Summary
Vi beskriver ett förfarande för protokoll för GC-analys av derivaten aldonitrile acetat av glukosamin och muraminsyra extraheras från marken. För klargörande av den kemiska mekanismen presenterar vi också en strategi för att bekräfta strukturen hos derivatet och fragmenten jon som bildas vid elektron jonisering.
Abstract
Kvantitativa metoder för kännetecknar mikroorganismer är avgörande för en bredare förståelse av mikrobiella status och funktion i ekosystemen. Nuvarande strategier för mikrobiell analys omfattar både traditionella laboratorium kultur-beroende teknik och de grundar sig på direkt extraktion och bestämning av vissa biomarkörer 1, 2. Några bland mångfalden av mikrobiella arter som lever marken kan odlas, så kulturen är beroende av metoder för att införa betydande fördomar, en begränsning saknas i biomarkör analys.
Glukosamin, mannosamin, galaktosamin och muraminsyra har väl varit åtgärder av både levande och döda mikrobiell massa av dessa glukosamin (vanligaste) och muraminsyra (unikt från bakteriell cell) är de viktigaste beståndsdelarna i marken system 3 , 4. Men begränsar bristen på kunskap om analysen stora popularisera bland vetenskapliga jämnåriga. Bland alla EXIsting analysmetoder, derivatisering för att aldononitrile acetater följt av GC-analys har visat sig vara ett bra alternativ med avseende på optimalt balansera precision, känslighet, enkelhet, bra kromatografisk separation och stabilitet vid prov lagring 5.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för en pålitlig och relativt enkel analys av glukosamin och muraminsyra från marken efter omvandling till aldononitrile acetater. Protokollet omfattar i huvudsak fyra steg: syra, prov rening, derivatisering och GC beslutsamhet. Steg-för-steg förfarande modifieras enligt tidigare publikationer 6, 7. Dessutom presenterar vi en strategi för att strukturellt validera molekyljonen på derivatet och dess fragment jon bildas vid elektron jonisering. Vi tillämpade GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS och isotopiskt märkta reagens för att bestämma molekylvikten för aldononitrile acetat derivatiserad glukosamin och muramidsyra, vi använde massförskjutning av isotop-märkta derivat i jonspektrum att undersöka jon av fragment av varje derivat 8. Förutom den teoretiska klargörandet kommer validering av molekyljonen av derivatinstrumentet och dess fragment jon vara till nytta för forskare som använder δ 13 C eller fragment jon av dessa biomarkörer i biogeokemiska studier 9, 10.
Protocol
1. Provberedning och syraextraktion
- Frystorka jordprover efter fältuppsättningen.
- Mala och homogenisera jordprover med användning av en kulkvarn, jord kvarn, eller en mortel och mortelstöt.
- Väg jordprover (innehållande> 0,3 mg N) till en 25 ml kolv hydrolys.
- Tillsätt 10 ml 6 M HCl till varje hydrolys kolv, fyll N2-gas i kolvarna, och locket tillsluts.
- Hydrolysera vid 105 ° C i en inkubator under 8 timmar med användning av en omkopplare automatisk timer.
2. Provet Rening
- Ta bort kolvarna från inkubatorn, svalna till rumstemperatur.
- Tillsätt 100 pl inre standard myo-inositol (1 mg ml -1 i vatten) till varje kolv, blandning genom omskakning.
- Ställ in plast trattar avrinning i 200 ml päronformade kolvar med ST / NS 24/40 leder, som ställs på plastmuggar för stabilitet.
- Vik Whatman # 2 Kvalitativa Circles (11 cm diameter) i fyra delar och satt i trattar. Swirl varje hydrolys flaska och häll slam in i tratten för att filtrera (du kan ytterligare skölj varje flaska med ~ 3 ml vatten).
- Torka filtratet med användning av en rotationsindunstare vid ~ 45 ° C, anbringa vakuum.
- Resuspendera den torkade återstoden från varje päron kolv med 3 ~ 5 ml vatten (använd ultraljudsbad om så önskas), och häll i en 40 ml teflonrör, skölj kolven med en andra portion av vatten.
- Justera pH till 6,6 till 6,8 med användning av 1 M KOH-lösning för att fälla ut metall och andra organiska molekyler.
- Avlägsna fällningar genom centrifugering vid 2000 ref under 10 min.
- Häll supernatanten i en 40 ml glasrör, täcker röret öppningen med parafilm, frys vid -20 ° C, varefter säcken hål i parafilm.
- Frystorkas frysta supernatanten för att avlägsna all vätska.
- Lös upp återstoden med 3 ml torr metanol, virvling grundligt (använd ultraljudsbad om så önskas); lock röret, och sedan centrifugera vid 2000 ref under 10 minuter för att lösaut salter.
- Överför supernatanten till ett 3 ml konisk reaktionsflaskan; indunsta till torrhet genom RapidVap maskin vid 45 ° C (eller under en försiktig ström av torr kvävgas, om så önskas).
- Till varje flaska, tillsätt 100 pl återvinning standard N-metylglukamin (1 mg ml -1 i vatten) och 1 ml H 2 O, täcka flaska munnar med parafilm och frys vid -20 ° C, perforera parafilm, och sedan frystorka .
- Göra standarder: tillsätt 100 pl muraminsyra (0,5 mg ml -1 i metanol), 100 | il glukosamin (1 mg ml -1 i vatten), 100 | il myo-inositol (1 mg ml -1 i vatten), 100 ^ N- metylglukamin (1 mg ml -1 i vatten), och 1 ml H2O, parafilm varje flaska, frys vid -20 ° C, perforera parafilm och sedan frystorka.
3. Derivatisering
- Framställ derivatisering reagens innehållande 32 mg ml -1 hydroxylamin-hydroklorid och 40 mg ml -1 4-dimetylamino-pyridine i pyridin-metanol (4:1 volym / volym).
- Tillsätt 300 pl av derivatiseringen reagens till varje reactivials, locket tätt och virvelblandades grundligt.
- Sätt injektionsflaskorna i 75-80 ° C vattenbad under 35 minuter (trycktät flaskorna för att undvika så eventuellt vatten att komma in flaskorna).
- Ta rören från vattenbadet och svalna till rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml ättiksyraanhydrid till var och en av 3 ml reactivials, locket tätt och virvelblandades noggrant och sedan återupphetta i 75-80 ° C vattenbad under 25 minuter.
- Ta rören från vattenbadet och svalna till rumstemperatur.
4. Separation och värdering
- Tillsätt 1,5 ml diklormetan i varje vial, locket tätt och virvelblandades grundligt.
- Tillsätt 1 ml 1 M HCl till varje flaska, lock tätt och skaka ordentligt så att de lösningar sitta ostört tills de två fraser separat aspirera och kasta upp (vatten) fasen med 1000 il pipett.
- På samma fiashion, extrahera den organiska fasen 3 gånger men med 1 ml H2O (med det sista tvättsteget, vidta särskilda försiktighetsåtgärder för att säkerställa att hela den vattenhaltiga övre fasen har avlägsnats).
- Torka den slutliga lösningen med RapidVap vid 45 ° C (eller torr med användning av kvävgas, om så önskas).
- Lös upp i 300 | il etylacetat-hexan (1:1 vol / vol) och överföring till 2 ml ambrafärgad skruvkork rören med en liten volym insatsen och locket tillsluts.
- För kvantifiering, analysera med GC-FID med en smält kiseldioxid opolärt kapillärkolonn: 30 m lång, 0,25 mm ID, 0,25 um filmtjocklek; stationär fas 5% fenyl-, 95% metyl-polysiloxan (DB-5 eller motsvarande) med väte eller helium som bärargas vid 0,5 ml min -1 konstant flöde. Den kromatografi är bättre på premium "inert" faser och vätgas bärgas, men är acceptabelt på de vanligaste sorterna och med helium. Detektorelementen inställningar är 300 ° C; 400 ml min -1 luft och 30 ml min -1 för både kväve ochväte makeup gaser. Injektionen och parametrar ugn är som följer: 1 | il delad insprutning (30:1) med GC inloppet inställd på 250 ° C; initial ugnstemperatur, 120 ° C; hålla 1 min; öka temperaturen i ugnen vid 10 ° C min. -1 till 250 ° C; hålla 2,5 min;. ramp till 270 ° C vid 20 ° C min -1; hålla 2 minuter; ramp till 290 ° C vid 20 ° C min -1, håll 5 min. Justera bäraren gasflödeshastigheten så att inositol, glukosamin och muramic syraderivat eluerar vid 250 ° C, och de N-metylglukamin eluerar vid 270 ° C.
5. Derivat Validering
- Använda mjuka jonisering LC-ESI-TOF-MS för att identifiera den molekylära jonen och bestämma molekylvikten av derivatet.
- Använda GC-EI-MS-SIM eller GC-EI-MSMS för känslighet förbättring för att undersöka riktade joner av derivatet.
- Använd flera isotopmärkta reagens för framställning av derivaten, och sedan använda massan Skiftav dessa isotopiskt märkta derivat i medlemsstaterna att undersöka molekyljonen och fragment jon.
6. Representativa resultat
Protokollet av metoden består i huvudsak fyra steg: syra, prov rening, derivatisering och GC beslutsamhet (figur 1). Ett exempel på en analys för glukosamin och muraminsyra från standard lager och från ett jordprov visas i figur 2. Förutom glukosamin och muraminsyra, mannosamin och galaktosamin (två isomerer av glukosamin) kan även bestämmas samtidigt med användning av metoden. Baserat på responsfaktorer av standarder med avseende på den interna standarden myo-inositol, kan vi kvantifiera dessa biomarkörer i jordprover. Återhämtningen standarden har använts för att kvalitativt övervaka derivatisering processen. Systemen för bildandet av aldononitrile acetat derivatiserade glukosamin och muraminsyra visas i figur 3
De föreslagna strukturerna av derivaten bestämdes genom GC-EIMS-SIM för känslighet mer, eller mjuka jonisering LC-ESI-TOF-MS 8; de föreslagna strukturerna i jon-fragment som bildas vid elektronmikroskopi jonisering studerades genom att jämföra den jon-spektra för Prover framställda med olika isotoper inkorporationer 11. Figuren 4 visar massa förskjutning av den dominerande jon m / z 187 av aldononitrile acetat derivatiserad glukosamin i tre scenarier, beredd med icke-märkta medel, D-ättiksyra anhydrit, och U -13 C-glukosamin. Annan detaljerad information och förklaringar kan hänvisas till vår senaste publikationerna 8, 11. Denna strategi kan fungera som en modell för att studera derivat kemi.
Figur 1. Mätning flödesschema av protokollet för analys av glukosamin och muraminsyra i jordprover. Protokollet innehåller huvudsakligen 4 steg: syra, rening derivatisering och GC beslutsamhet.
Figur 2. GC-FID kromatogram av aldononitrile acetater av inositol, glukosamin, muraminsyra, mannosamin, galaktosamin och metylglukamin för standarder och jord.
Figur 3. System för bildandet av aldononitrile acetat derivatiserade glukosamin och muraminsyra. Siffran 1 representerar nitril reaktion. Antalet 2 representerar acetylering.
Figur 4. Masspektra av aldononitrile acetat derivatiserad glukosamin associerad med den dominerande jon struktues i El-läge beredda med (a) icke-märkta ämnen, (B) D-ättiksyra anhydrit, (C) U -13 C-glukosamin. Star representerar tunga isotop atom eller isotop grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade GC-metod för analys av aldononitrile acetat derivatiserad glukosamin och muraminsyra ger en relativt snabb metod för att kvantifiera dessa aminosyror sockerarter, utvinns ur marken. Derivaten är kemiskt stabila, och kan bestämmas i en analys. Metoden är inte begränsad till jordprover, och kan förenklas för prover från icke-jordmatrisen.
Vakuumpumpen som används i denna metod är byggd för att vara resistenta mot syra. Vi föreslår vidare att inrätta en bas fälla för att skydda pumparna då avdunstar 6M HCl lösningar. Försiktighet måste iakttas under Derivatiseringen åtgärder för att bibehålla strikt vattenfria betingelser för både reagens och glas. Arbetet ska genomföras utan dröjsmål. Glas ska vara väl rengjord, antingen genom dämpning vid 550 ° C eller genom att skölja med lösningsmedel. Säkerhetsåtgärder bör vidtas för hantering av syror och starka ångor syra under avdunstning. Aminoglykosid, enserie av antibiotika som produceras av jordlevande organismer, har identifierats som en möjlig inblandning, eftersom det co-eluerar med glukosamin eller muraminsyra på DB-5 12, så en andra kolumn med en annan stationär fas kemi rekommenderas om GC-FID är den huvudsakliga metoden som används för att kvantifiera dessa aminosocker. Vi rekommenderar en bekräftande detektor efter GC eluerar för framtida analys. För entydig identifiering av spår biomarkör i komplexa matriser, föreslår vi att du använder sofistikerad instrumentering, t.ex. GC-MSMS med flera reaktioner övervakning, för exakt kvantifiering av biomarkör i närvaro av störande, föreslår vi att göra kalibrering baserad på några dominerande mass-joner som är unika för biomarkörer derivat.
Bekräftelse av identiteten socker struktur framställdes genom att substituera 15 N-hydroxylamin-hydroklorid, deutererad ättiksyraanhydrid och 13 C och / eller 15 N-märkt biomarkörer för icke-märkt hydroxylaminhydroklorid, ättiksyraanhydrid och biomarkörer vid framställning av derivat och ytterligare övervakning förutspådde m / z förskjutning av karakteristiska joner av det märkta jämfört med de omärkta derivat. I särskilda, eftersom varje av acetat grupp innehåller 3 deuteriums och varje nitril grupp innehåller 1 15 N-atom, kan det förutsägas att jon m / z massförskjutning avgörs av hur många acetatgrupper och nitril gruppen kommer att presenteras i strukturer jon fragment. På liknande sätt 13 C och / eller 15 N-märkning bakterieceller kan båda användas för att bestämma hur många C-atomer i strukturen fragmentjon härstammar från det glukosamin eller muraminsyra, eller huruvida glukosamin-N-eller muraminsyra-N existerar i fragment strukturer.
GC-EI-MS-SIM är gaskromatografi följt av elektronstöt jonisering och masspektrometri med kvadrupol massa separation och vald jonövervakning; LC-ESI-TOF-MS är vätskekromatografi följt av elektrotrospray jonisering och masspektrometri med time-of-flight mass separation. Vi pekar här ut skillnaderna mellan dessa metoder som används för att hjälpa bestämma molekylvikten och fragment jon. ESI-TOF-MS är en "mjuk jonisering"-tekniken i jonisering energi som överförs till analytmolekyler som är tillräckligt låg, så att ingen fragmentering inträffar och den signal som produceras är ett mycket exakt mått på molekylvikten av analyten. I GC-EI-MS, är mer energi överförs till analyten, och molekylen bryts sönder i utbyte ge ett antal laddade fragment. Den kvadrupol fungerar som ett massfilter så att endast de fragment av en specifik massa / laddningsförhållande når detektorn. Fördelningen av fragmenten, som är karakteristisk för analyten, visas i en graf som kallas en jon-spektrum, i vilket intensiteten eller överflöd är avsatt mot m / z. För att öka känsligheten använder vi valt jonövervakning (SIM), där vi programmera MS att samla endast ett fåtal specifika m / z-värden RAther än hela masspektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). Vi är tacksamma till Dr Xudong Zhang och hans gruppmedlemmar för hjälpsamma tekniska diskussioner och ovärderliga kommentarer på att slutföra protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
