Summary
हम glucosamine और muramic मिट्टी से निकाले एसिड के aldonitrile एसीटेट डेरिवेटिव के जीसी आधारित विश्लेषण के लिए एक विधि प्रोटोकॉल का वर्णन. रासायनिक तंत्र की व्याख्या के लिए, हम भी एक व्युत्पन्न और आयन इलेक्ट्रॉन ionization पर गठित टुकड़े की संरचना की पुष्टि की रणनीति प्रस्तुत करते हैं.
Protocol
1. नमूना तैयार करना और एसिड निकालना
- क्षेत्र संग्रह के बाद रुक सूखी मिट्टी के नमूने.
- पीस और एक गेंद मिल, मिट्टी चक्की, या एक मोर्टार और मूसल का उपयोग कर मिट्टी के नमूने homogenize.
- एक 25 एमएल hydrolysis के कुप्पी में मिट्टी के नमूने (> 0.3 मिलीग्राम N युक्त) वजन.
- प्रत्येक hydrolysis के कुप्पी में 10 एमएल 6M एचसीएल, N बोतल में 2 गैस, और टोपी कसकर भरें.
- 8 घंटे एक ऑटो टाइमर स्विच का उपयोग कर के लिए 105 ° सी एक मशीन में Hydrolyze.
2. नमूना शुद्धीकरण
- इनक्यूबेटर से बोतल निकालें, कमरे के तापमान पर ठंडा.
- घूमता द्वारा मिश्रण, 100 μL आंतरिक मानक प्रत्येक कुप्पी (पानी में 1 मिलीग्राम एमएल -1) myo - inositol जोड़ें.
- प्लास्टिक अनुसूचित जनजाति / 24 एन एस / 40 जोड़ों, स्थिरता के लिए प्लास्टिक के कप पर सेट के साथ 200 एमएल नाशपाती के आकार बोतल में draining funnels के सेट.
- गुना वाटमान # 2 गुणात्मक सर्किलों (11 सेमी व्यास) तिमाहियों और funnels में सेट में. प्रत्येक hydrolysis के कुप्पी भंवर, और कीप में घोल डाल करने के लिए फिल्टर (आप आगे ~ पानी के 3 एमएल के साथ प्रत्येक फ्लास्क कुल्ला कर सकते हैं).
- ~ डिग्री सेल्सियस, लागू करने, निर्वात 45 पर एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग छानना सूखी.
- 3 ~ 5 एमएल पानी (अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग अगर वांछित) के साथ प्रत्येक नाशपाती कुप्पी से सूखे छाछ, Resuspend और एक 40 एमएल Teflon ट्यूब में डाल देना, पानी की एक दूसरे अशेष भाजक के साथ फ्लास्क कुल्ला.
- 6.8 वेग धातु आयनों और अन्य कार्बनिक अणुओं को 1M KOH समाधान का उपयोग कर - 6.6 पीएच को समायोजित करें.
- 10 मिनट के लिए 2000 आरसीएफ पर centrifugation द्वारा निकालें precipitates.
- एक 40 एमएल ग्लास ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला डालो, ट्यूब के साथ खोलने parafilm फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस को कवर करने के लिए, तो parafilm में छेद प्रहार.
- सभी तरल निकालने के जमे हुए सतह पर तैरनेवाला रुक - सूखी.
- 3 एमएल शुष्क मेथनॉल के साथ भंग अवशेषों, अच्छी तरह से vortexing (अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग अगर वांछित), ट्यूब टोपी, और फिर 10 मिनट के लिए बसने के लिए आरसीएफ में 2000 अपकेंद्रित्रलवण बाहर.
- एक 3 एमएल शंक्वाकार प्रतिक्रिया शीशी में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, 45 डिग्री सेल्सियस (या सूखी नाइट्रोजन गैस की एक सौम्य धारा के तहत अगर वांछित) RapidVap मशीन द्वारा सूखापन के लिए लुप्त हो जाना.
- प्रत्येक शीशी, 100 μL वसूली मानक (पानी में 1 मिलीग्राम एमएल -1) एन methylglucamine और 1 एमएल एच 2 हे जोड़ने के लिए, शीशी, मुंह parafilm साथ फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस को कवर, parafilm छेदना, और तब शुष्क फ्रीज .
- मानकों बनाओ: 100 μL muramic एसिड (मेथनॉल में 0.5 मिलीग्राम एमएल -1), 100 μL glucosamine (पानी में 1 मिलीग्राम एमएल -1), 100 μL myo inositol (पानी में 1 मिलीग्राम एमएल -1), 100 μL एन जोड़ें (पानी में 1 मिलीग्राम एमएल -1) methylglucamine, और 1 एमएल एच 2 हे, parafilm प्रत्येक शीशी, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर, parafilm के छेदना, फ्रीज सूखे तो.
3. Derivatization
- Derivatization 32 मिलीग्राम एमएल -1 hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड और 40 मिलीग्राम एमएल 4 dimethylamino - py -1 युक्त अभिकर्मक तैयारमें ridine पिरिडीन मेथनॉल (04:01 वी / वी).
- प्रत्येक reactivials के लिए derivatization अभिकर्मक के 300 μL जोड़ें कसकर टोपी, और अच्छी तरह से भंवर.
- 75-80 डिग्री सेल्सियस 35 मिनट के लिए पानी के स्नान से (अच्छी तरह से सील शीशियों किसी भी पानी शीशियों में प्रवेश करने के लिए अनुमति देने से बचने के) में शीशियों रखो.
- जल स्नान, और कमरे के तापमान को शांत से शीशियों निकालें.
- 3 एमएल reactivials, कसकर टोपी, और अच्छी तरह भंवर में से प्रत्येक के लिए 1 एमएल एसिटिक एनहाइड्राइड, तो 75-80 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए पानी के स्नान में गरम करना.
- जल स्नान, और कमरे के तापमान को शांत से शीशियों निकालें.
4. पृथक्करण और मापन
- प्रत्येक शीशी, कसकर टोपी, और अच्छी तरह भंवर में 1.5 एमएल dichloromethane जोड़ें.
- प्रत्येक शीशी, कसकर टोपी और अच्छी तरह से भंवर 1 एमएल 1M एचसीएल जोड़ें समाधान जब तक दो वाक्यांश अलग undisturbed बैठने के लिए अनुमति महाप्राण (व्यंजन), और शीर्ष (जलीय) 1000 μL pipettor के का उपयोग कर चरण त्यागें.
- उसी में चashion, जैविक चरण 3 बार निकालने पर 1 एमएल एच 2 हे के साथ (पिछले वाशिंग कदम के साथ, विशेष ध्यान रखना करने के लिए सुनिश्चित करें कि जलीय शीर्ष चरण की सभी हटा दिया गया है).
- अंतिम 45 में RapidVap का उपयोग कर समाधान सूखी डिग्री सेल्सियस (या सूखी नाइट्रोजन गैस का उपयोग अगर) वांछित.
- 300 μL एसीटेट हेक्सेन एथिल (1:1 वी / वी) और एक छोटे मात्रा डालने और कसकर टोपी के साथ 2 एमएल एम्बर पेंच टोपी शीशियों के हस्तांतरण में भंग.
- मात्रा का ठहराव के लिए, जीसी - खूंटी द्वारा विश्लेषण जुड़े सिलिका nonpolar केशिका स्तंभ का उपयोग कर 30 मीटर लंबा, 0.25 मिमी आईडी, 0.25 उम फिल्म मोटाई, फिनाइल - 5%, 95% मिथाइल polysiloxane (DB-5 या समतुल्य) हाइड्रोजन के साथ स्थिर चरण या हीलियम गैस वाहक के रूप में 0.5 एमएल मिनट -1 निरंतर प्रवाह में. क्रोमैटोग्राफी प्रीमियम "निष्क्रिय" चरणों और हाइड्रोजन वाहक गैस पर बेहतर है, लेकिन अधिक आम किस्मों पर और हीलियम के साथ स्वीकार्य है. डिटेक्टर सेटिंग्स 300 डिग्री सेल्सियस, 400 एमएल मिनट -1 हवा और 30 एमएल मिनट -1 दोनों नाइट्रोजन लिए औरहाइड्रोजन मेकअप गैसों. इंजेक्शन और ओवन पैरामीटर इस प्रकार हैं: 1 जीसी 250 डिग्री सेल्सियस पर सेट प्रवेश के साथ μL विभाजित इंजेक्शन (30:1), प्रारंभिक तापमान ओवन, 120 ° सी, 1 मिनट पकड़ में 10 ओवन तापमान वृद्धि ° मिनट सी. -1 के लिए 250 ° सी, 2.5 मिनट पकड़;. 270 से रैंप डिग्री सेल्सियस 20 डिग्री सेल्सियस मिनट -1, 2 मिनट पकड़, 290 के लिए रैंप डिग्री सेल्सियस 20 डिग्री सेल्सियस -1 मिनट, 5 मिनट पकड़. वाहक गैस प्रवाह दर को समायोजित करें ताकि 250 डिग्री सेल्सियस पर inositol, glucosamine, और muramic एसिड डेरिवेटिव elute, और 270 में एन methylglucamine elutes डिग्री सेल्सियस
5. व्युत्पन्न मान्यकरण
- नरम ionization LC - ईएसआई-TOF-एमएस का उपयोग करने के लिए आणविक आयन की पहचान और व्युत्पन्न की आणविक वजन का निर्धारण.
- संवेदनशीलता के व्युत्पन्न की लक्षित आयनों की जांच बढ़ाने के लिए GC-ईआइ MS - सिम या जीसी-ईआइ - MSMS का प्रयोग करें.
- डेरिवेटिव की तैयारी के लिए कई isotopically लेबल अभिकर्मकों का उपयोग करें, और फिर बड़े पैमाने पर बदलाव का उपयोगएमएस में उन isotopically लेबल डेरिवेटिव के आणविक आयन और आयन के टुकड़े की जांच करने के लिए.
6. प्रतिनिधि परिणाम
विधि के प्रोटोकॉल मुख्य रूप से चार कदम शामिल हैं: एसिड की पाचन, नमूना शुद्धीकरण, derivatization और जीसी दृढ़ संकल्प (चित्रा 1). Glucosamine और मानक स्टॉक से और एक मिट्टी के नमूने से muramic एसिड के लिए विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. Glucosamine और muramic एसिड, mannosamine और galactosamine, (glucosamine की दो isomers) के अलावा भी एक साथ निर्धारित किया जा सकता है विधि का उपयोग कर. आंतरिक मानक myo - inositol के लिए सम्मान के साथ मानकों की प्रतिक्रिया कारकों के आधार पर, हम मिट्टी के नमूने में इन biomarkers यों कर सकते हैं. वसूली मानक गुणात्मक derivatization प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. aldononitrile एसीटेट derivatized glucosamine और muramic एसिड के गठन के लिए योजनाओं चित्रा 3 में दिखाया जाता है
डेरिवेटिव के प्रस्तावित ढांचे जीसी EIMS सिम द्वारा संवेदनशीलता वृद्धि, या नरम ionization 8 LC - ईएसआई-TOF-एमएस के लिए निर्धारित किया गया है, आयन इलेक्ट्रॉन ionization पर गठित टुकड़े के प्रस्तावित ढांचे के आयन स्पेक्ट्रा तुलना द्वारा अध्ययन किया गया नमूने विभिन्न आइसोटोप 11 incorporations के साथ तैयार हैं. चित्रा 4 प्रमुख आयन के बड़े पैमाने पर बदलाव से पता चलता है m / 187 z तीन परिदृश्यों, गैर लेबल एजेंट, डी - एसिटिक anhydrite की, और यू -13 सी glucosamine के साथ तैयार में aldononitrile एसीटेट derivatized glucosamine. अन्य विस्तृत जानकारी और स्पष्टीकरण हमारे हाल ही में 8 प्रकाशनों, 11 के लिए भेजा जा सकता है. इस रणनीति व्युत्पन्न रसायन शास्त्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा कर सकता है.
चित्रा 1. Glucosamine की विश्लेषण और मिट्टी में muramic एसिड के लिए मापन प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्टनमूने. पाचन एसिड, शोधन, Derivatization और जीसी दृढ़ संकल्प: प्रोटोकॉल मुख्य रूप से 4 कदम शामिल हैं.
आंकड़ा 2 जीसी खूंटी मानकों और मिट्टी के लिए inositol, glucosamine, muramic एसिड, mannosamine, galactosamine और methylglucamine aldononitrile एसीटेट की chromatograms.
चित्रा 3 aldononitrile एसीटेट derivatized glucosamine और muramic एसिड के गठन के लिए योजनाएं. नंबर 1 nitrile प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. नंबर 2 एसिटिलीकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 4 aldononitrile एसीटेट derivatized glucosamine मास स्पेक्ट्रा प्रमुख आयन structur के साथ जुड़े.ईआइ मोड के तहत तों (ए) गैर लेबल एजेंटों के साथ तैयार है, (बी) anhydrite डी - एसिटिक, (सी) यू -13 सी, glucosamine. स्टार भारी आइसोटोप परमाणु या आइसोटोप समूह का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
aldononitrile एसीटेट derivatized glucosamine और muramic एसिड के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत जीसी आधारित विधि एक अपेक्षाकृत तेजी से इन अमीनो शर्करा, मिट्टी से निकाले यों विधि प्रदान करता है. डेरिवेटिव रासायनिक स्थिर हैं, और एक विश्लेषण में निर्धारित किया जा सकता है. विधि मिट्टी के नमूने के लिए ही सीमित नहीं है, और गैर - मिट्टी मैट्रिक्स से नमूने के लिए सरल किया जा सकता है.
वैक्यूम पंप करने के लिए इस विधि में इस्तेमाल एसिड के लिए प्रतिरोधी बनाया गया है. हम आगे एक आधार जाल स्थापित करने के लिए पंप की रक्षा जब 6M एचसीएल समाधान वाष्पन सुझाव देते हैं. देखभाल derivatization चरणों के दौरान लिया जाना चाहिए करने के लिए कड़ाई से निर्जल शर्तों दोनों अभिकर्मकों और कांच के बने पदार्थ के लिए, को बनाए रखने. काम देरी के बिना आयोजित किया जाना चाहिए. कांच के बने पदार्थ राजनीति स्वच्छ 550 डिग्री सेल्सियस पर muffling या विलायक के साथ rinsing होना चाहिए. एसिड होता है, और वाष्पीकरण के दौरान मजबूत एसिड वाष्प से निपटने के लिए सुरक्षा सावधानियों लिया जाना चाहिए. Aminoglycoside, एकमिट्टी में रहने वाली जीवों द्वारा उत्पादित एंटीबायोटिक की श्रृंखला, एक संभावित हस्तक्षेप के रूप में पहचान की गई है, यह glucosamine या 12 DB-5 पर muramic एसिड के साथ सह elutes, तो एक अलग स्थिर चरण रसायन शास्त्र के साथ एक दूसरे स्तंभ की सिफारिश की है के रूप में, अगर GC-खूंटी प्राथमिक बढ़ाता इन अमीनो शर्करा के लिए इस्तेमाल किया विधि है. हम एक पुष्टि डिटेक्टर भविष्य के विश्लेषण के लिए जीसी elutes का पालन की सलाह देते हैं. जटिल matrices में ट्रेस biomarker की स्पष्ट पहचान के लिए, हम सुझाव है कि एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी के साथ परिष्कृत उपकरण, जैसे जीसी MSMS का उपयोग कर, biomarker की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए interferents की उपस्थिति में, हम कुछ प्रमुख जन biomarker के लिए अद्वितीय आयनों के आधार पर अंशांकन कर सुझाव डेरिवेटिव.
चीनी संरचना की पहचान की पुष्टि 15 एन hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, एसिटिक एनहाइड्राइड deuterated, और 13 सी और गैर लेबल हाइड्रॉक्सिल के लिए / या 15 एन लेबल बायोमार्करamine हाइड्रोक्लोराइड, और डेरिवेटिव की तैयारी में एसिटिक एनहाइड्राइड बायोमार्कर, और आगे निगरानी unlabeled डेरिवेटिव बनाम लेबल की विशेषता आयनों की पारी मी / z की भविष्यवाणी की. विशेष में, के बाद से एसीटेट समूह के प्रत्येक 3 deuteriums शामिल हैं और प्रत्येक nitrile समूह 1 15 एन परमाणु होता है, यह भविष्यवाणी की जा सकता है कि कितने एसीटेट समूहों और nitrile समूह के आयन की संरचनाओं में प्रस्तुत किया जाएगा आयन मास मी / z बदलाव का फैसला किया है सकते हैं टुकड़े. इसी तरह, 13 सी और / या 15 एन लेबलिंग बैक्टीरियल कोशिकाओं दोनों कई टुकड़ा आयन संरचनाओं में सी परमाणुओं कैसे glucosamine या muramic एसिड से उत्पन्न होते हैं निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, या कि glucosamine के एन या एसिड एन muramic में मौजूद है टुकड़ा संरचनाओं.
जीसी ईआइ MS-सिम गैस क्रोमैटोग्राफी इलेक्ट्रॉन प्रभाव ionization और जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग quadropole बड़े पैमाने पर जुदाई और चयनित आयन की निगरानी के द्वारा पीछा किया, नियंत्रण रेखा के ईएसआई-TOF-एमएस बाद चुनाव से तरल क्रोमैटोग्राफी हैtrospray ionization और जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग समय की उड़ान के बड़े पैमाने पर जुदाई. हम यहाँ कि आणविक वजन और आयन के टुकड़े को निर्धारित करने में मदद करने के लिए उपयोग किया जाता है इन तरीकों के बीच मतभेद की बात है. ईएसआई-TOF-एमएस analyte अणुओं है कि काफी कम है प्रदान ionization ऊर्जा में नरम ionization के "तकनीक है, ताकि कोई विखंडन होता है और उत्पादन संकेत analyte की आणविक वजन की एक बहुत ही सटीक उपाय है. GC-ईआइ एमएस में, और अधिक ऊर्जा analyte के लिए स्थानांतरित कर रहा है, और अणु चार्ज टुकड़े की एक संख्या के अलावा उपज टूट. quadropole एक जन फिल्टर के रूप में कार्य करता है कि केवल एक विशिष्ट अनुपात / जन प्रभारी के उन टुकड़ों डिटेक्टर तक पहुँचने. टुकड़े,, जो विश्लेष्य की विशेषता है की वितरण एक आयन स्पेक्ट्रम, जो में तीव्रता या बहुतायत मीटर z / के खिलाफ साजिश रची है कहा जाता है ग्राफ में दिखाया गया है. संवेदनशीलता को बढ़ाने के हम चयनित आयन निगरानी (सिम) का उपयोग करें, जिसमें हम एमएस केवल कुछ विशिष्ट मूल्यों मी / z आर ए इकट्ठा करने के लिए कार्यक्रम हैपूरे मास के स्पेक्ट्रम से वहाँ.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम डो ग्रेट लेक्स Bioenergy अनुसंधान केंद्र (डे - FC02 07ER64494 विज्ञान डो हिट कार्यालय) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. हम डॉ. Xudong जांग और तकनीकी सहायक और प्रोटोकॉल को अंतिम रूप देने पर चर्चा अमूल्य टिप्पणी के लिए अपने समूह के सदस्यों के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
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