的最终解决方案，使用RapidVap 45°C间（或干使用氮气，如果需要的话）。
- 溶于300μL乙酸乙酯正己烷（1:1 V / V），并转移到2 mL的琥珀色的螺丝帽，小批量的插入样品瓶，盖紧瓶盖。
- 量化，使用熔融硅极性毛细管柱：长30米，内径为0.25 mm，0.25微米的薄膜厚度;固定相，5％苯基，95％甲基聚硅氧烷（DB-5或同等学历）与氢的GC-FID分析或氦气作为载气，在0.5毫升分钟-1不断流动。色谱法是更好的溢价“惰性”阶段和氢气载气，但接受是较常见的品种和氦。探测器的设置是300°C，400毫升分钟-1空气和氮为30毫升分钟-1氢妆气体。注射和烤箱参数如下：1μL分流进样GC进样口设置在250°C（30:1）;初始烤箱温度120°C，保持1分钟，烤箱温度增加10°C最低。 -1至250°C，保持2.5分钟。坡道270°C时，20°C最低-1;保持2分钟，坡道290°C时，20°C最低-1，保持5分钟。调整载气流量，以便在250°C，肌醇，葡萄糖和胞壁酸衍生物洗脱，在270的N-methylglucamine流出°C。
5。衍生验证
- 使用软电离的LC-ESI-TOF-MS的识别分子离子，并确定分子量的衍生。
- 使用的GC-EI-MS-SIM卡或GC-EI-MSMS调查衍生的目标离子的敏感性增强。
- 使用多个同位素标记试剂的衍生工具的准备，然后使用大规模转移在MS同位素标记衍生物的研究分子离子和碎片离子。
6。代表结果
该方法的协议主要包括四个步骤：酸消化，样品净化，衍生化，气相色谱法测定（ 图1）。在图2所示为葡萄糖和胞壁酸标准股票和从土壤样品的分析的一个例子。除了葡萄糖和胞壁酸，甘露和半乳糖（葡萄糖的同分异构体），也可以决定同时使用的方法。内部标准肌醇标准响应因素的基础上，我们可以量化的土壤样品中的这些生物标志物。恢复标准已用于定性监察衍生过程。该计划的aldononitrile醋酸衍生物氨基葡萄糖和胞壁酸的形成如图3所示
拟议的衍生工具结构测定气相色谱-质谱-SIM卡的敏感性增强，或软电离的LC-ESI-TOF-MS的8;电子电离后形成的碎片离子的拟议结构进行了比较离子光谱研究样品制备与各种同位素团11。 图4显示的大规模转移，主导离子米/ 187 aldononitrile醋酸衍生物氨基葡萄糖ž准备了三种方案，代理，非标记的D-醋酸硬石膏和U -13的C-葡萄糖。其他详细的资料及解释，可以被称为我们最近的出版物8，11。这一战略可以作为一个模型来研究衍生化学。
图1。测量分析土壤中的葡萄糖和胞壁酸的协议流程图样品。该协议主要包含4个步骤：酸消解，净化，衍生化和气相色谱法测定。
图2。的GC-FID色谱标准和土壤的葡萄糖，肌醇，胞壁酸，甘露，半乳糖和methylglucamine aldononitrile醋酸。
图3。形成的aldononitrile醋酸衍生物氨基葡萄糖和胞壁酸的计划。数字1代表腈反应。数字2代表的乙酰化。
质量aldononitrile醋酸衍生物氨基葡萄糖，主导离子结构的光谱图4。ES EI模式下，与准备（一）非标记的代理，（乙）的D-醋酸硬石膏（C），ü-13的C-葡萄糖。星代表重同位素原子或同位素组。
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Discussion
提出的GC基于衍生aldononitrile乙酸氨基葡萄糖和胞壁酸的分析方法，提供了一个相对快速的方法来量化这些氨基酸糖，从土壤中提取。衍生品是化学性质稳定，可以在一次分析确定。该方法不仅限于土壤样品，并可以简化从非土壤基质的样品。
在这种方法中使用的真空泵是建立耐酸。我们进一步建议设立一个基本的陷阱，以保护泵，蒸发6M HCl溶液时。必须小心在衍生步骤，严格无水的条件下，保持试剂和玻璃器皿。应毫不拖延地进行工作。玻璃器皿必须认真清洁，无论是在550°C消音或用溶剂清洗。处理酸，在蒸发过程中的强酸蒸气应采取的安全防范措施。氨基糖苷类，土栖生物产生的抗生素系列，已被确定为一个可能的干扰，如葡萄糖或胞壁酸在DB-5月12日共同流出，所以建议用不同的固定相化学的第二列的GC-FID是用来量化这些氨基酸糖的主要方法。我们建议，供日后分析的气相色谱流出确认探测器。对于复杂基质中微量的生物标志物的明确标识，我们建议使用精密的仪器，如气相色谱 - 环境科学与多反应监测;生物标志物的精确量化干扰物的存在，我们建议一些主导的大规模离子独特的生物标志物的基础上做校准衍生工具。
氘代15的N-盐酸羟胺的糖结构的身份确认，醋酸酐，13 C和/或15 N标记的生物标志物的非标记的羟基胺盐酸盐，醋酸酐和编制衍生物的生物标志物，并进一步监测预测的标记与未标记的衍生工具的特征离子为m / z的转变。在具体的，因为每个醋酸组包含3氘和每个的丁腈组包含1月15日的氮原子，它可以预测，离子m / z的大规模转移，是由醋酸团体和丁腈组将在离子的结构提出多少决定片段。同样，13 C和/或15的N-标记的细菌细胞都可以被用来确定从葡萄糖或胞壁酸的起源多少碎片离子结构的C原子，或是否在葡萄糖-N或胞壁酸-N的存在片段结构。
的GC-EI-MS-SIM卡是由电子碰撞电离和使用quadropole大规模分离和选择离子监测质谱气相色谱的LC-ESI-TOF-MS的液相色谱仪通过电trospray电离和质谱，飞行时间质谱分离。我们在这里指出，这些被用来帮助确定分子量和离子碎片的方法之间的差异。 ESI-TOF MS是一种“软电离”技术传授到足够低的分析物分子的电离能，因此没有出现碎片，产生的信号是一个高度精确的测量分析物的分子量。在GC-EI-MS的，更多的精力转移到分析物，除了分子分解产生带电的碎片数量。作为一个质量过滤器该quadropole作用，因此，只有那些片段的特定质量/电荷比到达探测器。分布的碎片，这是分析物的特点，被称为离子光谱，强度或丰度对为m / z绘制图表所示。为了提高灵敏度，我们使用选择离子监测（SIM），在我们编写的MS收集只有少数特定的m / z值RA进一步比整个质谱。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由能源部大湖生物能源研究中心（DE-FC 02-07ER64494科学能源部的BER办公室）赠款支持。张旭东博士和他的小组成员有用的技术讨论和宝贵意见，最后敲定协议，我们对此表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
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