Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Простой микрофлюидных устройства для Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Простой микрофлюидных устройство было разработано для выполнения анестетика бесплатно

Protocol

1. SU8 мастер изготовления

  1. Дизайн микрофлюидных структур с использованием Clewin программного обеспечения и распечатать его с помощью плоттера 65024 DPI лазер с минимальным размером особенность 8 мкм на пленке плате.
  2. Очистите 2 см х 2 см пластины кремния с родным азота в 20% KOH в течение 1 мин и полоскать в деионизированной воде, одна пластина для каждого слоя потока и соответствующего уровня управления.
  3. Удар сухой части азотом и обезвоживает на горячей плите при температуре 120 ° С в течение 4 часов. Разрешить части, чтобы остыть до комнатной температуры, прежде чем переходить к следующему шагу.
  4. Место кремния частей по одному на патрон счетчик и включить вакуум. Покройте поверхности кремния с ~ 20 мкл гексаметил-disilazane (HMDS) и покрыть их использование SPIN150 счетчик на 500 оборотов в минуту в течение 5 секунд следуют 3000 оборотов в минуту в течение 30 сек.
  5. Крышка кремниевых пластин полностью с ~ 1,5 мл SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) и пальто пластин использованием SPIN150 счетчик на 500 оборотов в минуту в течение 5 секунд последовал на 2000 оборотов в минуту в течение 30 сек. Это вращающийся протокол производит фоторезист толщиной ~ 40 мкм, которая подходит для контроля и поток слоев для ранней личиночной стадии C. Элеганс.
  6. Спин ~ 1,5 мл SU8-2050 SPIN150 использованием счетчика на 500 оборотов в минуту в течение 5 секунд последовал на 2000 оборотов в минуту в течение 30 секунд, чтобы получить фоторезист толщиной ~ 80 мкм, которая подходит для изготовления слоя потока в конце личиночной стадии C. Элеганс, базального слоя потока для дрозофилы / у рыбок данио личинки и соответствующие им слои контроль.
  7. Поместите кремния штук на горячую плиту с SU8 покрытием слоем сверху. Мягкие выпекать покрытие части кремния при температуре 65 ° С в течение 1 мин, а затем 95 ° С в течение 10 мин. Разрешить части, чтобы остыть до комнатной температуры, прежде чем переходить к следующему шагу.
  8. Поместите мягкой выпечки кремния штук на экспозицию сцены с SU8-2025-сюр-покрытиемЛицо на вершине, стоящие перед УФ-лампой. Используйте фото маска с дизайном I (L1, рис. 1б) и дизайн II (L2, рис. 1б) для слоя потока и структуры управления слоем, соответственно, для ранней личиночной стадии C. Элеганс. Поместите фотографию маски на верхней части SU8 слоя и обеспечению маска плотно прилегает к покрытой слоем. Откройте затвор УФ-лампы и подвергать мягкой выпечки SU8 пластин до 200 Вт УФ-лампы по фотографии маску на 15 сек.
  9. Используйте фото маска с дизайном I (L1, рис. 1б) и дизайн II (L2, рис. 1б) на SU8-2050 покрытием штук (полученного на стадии 1.6) для изготовления слоя потока и уровня управления в конце личиночной стадии C. Элеганс. Используйте маски фото с дизайном I (L1, рисунок 1С) и дизайн II (L2, рисунок 1С) для базального слоя потока и уровня управления, соответственно, для дрозофилы / личинки данио на пластинах покрыта SU8-2050 (подготовлено яп шагом 1,6). Expose SU8 поверхностей через фотографию маска 200 Ватт УФ-лампой в течение 15 сек.
  10. Поместите подвергается частей кремния на горячей плите с покрытием слоем сверху. Сообщение испечь вафли при температуре 65 ° С в течение 1 мин, а затем 95 ° С в течение 10 мин. Разрешить части, чтобы остыть, прежде чем переходить к следующему шагу.
  11. Разработать части, используя SU8 разработчик решений в течение 20 мин. Промойте штук в изопропилового спирта (IPA) и высушите с использованием газообразного азота.
  12. Поместите кремния штук в эксикаторе с SU8 узор на вершине. Нанесите на куски с 50 мкл tricholoro (1Н, 1Н, 2Н, 2Н-перфтороктил) силана паров в сушильном шкафу в течение 2 часов.

Меры предосторожности: Принять меры предосторожности для химической обработки в течение KOH лечения, фоторезист покрытия и развивается. Силан покрытие пара должна быть выполнена в эксикаторе в проветриваемом помещении. Защита SU8 противостоять более чем на свету. Используйте защитные очки с УФ-маякHT источник.

2. Изготовление пресс-форм PDMS

  1. Подготовить 10:01 PDMS путем объединения 50 г Sylgard 184 базы с 5 г отвердителя в пластиковый стаканчик. Смешать содержимое вручную в течение ~ 3 мин. Дега смеси внутри эксикаторе, чтобы удалить все пузырьки воздуха, образующихся при перемешивании.
  2. Залить толщиной 5 мм смесь PDMS на кремниевых пластинах с SU8 картину дизайна II, для управления слоем, осторожно, чтобы избежать образования воздушных пузырей. В случае пузырьки образуются во время заливки, Дега PDMS на SU8 картины в низком вакууме, чтобы удалить все пузырьки.
  3. Поместите кремниевых пластин с SU8-2025 картина дизайна I, для потока слой, на патрон счетчик и включить вакуум, чтобы держать их. Обложка пластин с ~ 1 мл смеси PDMS и пальто пластин использованием SPIN150 счетчик на 500 оборотов в минуту в течение 5 секунд последовал на 1500 оборотов в минуту в течение 30 сек.
  4. Пальто ~ 1 мл PDMS смеси на кремниевых пластинах с 80 мкм SU8-2050 структура дизайна I (L1, рис. 1б), дляпотоке слоя в конце личиночной стадии C. Элеганс помощью SPIN150 счетчик на 500 оборотов в минуту в течение 5 секунд последовал на 1000 оборотов в минуту в течение 30 сек. Пальто толстым слоем PDMS смеси на кремниевой части с SU8-2050 модель потока слойный дизайн I (L1, рисунок 1С) для дрозофилы / личинки данио рерио, используя SPIN150 счетчик на 500 оборотов в минуту в течение 35 сек.
  5. Выпекать PDMS покрытием частей кремния дизайн я и пластин с соответствующим дизайном II для контроля слой, содержащий PDMS для C. Элеганс и / или Drosophila / личинки данио рерио в горячую духовку конвекции воздуха при 50 ° C в течение 6 часов.
  6. Вырежьте кусок PDMS из кремниевой подложки содержащие SU8 шаблон для II C. Элеганс и / или Drosophila / у рыбок данио личинки с помощью острого ножа. Удар небольшое отверстие ~ 1 мм в верхней части резервуара подключения основного ловушки в форме PDMS помощью перфоратора Харрис.
  7. Поместите ударил PDMS блок (содержащий толщиной 40 мкм формы для управленияслой L2) на пластиковом подносе, с формованной части контроля слоем вверх. Поместите PDMS покрытием пластин кремния, содержащие толщиной 40 мкм SU8 дизайн я в тот же лоток, с PDMS покрытием вверх. Вставьте лоток в камере плазмы чистое и включить вакууме в течение 2 мин. Впоследствии, включить плазму мощность и снизить давление в камере, пока камера поворачивается светло-розового цвета. Expose обе поверхности до 18 Вт воздушной плазмы при низком вакууме в течение 2 мин.
  8. Поместите ударил PDMS блок удален из 80 мкм SU8 мастер содержащие шаблон II в конце личиночной стадии C. Элеганс или Drosophila / у рыбок данио личинки на пластиковом подносе, с формованной части контроля слоем вверх. Поместите соответствующий запеченным слой PDMS спина покрыта на кремниевой пластины, содержащей 80 мкм дизайн я для последующего C. Элеганс этапов или Drosophila / у рыбок данио личинки одновременно на одном лотке с плоским покрытием PDMS сurface вверх. Используйте тот же протокол, упомянутые выше, чтобы подвергать их воздействию плазмы воздуха.
  9. Поместите два плазменных обработанных поверхностей для C. Элеганс и / или Drosophila / у рыбок данио личинки вместе с нежным давлением и испечь их в горячей духовке конвекция воздуха при 50 ° C в течение 2 часов.
  10. Вырежьте связанных устройств кремниевой подложке с SU8 дизайн я для C. Элеганс и / или Drosophila / у рыбок данио личинки. Удар доступ отверстия на входе и выходе водохранилищах канала течения.
  11. Поместите форму таможенного PDMS на пластиковый лоток для C. Элеганс, с формованной части расчетного расхода слой вверх. Чистая покровным стеклом (22 X 22 мм, толщина № 1) и поместите его в тот же пластиковый лоток. Вставьте лоток с PDMS формы и стеклянной крышкой скольжения в камере плазмы. Предоставление доступа к нижней поверхности PDMS аппарата и стеклянной крышкой скольжения до 18 Вт воздушной плазмы при низком давлении в течение 2 мин. Поместите два плазменных обработанных поверхностей с поколенияTLE давления и испечь их в горячей духовке конвекция воздуха при 50 ° C в течение 2 часов.
  12. Храните устройство в чистой окружающей среды для использования в будущем.

3. Дополнительные шаги для дрозофилы / данио рерио устройств

  1. Предоставление доступа к чистой поверхности стекла размером 2 см х 2 см с 50 мкл tricholoro (1Н, 1Н, 2Н, 2Н-перфтороктил) силана паров в сушильном шкафу в течение 2 часов.
  2. Спин ~ 1 мл смеси 10:01 PDMS, полученного на стадии 2.1 на силанизированного поверхности стекла с помощью SPIN150 счетчик на 500 оборотов в минуту в течение 35 сек. Выпекать PDMS покрытием стеклянные подложки в горячей духовке воздух при 50 ° C в течение 6 часов с покрытием вверх. Разрешить слой PDMS, чтобы остыть до комнатной температуры, прежде чем переходить к следующему шагу.
  3. Удар покрытые слоем с помощью пользовательского построен резкий панчер металла на середину PDMS, чтобы сформировать слой PDMS прокладки. Форма металла перфоратор предназначен похож на поток дизайна для дрозофилы / у рыбок данио (L1, рис 1С
  4. Expose слоем PDMS прокладку и одной связью блок (уровень расхода и уровня управления, выполненной в шаге 2,9 для дрозофилы / у рыбок данио личинки) до 18 Вт воздушной плазмы с помощью плазменных уборщицей в низком вакууме. Поместите два плазменных обработанных поверхностей вместе и испечь их в горячей духовке воздух при 50 ° C в течение 2 часов.
  5. Вырезать связаны устройство из стекла, удар доступа отверстий на входе и выходе водохранилищ и связь его скольжение стеклянной крышкой (22 х 22 мм, толщина № 1) с использованием плазмы чистого, как указано в пункте 2.11. Это будет производить иммобилизацию устройство для первого возраста личинок дрозофилы с каналом высота ~ 500 мкм. Для рыбок данио личинки, дублируем слой PDMS прокладка процесс изготовления с дополнительным шагом связи. Двойной слой PDMS-S производит канала высотой 900 мкм в течение 30 личинок HFP рыбок данио.

Меры предосторожности: избегать частицы пыли во время работы устройства изготовления. Два плазменных очищенную поверхностьы должны быть полностью пыли для правильного соединения. Храните устройство в эксикаторе в ситуациях, когда специальные чистый номер не доступен для того, чтобы свести к минимуму накопление пыли в устройствах.

4. Использование мембранной PDMS

  1. Подключите один конец микро-гибкую трубку (внутренний диаметр ~ 1,6 мм, внешний диаметр ~ 4,8 мм) для регулятора давления газа азотом, а другой конец к основным резервуаром ловушку через 18 иглы (наружный диаметр ~ 1,25 мм) приклеить к трубе. 3-ходовой кран используется в середине трубки соединение позволяет приложению или сброс давления на мембрану.
  2. Заполните трубку, соединенную с устройством PDMS с 10 колонки см дистиллированной воды перед подключением его к резервуару из главных ловушку C. Элеганс и / или Drosophila / личинки данио устройства.
  3. Поверните клапан подачи азота читать 14 фунтов на квадратный дюйм и контролировать мембраны из главных ловушку отклоняющих к-йэлектронной проточного канала при низком увеличении инвертированного микроскопа. Длина столба воды в микро-Flex трубка сжимается, когда 3-ходовой кран открыт. Края отклоненных мембраны видны в проходящем свете (рис. 1I и 1J). Мембранные отклонение вызывает смещение частиц пыли / пузыри под мембраной PDMS и толкает их к каналу границ.
  4. Подождите, пока жидкость заполняет переднюю микроканальных полностью без каких-либо захваченного воздуха.
  5. Ослабить давление с помощью 3-х ходовой кран, чтобы расслабиться мембраны в исходное положение.

5. Установка C. Элеганс, дрозофилы и данио рерио Личинки в устройство и обездвиживания их под гибкую мембрану PDMS

  1. Заполните поток канала с M9 буфера [3 г KH 2 PO 4, 6 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl, 1 мл 1 М MgSO 4, H 2 O в 1 л, стерилизовать автoclaving] для C. Элеганс 18 или 1X PBS [8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4, 0,24 г KH 2 PO 4, H 2 O до 1 л, стерилизовать в автоклаве] для дрозофилы / личинки данио 19 за 10 мин до эксперимент.
  2. Найдите одну C. Элеганс необходимого этапа на тарелку NGM 18 (или первого возраста Drosophila личинок из яйца агаром или вручную dechorionated HPF 30 личинки данио рерио в жидкой среде 20) с использованием низких стерео микроскоп увеличением. Выбери одного животного с помощью небольшой объем буферного раствора в микро чаевых. Использование микро наконечник с конца вырезать, чтобы разместить большие Drosophila или личинки данио рерио в буфер.
  3. Нажмите на единый организм через впускной канал потока. Отрегулируйте пипетки давления в положение отдельного животного под основной ловушкой.
  4. Увеличение давления мембраны PDMS медленно, чтобы поместить животное против ЧанNel границы и обездвижить его с 14 фунтов на квадратный дюйм давления для C. Элеганс, 7 фунтов на квадратный дюйм для дрозофилы и 3 фунтов на квадратный дюйм для рыбок данио личинки.
  5. Установите иммобилизованных животных в центре микроскопического поля зрения. Использование инвертированного микроскопа на нужные настройки для высокого разрешения светлом поле или флуоресценции. Приобретать одного или замедленной флуоресценции изображений в заданных частоте кадров.
  6. Отпустите ловушку давление и контролировать передвижение животного в течение 5-10 мин при малом увеличении.
  7. Промойте животных и вставить новое животное, чтобы повторить описанные выше шаги.
  8. Вымойте все животные из отходов резервуара с помощью дистиллированной воды наносится с помощью шприца. Высушите канал путем нажатия воздуха с помощью шприца для повторного использования в будущем.

Меры предосторожности: животные, требующие повышенной пипетирования давления потока внутри основного канала, как правило, показывают бедных передвижения / здоровье после освобождения из ловушки и следует избегать IMAненности ВИЧ варьируется. Очистите канал для потока никаких следов буфером для предотвращения засорения канала кристаллов. Если масло используется для изображения с высоким разрешением, очистить скольжения стеклянной крышкой, чтобы иметь возможность поддерживать хорошие отношения сигнал-шум для последующих экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Иммобилизации устройства двухслойной блоке PDMS изготовлены путем склеивания двух слоев: слоя потока (Layer 1) и контроля слой (Layer 2), как показано на рисунке 1. Основная ловушка соединена с цилиндром азота через регулятор и 3-ходовой запорный кран применять необходимые (3-14 бар) давлением на мембрану через столб жидкости (рис. 1А). Отклоняются мембрана удерживает C. Элеганс, Drosophila или личинки данио рерио в потоке канала разработаны с различными размерами (рис. 1В и 1С). Фото маски используются для разработки слои иммобилизации устройства с различной геометрией для C. Элеганс (рис. 1D), личинки дрозофилы (рис. 1F) и рыбок данио личинки (рис. 1Г). Канал высота слоя потока (h1 на рисунке 1E, 1K) изменялась при различных скоростях покрытия спина для размещения илиорганизмов разных диаметров внутри потока канала. Высота потока слоя были изготовлены в 40 мкм, 80 мкм, 500 мкм и 900 мкм для C. Элеганс личиночной стадии, взрослые C. Элеганс, в первую возраста личинок дрозофил и рыбок данио личинки соответственно (табл. 1). Устройство с высоты потока канала 40 мкм подходит от L1 до L4 рано C. Элеганс личинок. Устройство с 80 мкм высота канале используется для конца L4 личинок и взрослых C. Элеганс, когда вульвы начинает выступать. Чем больше устройств рыбок данио также может быть использован для старших личинок дрозофилы. Толщина мембраны PDMS (м) была изготовлена ​​в 40 мкм и 300 мкм для C. Элеганс и дрозофилы / у рыбок данио устройств соответственно. Высота микрофлюидных каналов в слое 2 был изготовлен в 40 мкм для ранней личиночной стадии C. Элеганс и 80 мкм в конце личиночной стадии C. Элеганс и Drosophila/ Рыбок данио личинки. Высота потока канала, мембрана и канал управления были измерены в устройства изготовлены в нескольких независимых партий и были обнаружены быть последовательными в пределах ± 5 мкм друг от друга. Устройство использует технологию мембранной отклонения (рис. 1Н-J) для иммобилизации микроорганизмов в потоке канала.

Микроорганизмы Поток канала (PDMS-1) Побочные условия для проточного канала Spacer PDMS (PDMS-S) Спин условия для Spacer PDMS Иммобилизация давление (бар)
C. Элеганс (L1 до начала L4) 40 мкм (SU8-2025) 500 оборотов в минуту (5 сек), 2000 оборотов в минуту (30 секунд) Не Доступно Не Доступно 14
C. Элеганс (в конце L4 и взрослых) 80 &му, т (SU8-2050) 500 оборотов в минуту (5 сек), 2000 оборотов в минуту (30 секунд) Не Доступно Не Доступно 14
Drosophila (первый возраст) 80 мкм (SU8-2050) 500 оборотов в минуту (5 сек), 2000 оборотов в минуту (30 секунд) 400 мкм (PDMS) 500 оборотов в минуту (35 секунд) 7
Данио рерио (30 HPF) 80 мкм (SU8-2050) 500 оборотов в минуту (5 сек), 2000 оборотов в минуту (30 секунд) 2X 400 мкм (PDMS) 500 оборотов в минуту (35 секунд) 3

Таблица 1. Размеры устройства канала течения (PDMS-1) и прокладку слой PDMS (PDMS-S), используемые в C. Элеганс и дрозофилы / у рыбок данио устройств.

C. Элеганс L4 личинки были обездвижены в 80 мкм высоты канала PDMS микрофлюидных устройство с использованием 14 фунтов на квадратный дюйм азота (рис. 2A). Замедленной флуоресценции изображений сопрежде чем приобрела со скоростью 2 кадра в секунду (FPS) с использованием 60X цель (числовой апертурой 1,4, масло цель) для работы с изображениями транспорта митохондрий визуализированы с помощью митохондрий целевых GFP на сенсорной рецепторы нейронов 21. Все 400 кадров были преобразованы в kymographs использованием ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ц ) и митохондрии были классифицированы как anterogradely направлены (подальше от тела клетки), ретроградно направлен (по направлению к телу клетки) или стационарными (рис. 2E). Мы наблюдали митохондриального транспорта до 21 фунтов на квадратный дюйм иммобилизации давления, но поток был несколько больше по самым низким иммобилизации давления. Антероградной и ретроградного потока митохондрии были измерены равным 1,1 ± 0,23 и 1,6 ± 0,22 в 7 фунтов на квадратный дюйм, тогда как 0,8 ± 0,25 и 1,2 ± 0,34 в 14 фунтов на квадратный дюйм давления иммобилизации. Значения были статистически не отличается от 1,1 ± 0,33 и 1,3 & Plusmn; 0,42 получены от животных, иммобилизованных с использованием 3 мМ левамизол (р-значения> 0,45, п = 30 животных).

Чем больше устройств с высотой 500 мкм может быть использован для иммобилизации первого возраста личинок дрозофилы (рис. 2В) и 28-30 HPF личинки данио рерио (рис. 2D). Препарирование первые личинки дрозофилы возрастов может быть сложной задачей. В отличие от микрофлюидных устройства обеспечивают метод для выполнения высоком разрешении светлого поля и / или флуоресцентной микроскопии с использованием интактных организмов. Индивидуальные личинки дрозофилы были обездвижены с использованием 7 фунтов на квадратный дюйм газа сжатого азота (рис. 2Б, таблица 1) и флуоресцентные изображения транспорта synaptotagmin.eGFP в сенсорных нейронах были приобретены (рис. 2С). Замедленной фильмы показали, подвижных и неподвижных synaptotagmin заметное грузов в сенсорных нейронах (рис. 2F). Средняя антероградной и ретроградная скорость была измерена с Кимographs быть 0,92 ± 0,04 мкм / с и 1,00 ± 0,05 мкм / с соответственно (п = 6 животных, п> 40 сегментов). Это сопоставимо с скоростями synaptotagmin проведении транспортной везикулы измеряется в расчлененных Drosophila моторных нейронов перемещения как anterogradely (0,84 ± 0,05 мкм / с) и ретроградно (0,76 ± 0,03 мкм / с) 22.

Подобные устройства с высоты 900 мкм были использованы для иммобилизации различных стадиях личинки данио рерио (рис. 2D, таблица 1). Данио рерио личинок на ранних стадиях развития переворачивает ее хвост каждые 10 до 15 сек и, как правило, иммобилизованных использованием 0,02% Tricaine (MS-222) в растворе или на монтаж средств массовой информации для высокое разрешение изображений 23. Наши PDMS устройство обеспечивает альтернативное средство для быстрого иммобилизации и устраняет необходимость в ненадежных монтаж среды в оптическом тракте при высокой разрешающей способностью 24. Мы вручную dechorionated 28-30 HPF личинок и иммобилизованных их по отдельности в устройство PDMS с помощью 3 пси газообразного азота приобрести покадровой фильмы личинок сердцебиение. Скорость сердцебиения было измерено, 136,8 ± 1,6 в минуту (N = 8 фильмов) и был похож на другие опубликованные отчеты 25.

Наш простой микрофлюидных устройство уже было продемонстрировано для измерения различных субклеточных и клеточных событий в дикого типа C. Элеганс 4. В нашем микрофлюидных устройство, дикого типа C. Элеганс показать большее количество грузов, таких как синаптические пузырьки, которые перемещаются в нейронах по сравнению с животными, которые закреплены использовании анестетиков. Тем не менее, мы не проверяли наши устройства для мутантных животных, чтобы видеть, если эти выводы верны. Чтобы проверить это, мы использовали сильный гипоморфных мутанта в kinesin3 / UNC-104 молекулярный мотор, UNC-104 (e1265), который транспортирует пресинаптических пузырьках 26. Мы сравнили поток GFP :: RAB-3 заметно пресинаптических весичастиц в переднем боковом mechanosensory нейронов в анестетика иммобилизованных и устройства иммобилизованных мутант aniamls (рис. 3А). Поток предварительно синаптических пузырьков было больше потока в устройстве иммобилизованных животных по сравнению с данными, полученными из UNC-104 животных под наркозом в 1 мМ левамизол (рис. 3В, 3С) ​​27. Это показывает, что изображение сильных транспорта дефектных мутантов в микрофлюидных устройств, вероятно, будет более эффективным средством сбора данных. Мы также показываем, что другие грузы например, транспорт дендритных рецепторов глутамата в нейронах URY может быть отображена в устройстве иммобилизованных животных (рис. 3D, 3E). Устройство также может быть использована для изображения клеточных процессов во время раннего C. Элеганс развития, таких как Q нейробластов дивизии в L1 животных. QR ячейка отображаемого разделить с образованием двух дочерних клеток QR.a и QR.p ~ 3 часа после вылупления (рис. 3F) в соответствии сРанее наблюдений 28.

Таблица 1. Размеры устройства канала течения (PDMS-1) и прокладку слой PDMS (PDMS-S), используемые в C. Элеганс и дрозофилы / у рыбок данио устройств.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение PDMS микрофлюидных устройств для генетических модельных организмов. (A) организма загружается с помощью микро-наконечник в канал течения и иммобилизованных сжатым азотом управляется с помощью регулятора и клапана. Устройство подходит для светлого поля / флуоресценции в инвертированного микроскопа. Конструкция состоит из 10 мм канале (дизайн я, L1) и канал управления (проектирование II, L2), соответственно, для C. Элеганс (B) и дрозофилы / личинки данио (C). Размеры указаны по проектированию (B и C). (D, F, G) Схема различнс слоями PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS мембраны, PDMS-S и стекла), присутствующие в C. Элеганс, дрозофил и рыбок данио иммобилизации устройства. (E) Схематическое изображение поперечного сечения прибором, показывающим основной слой PDMS (PDMS-2), спина покрытые слоем PDMS (PDMS-1), чтобы сформировать гибкую мембрану и прокладку слой PDMS (PDMS-S), чтобы добавить Высота в потоке канала (для дрозофилы / у рыбок данио устройства). Вся структура связана необратимо оптического качества покровным стеклом, чтобы приспособить организм (круг в коричневый цвет). Схема указывает высоту 'h2' канала управления, 'H1' проточного канала, перфорированный разделительный слой 'S' и толщина мембраны "м". (H) показывает отклонение мембраны к потоку канала в присутствии столба жидкости под давлением в канал управления. Яркие образы поля показаны свободной (I) и отклоняется мембраны (J) при нулевом и 14 фунтов на квадратный дюйм давление столба жидкости соответственно. Стрелки и стрелки указывают пузыря иnder и из мембраны в потоке канала соответственно. (K) поперечного сечения образ C. Элеганс устройства, принятых на расположение иммобилизации области. Шкала бар составляет 50 мкм (К) и 200 мкм (I, J). (D, F, G) Схемы не в масштабе. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2
Рисунок 2. Изображений генетических организмов модели, иммобилизованных в микрофлюидных устройства. Яркое изображение области иммобилизованных C. Элеганс (A), первая возраста личинок дрозофилы (B) и 30 HPF личинки данио (D) в устройстве PDMS микрофлюидных. Кимографа анализ замедленная съемка jsIs609, C. Элеганс напряжение, выразив митохондрий целевых GFP в передних боковых mechanosensory нейрона (ALM) устройства Immobilзуется животных (E). Митохондрии классифицируются как антероградной («вниз» стрелки), ретроградная ("вверх" стрелки) и стационарные (марка «звезда») в кимографе. (C) флуоресценции изображение из целой первой взрослой личинки дрозофилы. В коробке указывает на место, где высокое разрешение покадровой визуализации syt.eGFP транспорта осуществляется в холинергических нейронов. Монтаж пять кадров приобрела на 5 Гц с рамкой номера указаны на каждом изображении и GFP заметный груз показано, как антероградной, ретроградные и стационарные в монтаже (F). В окне (D) указывает на область, которая контролировалась для расчета скорости сердцебиения у рыбок данио личинки. Шкала бар 5 мкм (F), 10 мкм (E), 100 мкм (A, B) и 200 мкм (D).

Рисунок 3
Рисунок 3. Клеточные и субклеточные изображений в C. Элеганс использованием PDMS микрофлюидных устройств. (А) Схема муравьевerior боковой mechanosensory (ALM) нейрон с антероградной и ретроградного направления обозначены. Пунктирная рамка показывает область отображаемого для аксонального транспорта. 350 кадров, приобретенный с помощью вращающийся диск конфокальной микроскопии в 5 кадров в секунду с телом клетки (ЦБ) на правой и нервное кольцо (NR) слева. Данные анализировались с помощью kymographs для животных, иммобилизованных в устройстве или с помощью 1 мМ левамизол (C). Груза, перевозимого антероградной и ретроградная направления отображаются с помощью стрелки "вниз" и "вверх" соответственно. (B) антероградной и ретроградного потока частиц, наблюдаемых в UNC-104 (e1265) животных в 20 мкм области ALM нейрона более 350 покадровой кадров. (D) Схема нейронных URY используется для изображений GFP отмечены глутамата транспортных рецепторов. 350 покадровой кадры превращаются в kymographs, которые показывают грузов, движущихся в антероградной и ретроградного направления в животных, иммобилизованных в устройстве PDMS или с помощью 1 мМ левамизол (E). Покадровый изображений, полученных во время Q нейробластов дивидение и миграции в начале личиночной стадии C. Элеганс. (F) Три покадровой кадры, которые показывают QR проходит разделение сформировать свои дочерние клетки QR.a и QR.p. Шкала бар 5 мкм (C, E и F). Данные, представленные в (В), среднее ± SEM (п> 4). Сравнение производится по отношению к значениям, полученным в анестезии и обозначается * (р <0,05) и ** (р <0,005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS микрофлюидных устройств оптически прозрачным, следовательно, может быть использована для высокого разрешения в естественных изображений любых прозрачных / полупрозрачных моделей организма. Наш дизайн подходит для больших увеличениях пространственно-временных изображений клеточных и субклеточных событий в интактных живых животных. Микротехнологий помощью мягкой литографии позволяет легко манипулировать размерами устройства для различных размеров модельных организмов. Устройства различных размеров изготавливаются для различных стадий C. Элеганс, личинки дрозофил и рыбок данио личинки. Устройства с различной высотой 40 мкм и 80 мкм в их проточных каналов слоя показать улучшилось иммобилизации и лучше после визуализации здоровья как ранние (L1), а позже (в конце L4) этапа C. Элеганс соответственно. Мы достигаем 100% успеха в устройство для изготовления C. Элеганс и дрозофилы / у рыбок данио без дефектных устройств. Устройства могут быть использованы несколько раз, покаКанал управления загрязненных частиц пыли или бактериального роста. Устройство иммобилизованных C. Элеганс проявлять больше грузов потока в обоих дикого типа и мутантных животных по сравнению с anesthesized животных. Устройство иммобилизации устраняет необходимость в технически сложных рассечение протоколов, особенно для ранних стадий развития личинок дрозофилы 29.

Мгновенная протоколов иммобилизации в PDMS микрофлюидных устройств имеют неотъемлемое преимущество сокращения времени эксперимента по сравнению с обычно больше время экспозиции для внешнего применять обезболивающие средства. Все иммобилизованных организмов вернуться к нормальному передвижению в течение 5-10 мин после выхода давление на деформируемый мембраны PDMS. C. Элеганс закреплены на границе течения в канале и далеко от центральной части иммобилизации мембраны. Животные иммобилизованных в середине канала течения показывают плохое состояние здоровья после immobilizaния и умирает в течение одного-двух дней. Наши микрофлюидных устройство было использовано для держать L4 этапе C. Элеганс иммобилизованных на срок до часа под мембраной без ущерба для его здоровья или последующего развития. Животные иммобилизованных на короткое время (до 10 мин) могли бы оказаться в несколько раз для визуализации. Для ранних стадий развития, C. Элеганс были обездвижены с несколько более низким давлением (7 фунтов на квадратный дюйм) на более длительный срок покадровой экспериментов (~ 3 часа). Животные иммобилизованных под мембраной после освобождения остались в том же устройстве в этот промежуток времени. Эти животные сравнимы с диким типом и в их развитие и общее состояние здоровья. Взрослые C. Элеганс иммобилизованных с более низким давлением (7 фунтов на квадратный дюйм) показали медленный дрейф в высоком разрешении покадровой экспериментов и требуют сложных инструментов анализа транспортных анализа. Однако более низких давлениях были использованы для выполнения долгосрочных исследований, таких как Q нейробластов деление клеток / миграции на ~ 3 часа или полуколичественного mitochondria транспортных характеристик; процессы, которые не нуждаются в полной иммобилизации. Таким образом, низкое давление иммобилизации могут быть использованы в зависимости от набора данных, которые необходимо собрать.

Замедленной съемке L4 C. Элеганс показывает скачкообразное движение GFP отмечены митохондрии в ALM нейрона (штамм jsIs609), как уже сообщалось нейронов в других системах модель 30-32. Некоторые митохондрий в этих нейронов показать двунаправленного транспорта, а большинство из них являются стационарными в течение срока действия фильма. Несмотря на небольшие различия в потоке мы по-прежнему с использованием 14 фунтов на квадратный дюйм иммобилизации давления в случае C. Элеганс для получения полной иммобилизации и избежать дрейфа в высоком разрешении замедленная съемка аксонального транспорта. Мы предлагаем использованием 14 фунтов на квадратный дюйм в общем протоколе и в зависимости от потребностей экспериментальных Это может быть увеличена или уменьшена. Животные потребовалось почти то же самое время, чтобы вернуться к нормальному locomotioп от низших и высших иммобилизации давления и иммобилизованных животных развивались одинаково для тех, выращенные без иммобилизации.

Устройство, когда изготовлены с использованием больших размеров с проставкой слои могут быть использованы для больших модельных организмах, таких как Drosophila и рыбок данио личинки. Визуализация synaptotagmin.eGFP транспорта в неповрежденном первом возраста Drosophila сенсорных нейронов показывает, активного транспорта в обоих антероградной и ретроградная направлениях. Средняя скорость измеряется в устройстве иммобилизованных личинки выше по сравнению с величинами, измеренными в расчлененных моторных нейронов 22. Эта разница может возникнуть в результате быстрого сбора данных в наших экспериментах (5 Гц В / с 1,1-1,4 Гц), специфичные для нейронов различия в органеллы транспорта (сенсорная V / S моторных нейронов) и / или эффекты, связанные с рассечение.

Наше предварительное эксперименты проводились исключительно на диких животных типа 4, таким образом, мы определить, является ливизуализации мутантов в микрофлюидных устройств была также выгодна. Время изображений в заданный промежуток С. Элеганс L4 животных показывает уменьшить поток GFP :: RAB-3 заметно предварительно синаптических пузырьков в kinesin3/unc-104 мутантов, иммобилизованных в 1,0 мМ левамизол по сравнению с потоком измерений, полученных на животных иммобилизованных с помощью нашего устройства PDMS (рис. 3В). Мы часто наблюдали и показать пример (рис. 3), что в мутантов очень мало транспорта наблюдается, если животные иммобилизованных использованием анестезирующих концентрациях, которые иммобилизации диких животных типа. Количество пузырьков, движущихся в UNC-104 животных значительно выше, когда мы используем микрофлюидных устройств. Наркотизированных животных показывают, что аналогичные транспортные характеристики при помещении под 14psi давление на мембрану PDMS (рис. 3В). Аналогичные наблюдения были также сделаны в диких животных типа 4. Эти данные позволяют предположить, что увеличение потока не могут возникнуть из чатамобилизация азота, но из-за протокол, который был менее вредными для внутриклеточного транспорта.

В принципе, других мероприятий, таких как кальций динамики и деление клеток могут быть отображены в неповрежденном Drosophila / личинки данио рерио, а также. После восстановления изображений устройства иммобилизованных животных является менее вредным для организма жизнеспособность 4 и поэтому такие устройства также могут быть использованы для выполнения долгосрочных визуализации генетической модели генетических организмов, предназначенных для событий, которые происходят в течение длительных временных масштабах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Krishanu Ray для акций Drosophila, Tarjani Agarwal для поддержания дрозофилы клетки, Петр Juo для nuIs25 и CGC для C. Элеганс штаммов. SPK сделал jsIs609 в лаборатории Майкла Нонет в. Мы благодарим Arpan Агнихотри (BITS Pilani) за помощь в покадровой визуализации митохондрий перевозки jsIs609 животных в микрофлюидных устройств. Мы благодарны д-р ватсала Thirumalai и Сурия Пракаш за предоставление нам эмбрионов рыбок данио. Мы благодарим доктора Кришны и CIFF в НКО для использования вращающийся диск конфокальной микроскопии при поддержке Департамента Науки и Технологии-центр нанотехнологий (№ SR/55/NM-36-2005). Мы также благодарим Kaustubh Рау, В. Венкатраман и Четана Sachidanand для обсуждения. Эта работа финансировалась DBT пост-докторские стипендии (SM), DST ускоренной схеме (SM) и DBT гранта (SPK). SA была поддержана DST и CSIR гранты SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Биоинженерия выпуск 67 молекулярной биологии неврологии Microfluidics, личинки данио рерио обезболивающее предварительно синаптических везикул транспорта дендритные транспортных рецепторов глутамата митохондриальный транспорт synaptotagmin транспорта сердцебиение
Простой микрофлюидных устройства для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация<em&gt; C. Элеганс</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; И данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter