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Bioengineering

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치 Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해 개발되었습니다

Abstract

마이크로 가공 유체 장치는 작은 생물의 생체 연구에 대한 접근 마이크로 환경을 제공합니다. 간단한 제조 공정은 소프트 리소그래피 기술 1-3을 사용하여 마이크로 유체 장치에서 사용할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치는 생체 레이저 미세 2,6 및 셀룰러 이미징 4,7에서 하위 세포 이미징 4,5에 사용되었습니다. 생체에서 영상이 생물의 고정이 필요합니다. 이것은 흡입 5,8을 사용하여 달성되었습니다 테이퍼 채널 6,7,9, 변형 멤브레인 2-4,10, 추가 냉각 5, 마취 가스 11, 온도에 민감한 젤 12, 시아 노 아세틸렌 접착제 13 등 levamisole 14 등 anesthetics와 흡입 15. 일반적으로 사용 anesthetics는 시냅스 전송 16,17 영향을 미치는와 하위 세포 neuronal 교통 4 해로운 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 이 성에서udy 우리는 Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레로 그대로 유전 모델 생물의 마취 무료로 고정 할 수 있습니다 폴리 디메틸 실록산 - (PDMS) 장치 기반 멤브레인을 보여줍니다. 이 모델 생물로 인해 자신의 작은 직경과 광학적 투명 또는 반투명 기관의 마이크로 유체 장치에서 생체의 연구에 적합합니다. 바디 직경은 C.의 조기 애벌레의 단계에 대해 ~ 10 μm ~ 800 μm의에 다양 elegans와 zebrafish 애벌레와 고해상도 시간 경과 영상에 대한 완전한 고정을 달성하기 위해 서로 다른 크기의 마이크로 유체 장치가 필요합니다. 이 생명체는 액체 열을 통해 압축 된 질소 가스에 의해 적용 역 현미경을 사용하여 이미지로 압력을 사용하여 고정합니다. 함정에서 출시 된 동물은 10 분 이내에 정상 운동으로 돌아갑니다.

우리는 C.에 시간 경과 영상의 네 개의 응용 프로그램을 보여줍니다 elegans즉, 뉴런의 이미지 mitochondrial 교통, 교통 - 결함이있는 돌연변이, glutamate 수용체 운송 및 Q의 neuroblast의 세포 분열에 미리 신경 소포 전송. 같은 영화에서 얻은 데이터는 마이크로 유체 고정이 anesthetized 동물 (그림 1J와 3C-F 4)에 비해 휴대 및 하위 세포 사건의 생체 데이터를 수집하는 유용하고 정확한 방법입니다 보여줍니다.

장치 크기가 C. 서로 다른 단계의 시간 경과 영상을 허용하도록 변경되었습니다 elegans 먼저 instar Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 감각 뉴런에 GFP (syt.eGFP)로 태그를 synaptotagmin로 표시 소포의 운송은 그대로 첫번째 instar Drosophila의 애벌레의 cholinergic 감각 뉴런으로 표현 시냅스 소포 마커의 이동 움직임을 보여줍니다. 유사한 장치 ~ 30 시간 게시물 수정을 (hpf)에 심장 박동의 시간 경과 영상을 수행하는 데 사용되었습니다애벌레를 zebrafish. 이러한 데이터는 우리가 개발 한 간단한 장치가 생체에 여러 세포 생물학 및 발달 현상을 연구하는 모델 시스템의 다양한에 적용 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다.

Protocol

1. SU8 마스터 제작

  1. Clewin 소프트웨어를 사용하여 마이크로 유체 구조를 설계하고 회로 기판 필름 8 μm의 최소 기능 크기 65,024 DPI 레이저 플로터를 사용하여 인쇄 할 수 있습니다.
  2. 흐름 층과 상응하는 제어 계층에 대해 하나의 웨이퍼 각, 1 분 및 탈 이온수에 씻어 20 % 코에서 네이티브 산화를 2cm X 2cm 실리콘 웨이퍼를 청소합니다.
  3. 질소 가스로 조각을 건조 4 시간에 120 ° C에서 핫 플레이트에 탈수 불어. 조각이 다음 단계로 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  4. 장소 실리콘 조각 스피너 척에 한 번에 한하고 진공을 설정합니다. ~ 20 μl 헥사 메틸 디 실라 잔 - (HMDS)와 코트들을 사용하여 초, 30 초에 3,000 rpm에서 다음 5 500 rpm으로 SPIN150 회 전자.에게로 실리콘 표면을 커버
  5. SU8-2025의 ~ 1.5 ML (와 완전히 실리콘 웨이퍼를 커버 http://를www.microchem.com/Prod-SU82000.htm)과 5 초 500 rpm으로 SPIN150 스피너를 사용하여 코트 웨이퍼는 30 초에 2,000 RPM이 나타납니다. 이 회전 프로토콜은 C.의 조기 애벌레의 단계에 대한 제어 및 흐름 층에 적합합니다 ~ 40 μm의 포토 레지스트 두께를 생산 elegans.
  6. 스핀 ~ 5 500 rpm으로 SPIN150 스피너를 사용하여 1.5 ML SU8 - 2050 초는 C의 말 애벌레의 단계에 대한 흐름 계층 제조에 적합합니다 ~ 80 μm의 포토 레지스트 두께를 얻기 위해 30 초에 2,000 RPM 다음 elegans, Drosophila / zebrafish 애벌레와 해당 컨트롤 레이어에 대한 기저 유량 층.
  7. 상단에있는 SU8 코팅 레이어와 핫 플레이트에 실리콘 조각을 놓으십시오. 소프트 베이킹 65 코팅 실리콘 조각 ° C 10 분 동안 95 ° C에 이어 1 분에. 조각이 다음 단계로 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  8. SU8-2025 코팅 쉬르로 노출 무대에서 부드러운 구운 실리콘 조각을 놓으십시오UV 램프를 직면 상단에있는 얼굴. C.의 조기 애벌레의 단계에 대한 각각의 흐름 계층과 제어 계층 패턴을 설계 I (L1, 그림 1B) 및 설계 II (L2, 그림 1b)와 사진 마스크를 사용하여 elegans. SU8 층의 상단에있는 사진 마스크​​를 놓고 마스크가 코팅 층에 대한 평평 보장합니다. UV 램프의 셔터를 열고 15 초 동안 사진을 마스크를 통해 200 와트 UV 램프에 부드러운 구운 SU8 웨이퍼을 쉽게받을 수 있습니다.
  9. C. 월말 애벌레의 단계에 대한 흐름 계층과 제어 계층을 조작하는 (단계 1.6에서 작성) SU8-2050 코팅 조각에 설계 I (L1, 그림 1B) 및 설계 II (L2, 그림 1b)와 사진 마스크를 사용하여 elegans. (I을 준비 SU8-2050으로 코팅 웨이퍼에 Drosophila / zebrafish 애벌레에 대한 각각 기저 흐름 계층과 제어 계층을위한 디자인 I (L1, 그림 1C) 및 설계 II (L2, 그림 1C)와 사진 마스크를 사용하여N 단계 1.6). 15 초에 200 와트 UV 램프에 사진 마스크​​를 통해 SU8 표면을 쉽게받을 수 있습니다.
  10. 상단에 코팅 층과 핫 플레이트에 노출 된 실리콘 조각을 놓으십시오. 10 분 동안 95 ° C에 이어 1 분에 65 ° C에서 웨이퍼를 구워 게시합니다. 조각이 다음 단계로 진행하기 전에 냉각 할 수 있습니다.
  11. 20 분의 SU8 개발자 솔루션을 사용하여 조각을 개발할 수 있습니다. 이소 프로필 알코올 (IPA)의 조각을 씻어 건조하여 질소 가스를 불어.
  12. 상단에있는 SU8 패턴으로 건조기의 실리콘 조각을 놓으십시오. tricholoro 50 μl (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 시간을위한 건조기에 실란 증기로 코팅 조각.

주의 사항 : 코 처리, 포토 레지스트 코팅 및 개발 기간 동안 화학 물질 취급에 대한 안전주의 사항을보십시오. 실란 증기 코팅은 통풍이 지역에서 건조기 내에서 수행해야합니다. 보호 SU8 빛에 노출 이상에서 저항. UV lig와 보호용 안경을 사용하여HT 소스.

2. PDMS 금형 제작

  1. 플라스틱 컵에 경화 에이전트 5g과 Sylgard 184베이스 50g를 결합하여 10시 1분 PDMS를 준비합니다. ~ 3 분 동안 수동으로 내용을 섞는다. 혼합하는 동안 형성된 모든 기포를 제거 할 수있는 건조기 내부의 가스를 제거하다의 혼합물.
  2. 기포 형성을 피하기 위해 부드럽게, 제어 계층을 위해, 디자인 II의 SU8 패턴을 실리콘 웨이퍼 위에 5mm 두께 PDMS 혼합물을 부어. 경우 거품은 모든 거품을 제거하는 낮은 진공의 SU8 패턴에 가스를 제거하다 PDMS를 주입하는 동안 형성된다.
  3. 스피너 척에 흐름 층을 위해 디자인 I의 SU8-2025 패턴으로 실리콘 웨이퍼를 배치하고 잡아 진공을 설정합니다. ~ 1 PDMS 믹스의 ML와 코트 5 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용하여 웨이퍼와 웨이퍼를 커버 초는 30 초에 1,500 RPM이 나타납니다.
  4. 코트 ~ 디자인 I (L1, 그림 1b)의 SU8-2050 패턴 80 μm와 실리콘 웨이퍼에 1 ML PDMS 혼합, 용C. 월말 애벌레의 단계에 대한 흐름 층 5 초 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용 elegans는 30 초에 1,000 RPM이 나타납니다. 코트 35 초 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용 Drosophila / zebrafish 애벌레에 대한 흐름 계층 설계 I (L1, 그림 1C)의 SU8-2050 패턴과 실리콘 조각에 PDMS 믹스의 두꺼운 층.
  5. 디자인의 굽 PDMS 코팅 실리콘 조각은 I 및 제어 계층에 대한 해당 디자인 II와 웨이퍼는 C.에 PDMS를 포함하는 50 뜨거운 공기 대류 오븐에 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레 ° 6 시간에 C.
  6. C.에 대한 SU8 패턴 II를 포함하는 실리콘 기판에서 PDMS 조각을 잘라 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레는 날카로운 칼날을 사용합니다. 해리스 구멍을 뚫는를 사용하여 PDMS 금형의 주요 함정을 연결하는 저수지 상단에 ~ 1mm 직경의 작은 구멍을 펀치.
  7. 천공 PDMS 블록을 (제어를위한 40 μm 두께의 금형을 포함하는 장소최대 직면하고있는 제어 계층의 성형면과 플라스틱 트레이에 레이어 L2). PDMS 코팅 표면이 위로 향한와 같은 트레이에 40 μm 두께의 SU8 디자인 I가 포함 된 PDMS 코팅 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 플라즈마 클리너의 챔버 내부 트레이를 넣고 2 분의 진공을 설정합니다. 그 후, 플라즈마 전원을 켜고 챔버 색 빛 핑크색을 화나게 할 때까지 챔버 압력을 낮 춥니 다. 2 분을위한 저 진공에서 18 와트 공기 플라즈마에 두 표면을 쉽게받을 수 있습니다.
  8. C. 월말 애벌레의 단계에 두꺼운 SU8 마스터 포함하는 패턴 II 80 μm에서 제거 천공 PDMS 블록을 삽입합니다 최대 직면하고있는 제어 계층의 성형면과 플라스틱 트레이에 elegans 나 Drosophila / zebrafish 애벌레. 나중에 C.에 대한 I 80 μm 두께의 디자인을 포함하고있는 실리콘 웨이퍼에 코팅 해당 구운 PDMS 층 스핀을 놓습니다 elegans 단계 또는 평면 PDMS 코팅의와 동일한 트레이에서 동시에 Drosophila / zebrafish는 애벌레urface가 마주보고 있습니다. 같은 프로토콜을 사용 공기 플라즈마에 노출하기 위해 위에서 언급 한.
  9. C.에 대한 두 개의 플라즈마 처리 표면을 배치 elegans 및 / 또는 함께 부드러운 압력과 2 시간에 50 ° C에서 그들을 뜨거운 공기의 대류 오븐에서 빵을 구워과 Drosophila / zebrafish 애벌레.
  10. C.에 대한 SU8 디자인 I와 실리콘 기판에서 보세 장치를 잘라 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레. 펀치 액세스 유동 채널의 입구와 출구 저수지에서 구멍.
  11. C.를위한 플라스틱 트레이에 보세 PDMS 금형을 배치 최대 직면하고있는 유동 레이어 디자인의 성형 측면과 elegans. 클린 유리 커버 슬립 (22 X 22mm, 제 1 두께) 같은 플라스틱 트레이에 놓습니다. PDMS 몰드와 플라즈마 챔버 내부에 유리 커버 슬립이 포함 된 트레이를 삽입합니다. 맨 아래 장치의 PDMS 표면과 유리 커버 슬립 18 2 분에 대한 낮은 압력의 와트 공기 플라즈마를 쉽게받을 수 있습니다. 세대와 함께 두 개의 플라즈마 처리 표면을 배치tle 압력과 2 시간에 50 ° C에서 그들을 뜨거운 공기의 대류 오븐에 구워.
  12. 나중에 사용할 수 있도록 깨끗한​​ 환경에서 장치를 저장합니다.

3. Drosophila / Zebrafish 장치에 대한 추가 단계

  1. 깨끗한 유리 크기의 표면 2cm tricholoro의 50 μl와 X 2cm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 시간을위한 건조기에 실란 증기.를 노출
  2. 스핀 ~ 35 초 500 rpm으로 SPIN150 회 전자를 사용하여 silanized 유리 표면에 단계 2.1 준비 10시 1분 PDMS 믹스 1 ML. 최대 직면하고있는 코팅면 6 시간 50 ° C의 뜨거운 공기 오븐에서 PDMS 코팅 유리 기판을 구워. PDMS 층이 다음 단계로 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  3. 펀치 PDMS 스페이서 층을 형성하기 위해 PDMS의 중간에서 사용자 정의 구축 날카로운 금속 구멍을 뚫는를 사용하여 코팅 층. 금속 구멍을 뚫는의 모양은 Drosophila / zebrafish의 흐름 설계 (L1, 그림 1C와 비슷한 설계되어 있습니다
  4. PDMS 스페이서 층과 낮은 진공에서 플라즈마 클리너를 사용하여 단일 보세 블록 (Drosophila / zebrafish 애벌레에 대한 단계 2.9에서 만든 흐름 계층과 제어 계층) 18 와트 공기 플라즈마에 노출. 함께 두 개의 플라즈마 처리 표면을 놓고 50 뜨거운 공기 오븐 ° C 2 시간 동안을 구워.
  5. 유리 접합 장치를 잘라 입구와 출구 저수지와 단계 2.11에서 설명 드린 바와 같이 플라즈마 클리너를 사용하여 유리 커버 슬립 (22 X 22mm, 제 1 두께)에 본드를의 펀치 액세스 구멍. 이 ~ 500 μm의 채널 높이 첫번째 instar Drosophila의 애벌레에 고정 장치를 생산합니다. zebrafish의 애벌레를 들어, 추가 본딩 단계로 PDMS 스페이서 층 제조 공정을 복제. PDMS-S의 듀얼 레이어 30 hfp zebrafish의 애벌레 900 μm의 채널 높이를 생산하고 있습니다.

주의 사항 : 장치 제조 중에 먼지 입자를하지 마십시오. 두 플라즈마 표면을 청소s은 (는) 올바른 결합을 위해 무료 완전히 먼지가 있어야합니다. 특별한 클린 룸이 장치에서 먼지 입자의 축적을 최소화하기 위해 사용할 수없는 상황에서 건조기에 장치를 저장합니다.

4. PDMS 막 사용

  1. 18 게이지 바늘 (외경 ~ 1.25 mm)를 통해 가압 질소 가스 공급 조정기와 주요 트랩 저수지에 다른 쪽 끝으로 마이크로 플렉스 튜브 (내경 ~ 1.6 mm, 외경 ~ 4.8 mm)의 한쪽 끝을 연결합니다 관에 접착. 튜브 연결의 중간에 사용되는 3 방향 꼭지는 막에 응용 프로그램 또는 압력을 릴리스 할 수 있습니다.
  2. C.의 주요 트랩의 저수지에 연결하기 전에 증류수 10cm 열로 PDMS 장치에 연결된 관을 채우기 elegans 및 / 또는 Drosophila / zebrafish 애벌레 장치.
  3. 14 PSI를 읽고 일을 향해 편향의 주요 트랩의 멤브레인을 모니터링 할 질소 공급 장치의 밸브를 돌려역 현미경의 낮은 배율의 전자 흐름 채널. 마이크로 플렉스 관에서 물이 칼럼의 길이는 3 방향 꼭지가 열려있을 때마다 압축됩니다. 편향된 멤브레인의 가장자리는 전송 된 빛 (그림 1I 및 1J)에서 볼 수 있습니다. 막 편향은 PDMS 막 아래에 먼지 입자 / 기포의 변위가 발생하고 채널 경계로 등록합니다.
  4. 액체 앞에 어떤 갇힌 공기없이 완전히 microchannel을 가득 때까지 기다립니다.
  5. 의 휴식 위치로 막을 완화하기 위해 3 방향 꼭지를 사용하여 압력을 놓습니다.

5. C. 삽입 elegans, Drosophila와 Zebrafish 장치에 애벌레와 유연한 PDMS 막에서 그것들을 Immobilizing

  1. M9 버퍼와 흐름 채널을 채우기 [3 g KH 2 PO 4, 6g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 ML 1 M MgSO 4, L에 H 2 O는 AUT에 의해 소독oclaving] C.에 elegans 18 1X PBS하기 전에 10 분 동안 Drosophila / zebrafish 애벌레 19 번 좌석을 [8g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g 오세영 2 HPO 4, 0.24 g KH 2 PO 4, H 2 O 한 L로는 autoclaving하여 소독]를 실험.
  2. 단일 C.를 찾습니다 낮은 배율 스테레오 현미경을 사용하여 NGM 플레이트 (18)에 필요한 단계 elegans (또는 한천 달걀 판이나 액체 배지 20 년 수동 dechorionated 30 hpf의 zebrafish 애벌레의 첫 번째 instar Drosophila의 애벌레). 마이크로 팁에 완충 용액의 작은 볼륨을 사용하여 하나의 동물을 선택하십시오. 그 끝 마이크로 팁을 사용 큰 Drosophila 또는 버퍼에 zebrafish의 유충을 수용 할 수 자른다.
  3. 유동 채널 입구를 통해 하나의 유기체를 밀어 넣습니다. 메인 트랩에서 각각의 동물을 배치 할 수있는 pipetting 압력을 조정합니다.
  4. 천천히 짱에 대한 동물을 위치로 PDMS 막에 압력을 증가nel 경계와 C. 14 PSI 압력으로 고정 elegans, Drosophila와 zebrafish 애벌레 3 PSI 7 프.
  5. 뷰의 미세 분야의 중심에 고정 동물을 배치합니다. 고해상도 밝은 필드 또는 형광 이미징에 대한 원하는 설정의 역 현미경을 사용하십시오. 미리 정의 된 프레임 속도에서 단일 또는 시간 경과 형광 이미지를 취득.
  6. 트랩 압력을 해제 낮은 배율에서 5-10 분을위한 동물의 운동을 모니터링 할 수 있습니다.
  7. 동물을 플러시하고 위​​의 단계를 반복 할 새로운 동물을 삽입합니다.
  8. 주사기를 사용하여 적용 증류수를 사용하여 폐기물 저장소에서 모든 동물을 씻으십시오. 향후 재사용을 위해 주사기를 사용하여 공기를 밀어하여 채널을 말린다.

주의 사항 : 주 채널 내부의 흐름에 높은 pipetting 압력을 필요로하는 동물이 덫에서 출시 후 가난한 운동 / 건강을 표시하는 경향과 IMA를 위해 피해야한다ging. 결정에 의해 채널의 막힘을 방지하기 위해 버퍼의 흔적에 대한 흐름 채널을 청소하십시오. 기름은 고해상도 이미징에 사용되는 경우, 이후의 실험에 대한 잡음 비율에 좋은 신호를 유지 할 수 있도록 유리 커버 슬립을 청소.

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Representative Results

흐름 층 (레이어 1) 및 제어 계층 (레이어 2) 그림 1과 같이 : 고정 장치는 본딩 두 레이어에 의해 제조 이중층 PDMS 블록입니다. 주요 트랩이 레귤레이터와 액체 열 (그림 1A)를 통해 막 위에 필요한 (3-14 PSI) 압력을 적용 할 수있는 3 방향 스톱 콕을 통해 질소 가스 실린더에 연결되어 있습니다. 편향 멤브레인은 C.를 움직이게 다른 크기 (그림 1B와 1C)와 설계 흐름 채널에 elegans, Drosophila 또는 zebrafish 애벌레. 사진 마스크는 C.에 대해 서로 다른 형상으로 고정 장치 레이어를 설계하는 데 사용됩니다 elegans (그림 1D), Drosophila의 애벌레 (그림 1 층)와 zebrafish의 애벌레 (그림 1G). 흐름 계층 (그림 1E에서 H1, 1K)의 채널 높이 또는 수용 할 수 있도록 서로 다른 스핀 코팅 속도를 사용하여 다양했습니다유동 채널 내부에 서로 다른 직경의 ganisms. 흐름 층 높이 40 μm, 80 μm, 500 μm와 C. 900 μm에서 제조 된 elegans 애벌레의 단계, 성인 C. 각각 elegans 먼저 instar Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레 (표 1). 40 μm의 흐름 채널 높이 장치는 L1에서 일찍 L4 C.에 적합한 elegans의 애벌레. 80 μm 흐름 채널 높이 장치는 후반 L4 유충 및 성인 C.에 사용됩니다 음문이 돌출을 시작할 때 elegans. 큰 zebrafish 장치는 이전 Drosophila의 애벌레에 사용할 수 있습니다. PDMS 막 두께 (m)는 C. 40 μm, 300 μm에서 가짜 각각 elegans 및 Drosophila / zebrafish 장치. 레이어 2의 마이크로 유체 채널의 높이는 C.의 조기 애벌레의 단계 40 μm에서 가짜 C. 월말 애벌레의 단계에 대한 elegans 80 μm elegans와 Drosophila/ zebrafish의 애벌레. 유동 채널, 막 및 제어 채널의 높이는 여러 독립적 인 일괄 적으로 가공 장치로 측정되었으며, 서로의 ± 5 μm에서 일관성을 발견했다. 이 장치는 유동 채널에서 유기체를 고정 할 수있는 막 편향 기술을 (그림 1H-J)를 사용합니다.

생물 흐름 채널 (PDMS-1) 유동 채널에 대한 조건을 스핀 스페이서 PDMS (PDMS-S) 스페이서 PDMS에 대한 스핀 조건 고정 압력 (PSI)
C. elegans (L1 초기 L4까지) 40 μm (SU8-2025) 500 RPM (5 초), 2,000 RPM (30 초) NA NA 14
C. elegans (후반 L4와 성인) 80 &무, m (SU8-2050) 500 RPM (5 초), 2,000 RPM (30 초) NA NA 14
Drosophila (첫 번째 instar) 80 μm (SU8-2050) 500 RPM (5 초), 2,000 RPM (30 초) 400 μm (PDMS) 500 RPM (35 초) 7
Zebrafish (30 hpf) 80 μm (SU8-2050) 500 RPM (5 초), 2,000 RPM (30 초) 400 μm (PDMS)를 2 배 500 RPM (35 초) 3

유동 채널 (PDMS-1)과 스페이서 PDMS 층 (PDMS-S)의 표 1. 장치 크기는 C.에 사용 elegans 및 Drosophila / zebrafish 장치.

C. elegans L4 유충은 14 PSI 질소 가스 (그림 2A)를 사용하여 80 μm 채널 높이 PDMS 마이크로 유체 장치에 고정되었다. 시간 경과 형광 이미지 w미토콘드리아의 영상 전송을위한 60X 목표 (수치 조리개 1.4, 기름 목표)를 사용하여 초당 2 프레임의 속도 (FPS)에서 구입 한단은 터치 수용체 뉴런 21 mitochondrial 매트릭스 대상으로 GFP를 사용하여 시각화. 모든 400 프레임은 ImageJ 사용 (kymographs로 변환 된 www.rsbweb.nih.gov / 엘 제이 )와 미토콘드리아는 (그림 2E) anterogradely, (멀리 전지 본체에서) 감독 retrogradely 감독 (전지 본체에 대한) 또는 고정으로 분류 된 있습니다. 우리는 고정 압력 21 PSI에 mitochondrial 교통을 관찰하지만, 자속은 최저 고정 압력에서 다소 더했습니다. 미토콘드리아의 anterograde과 역행 플럭스는 0.8 ± 0.25 및 1.2 ± 0.34 14 PSI의 고정 압력 반면 7 프에서 1.1 ± 0.23 1.6 ± 0.22로 측정되었다. 값은 1.1에서 통계적으로 차이가 없었다 ± 0.33 및 1.3 & Plusmn, 0.42 동물에서 얻은 3 밀리미터 levamisole (P-값> 0.45, N = 30 동물)를 사용하여 고정.

500 μm의 높이와 큰 장치가 처음 instar Drosophila의 애벌레 (그림 2B)와 28-30 hpf zebrafish의 애벌레 (그림 2D)을 고정하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째 instars Drosophila의 유충의 해부는 도전이 될 수 있습니다. 반면 마이크로 유체 장치는 고해상도 시야 및 / 또는 손상 유기체를 사용하여 형광 이미징을 수행하는 방법을 제공합니다. 개인 Drosophila의 애벌레는 (그림 2C) 획득 된 감각 뉴런에서 7 압축 질소 가스의 PSI (그림 2B, 표 1)과 synaptotagmin.eGFP 운송의 형광 이미지를 사용하여 고정되었습니다. 시간 경과 영화 감각 뉴런 (그림 2 층)에 이동 및 고정 synaptotagmin 마크화물을 보여 주었다. 평균 anterograde과 역행 속도는 kym에서 측정 된ographs는 0.92 ± 0.04 μm / s와 1.00 ± 0.05 μm 각각 / S (n은 = 6 동물, N> 40 세그먼트) 있어야합니다. 이러한 anterogradely (0.84 ± 0.05 μm / s)로하고 retrogradely (0.76 ± 0.03 μm / s의) 22 두를 이동 해부 Drosophila 모터 뉴런에서 측정 synaptotagmin 수행 수송 소포의 속도 비교입니다.

900 μm의 높이와 비슷한 장치는 zebrafish 애벌레 (그림 2D, 표 1)의 다른 단계를 고정하는 데 사용되었습니다. 초기 발달 단계에는 Zebrafish 애벌레는 꼬리 매 10-15 초하겠다 일반적으로 솔루션이나 고해상도 이미징 23 설치 미디어에 0.02 % tricaine를 (MS-222)를 사용하여 고정합니다. 우리 PDMS 장치는 빠른 고정을위한 대체 수단을 제공하며, 고해상도 이미징 24시 광학 경로에 신뢰할 장착 매체의 필요성을 없애줍니다. 우리는 수동으로 28-3을 dechorionated0 hpf의 애벌레와 애벌레의 심장 박동의 시간 경과 영화를 취득 할 수있는 3 PSI 질소 가스를 사용하여 PDMS 장치에 개별적으로 고정. 심장 박동의 속도는 136.8로 측정되었다 ± 분 (n은 = 8 영화) 당 1.6은 다른 게시 된 보고서 25과 비슷했다.

우리의 간단한 마이크로 유체 장치는 이미 야생 유형 C.에서 하위 세포 및 세포 다양한 행사를 측정하기위한 입증 된 elegans 4. 우리의 마이크로 유체 장치, 야생 유형 C.에서 elegans는 anesthetics를 사용하여 고정 아르 동물에 비해 뉴런으로 이동 시냅스 소포 등의화물의 더 큰 숫자를 표시합니다. 그러나, 우리는이 연구 결과가 생길 있는지 돌연변이 동물의 장치를 테스트하지 않았다. 이 테스트하기 위해 우리는 사전 시냅스 소포에게 26 운반 kinesin3 / UNC-104 분자 모터, UNC-104 (e1265)에서 강력한 hypomorphic 돌연변이를 사용했습니다. 우리는 GFP의 자속 :: 랩-3 마크 미리 신경 vesi을 비교앞 측면 mechanosensory 고정 마취의 뉴런과 장치 cles는 돌연변이 aniamls (그림 3A)를 고정. 사전 시냅스 소포의 플럭스는 1 ㎜의 levamisole (그림 3B, 3C) 27 anesthetized UNC-104 동물로부터 획득 한 데이터에 비해 장치를 고정 동물의 큰 흐름이었다. 이 마이크로 유체 장치에서 영상 강력한 교통 결함이있는 돌연변이 데이터를 수집보다 효율적인 수단이 될 수 있습니다 것을 보여줍니다. 우리는 또한 URY 뉴런의 glutamate 수용체의 다른화물 예 수지상 전송은 (그림 3D, 3E) 장치 고정 동물 이미징 할 수 있습니다 보여줍니다. 이 장치는 또한 초기 C. 동안 이미지 셀룰러 프로세스로 사용할 수 있습니다 이러한 L1 동물의 Q의 neuroblast 부문 등 elegans 개발. QR 셀과 일치 부화 후 두 딸 세포 QR.a 및 QR.p ~ 3 시간을 (그림 3 층) 형성 나눠 이미징되었습니다이전 관찰 28.

유동 채널 (PDMS-1)과 스페이서 PDMS 층 (PDMS-S)의 표 1. 장치 크기는 C.에 사용 elegans 및 Drosophila / zebrafish 장치.

그림 1
그림 1. 유전자 모델 생물에 대한 PDMS 마이크로 유체 장치의 도식 표현입니다. (A) 유전자는 유동 채널로 마이크로 팁을 사용하여로드 및 레귤레이터 및 밸브를 사용하여 제어 압축 질소 가스를 사용하여 고정합니다. 이 장치는 역 현미경의 시야 / 형광 이미징에 적합합니다. 디자인은 C.에 각각 10mm 긴 흐름 채널 (설계 I, L1)과 제어 채널 (디자인 II, L2)로 구성 elegans (B)와 Drosophila / zebrafish 애벌레 (C). 크기가 디자인 (B와 C)에 표시됩니다. variou의 (D, F, G) 도식PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS 막, PDMS-S 및 유리)의 S 레이어는 C.에 존재 elegans, Drosophila와 zebrafish의 고정 장치. 추가 할 수있는 유연한 막과 스페이서 PDMS 층 (PDMS-S)를 형성하기 위해 대량 PDMS 층 (PDMS-2), 스핀 코팅 PDMS 층 (PDMS-1)를 보여주는 장치의 크로스 섹션의 (E) 도식 표현 유동 채널 높이 (Drosophila / zebrafish 장치에 대한). 전체 구조는 유전자 (갈색 원) 수용 할 수있는 광학 학년 유리 커버 슬립에 돌이킬 접합된다. 개략적 인은 제어 채널 'H2'의 높이, 흐름 채널 'H1', 천공 스페이서 층 'S'와 막 두께 'm'을 나타냅니다. (H) 제어 채널에 압력을 가한 액체 칼럼의 존재의 유동 채널에 대한 막 편향을 나타냅니다. 밝은 필드 이미지는 제로에서 무료로 (I)와 편향 막 (J)의 그림 14 PSI '는 각각 액체 열을 가압하고 있습니다. 화살표와 화살표 머리 거품 u를 나타냅니다각각 유동 채널에서 막의 nder 밖에. C.의 (K) 단면 이미지 elegans 장치는 고정 영역의 위치에서 촬영. 스케일 바는 50 μm (K)와 200 μm (I, J)입니다. (D, F, G) 설계도는 확장 할 수 없습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 이미징 유전자 모델 생물은 마이크로 유체 장치에 고정. 고정 C.의 시야 이미지 elegans (A), PDMS 마이크로 유체 장치의 첫 번째 instar Drosophila의 애벌레 (B)와 30 hpf zebrafish의 애벌레 (D). jsIs609의 시간 경과 영상, C.의 Kymograph 분석 장치 immobil의 앞쪽 측면 mechanosensory 뉴런 (ALM)에 mitochondrial 매트릭스 대상으로 GFP를 표현 elegans 변형,ized 동물 (E). 미토콘드리아는 kymograph에 anterograde ( '아래'화살표 머리), 역행 ( '최대'화살표 머리)와 고정 ( '별'마르크)으로 분류됩니다. 그대로 첫번째 instar Drosophila의 유충의 (C) 형광 이미지입니다. 상자 syt.eGFP 교통 고해상도 시간 경과 영상은 cholinergic 뉴런에서 수행되는 위치를 나타냅니다. 프레임 번호 5 Hz에서 구입 한 다섯 프레임의 몽타주는 몽타주 (F)에 anterograde 역행하고 고정으로 표시 각각의 이미지와 GFP 마크화물에 표시. (D)의 상자가 zebrafish 애벌레의 심장 박동의 속도를 계산하는 모니터 영역을 나타냅니다. 스케일 바는 5 μm (F), 10 μm (E), 100 μm (A, B) 200 μm (D)입니다.

그림 3
그림 3. C.의 세포와 하위 세포 이미징 PDMS 마이크로 유체 장치를 사용 elegans. 개미의 (A) 도식anterograde과 역행 방향으로 erior 측면 mechanosensory (ALM) 뉴런이 표시. 점선 상자가 axonal 운송 이미징 영역을 보여줍니다. 350 프레임은 왼쪽에있는 오른쪽과 신경 링 (NR)에 전지 본체 (CB)와 5 프레임에서 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 획득하고 있습니다. 데이터는 장치에 고정 동물 kymographs을 사용하거나 1 ㎜의 levamisole (C)를 사용하여 분석하고 있습니다. anterograde과 역행 방향으로 이동하고화물은 각각 '아래'와 '최대'을 가리키는 화살표를 사용하여 표시됩니다. 350 시간 경과 프레임을 통해 ALM 신경 세포의 20 μm 지역에서 UNC-104 (e1265) 동물에서 관찰 입자의 (B) Anterograde과 역행 자속. (D) 이미지 GFP에 사용 URY의 신경 세포의 도식은 glutamate 수용체 전송을 표시했습니다. 350 시간 경과 프레임은 PDMS 장치에 고정 동물 anterograde과 역행 방향으로 이동 또는 1 밀리미터 levamisole (E)를 사용하여화물을 보여 kymographs으로 변환됩니다. Q neuroblast 디 중에 인수 시간 경과 이미지C.의 조기 애벌레의 단계에서 비전 및 마이그레이션 elegans. (F) QR 공사 부서를 보여 세 시간 경과 프레임은 딸 세포 QR.a과 QR.p.을 형성하는 스케일 바는 5 μm (C, E 및 F)입니다. (B)로 표현 데이터는 뜻 이죠 ± SEM (N> 4). 비교가 마취에서 얻은 값에 대해 만든이 표시된다 * (P <0.05)와 ** (P <0.005).

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Discussion

PDMS 마이크로 유체 장치는 따라서 모든 반투명 / 투명 모델 생물의 생체 이미징의 높은 해상도에 사용할 수 있습니다 광학적으로 투명합니다. 우리 디자인은 그대로 살아있는 동물의 세포와 하위 세포 사건의 높은 배율 spatio - 시간적 이미지에 적합합니다. 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 Microfabrication 모델 생물의 다양한 크기 장치 크기를 쉽게 조작 할 수 있습니다. 다양한 크기의 디바이스는 C.의 다른 단계에 대한 제조된다 elegans, Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 자신의 흐름 레이어 채널 40 μm 80 μm의 다른 높이와 장치 개선 고정하고 나중에 모두 (L1) 초기 및 더 나은 후 이미징 건강 (말 L4) C.의 단계를 보여 각각 elegans. 우리는 C.에 대한 장치 제조에서 100 % 성공률을 달성 결함 장치없이 elegans와 Drosophila / zebrafish. 장치가 될 때까지 여러 번 사용할 수 있습니다제어 채널은 먼지 입자 또는 박테리아 번식으로 오염되어 있습니다. 장치 C.를 고정 elegans는 anesthesized 동물에 비해 야생 타입과 돌연변이 동물 모두에서 큰화물 유량을 표시합니다. 장치 고정 특히 Drosophila의 애벌레 29 초기 발달 단계에 대한 기술적 도전 분해 프로토콜에 대한 필요성을 제거합니다.

PDMS 마이크로 유체 장치에서 순간 고정 프로토콜은 외부 적용 anesthetics에 필요한 일반적으로 더 이상 노출 시간에 비해 실험 시간을 줄이는 고유 장점이 있습니다. 모든 고정 생물체가 변형 PDMS 막에 압력의 릴리스 이후에 5-10 분 이내에 정상 운동으로 돌아갑니다. C. elegans는 유동 채널 및 거리에 고정 막의 중앙 부분에서의 경계에 고정되어 있습니다. 흐름 채널의 중간에 고정 동물 건강이 좋지 후 immobiliza를 표시기하고 하루 이틀 내에 죽을. 우리 마이크로 유체 장치는 L4 단계 C.를 유지하는 데 사용되었습니다 elegans는 건강이나 후속 개발에 영향을주지 않고 막에서 최대 1 시간 동안 고정. 짧은 시간 (최대 10 분)에 고정 동물 이미지를 여러 번 갇혀 될 수 있습니다. 초기 발달 단계를 들면, C. elegans는 장기간 시간이 경과 실험 (~ 3 시간)에 대한 약간 낮은 압력 (7 PSI)에 고정되었다. 막 출시 후 아래 고정 동물은 개입 시간에 동일한 장치에 남아 있었다. 이 동물은 개발과 일반적인 건강 모두 야생 유형 비교합니다. 성인 C. 저압 (7 PSI)에 고정 elegans는 고해상도 시간 경과 실험 기간 동안 느린 드리프트를 보여 주었다 및 교통 분석을위한 복잡한 분석 도구가 필요합니다. 그러나 낮은 압력은 그러한 ~ 3 시간 또는 반 정량 mitoch 이상 Q의 neuroblast의 세포 분열 / 마이그레이션과 같은 장기간 연구를 수행하는 데 사용 된ondria 교통 특성, 완벽한 고정이 필요하지 않습니다 처리합니다. 고정의 따라서 낮은 압력을 수집해야하는 데이터 세트에 따라 사용할 수 있습니다.

L4 C.의 시간 경과 영상 elegans는 다른 모델 시스템 30-32의 뉴런에보고되었습니다로서 GFP의 약진 운동은 ALM 뉴런 (변형 jsIs609)에 미토콘드리아 표시 보여줍니다. 그 중 대부분의 동영상의 기간 동안 고정되는 동안 이러한 뉴런의 일부 미토콘드리아는 양방향 전송을 보여줍니다. 우리는 C.의 경우에 14 PSI의 고정 압력을 계속 사용 유량의 작은 차이에도 불구하고 elegans 완전한 고정을 받아 axonal 교통의 고해상도 시간 경과 영상 중에 드리프트를 방지합니다. 우리는 일반적으로 프로토콜에 14 PSI를 사용하여이는 중 증가 또는 감소 될 수있다 실험 요구에 따라하는 것이 좋습니다. 동물은 정상 locomotio로 돌아 거의 같은 시간이 걸렸습니다N 낮은 높은 고정 압력과 고정 동물 모두에서 고정하지 않고 재배 사람들에게 동일하게 개발했습니다.

스페이서 레이어로 큰 크기를 사용하여 제조 장치 등 Drosophila와 zebrafish의 애벌레와 같은 큰 모델 생물에 사용할 수 있습니다. 그대로 첫번째 instar Drosophila 감각 뉴런의 synaptotagmin.eGFP 운송의 영상은 anterograde과 역행 양방향에서 활동중인 전송을 보여줍니다. 장치 고정 애벌레로 측정 평균 속도는 높은 해부하는 모터 뉴런 22 측정 값으로 비교됩니다. 이러한 차이는 빠르게 우리의 실험의 데이터 수집 (5 Hz에서 V / s의 1.1-1.4 Hz에서), 세포 기관 교통 (감각 V / S 모터 뉴런) 및 / 또는 절개에 의한 효과에 신경 별 차이에서 발생할 수 있습니다.

이전의 실험은 따라서 우리가 결정 야생 유형 동물 (4)에 독점적으로 수행되었는지 여부마이크로 유체 장치에서 영상 돌연변이도 유리했다. C.의 시간 경과 영상 elegans L4 동물 GFP의 자속 :: 랩-3 마크 사전 시냅스 소포 1.0 밀리미터 levamisole에 고정 kinesin3/unc-104 돌연변이에서의 PDMS 장치 (그림 3B)를 사용하여 고정 동물에서 얻은 유량 측정에 비해 감소 보여줍니다. 우리는 종종 관찰과 동물은 야생 형 동물을 고정 마취 농도를 사용하여 고정하는 경우 돌연변이에 거의 전송이 관찰 예를 들어 (그림 3C)를 표시합니다. UNC-104 동물의 이동 소포의 숫자는 우리가 마이크로 유체 장치를 사용할 때 상당히 높다. PDMS 막 (그림 3B)에 적용 14psi 압력을 배치 할 때 Anesthetized 동물은 유사한 교통 특성을 보여줍니다. 비슷한 관측는 야생 타입 동물 사에서 만든되었습니다. 이 데이터는 증가 자속 메신저에서 발생 가능성이 아니라는 것을 제안질소 아래에 동원하지만, 간 세포의 교통에 덜 손상이었습니다 프로토콜로 인해.

원칙적으로, 칼슘 역학과 세포 분열과 같은 다른 이벤트는 모두뿐만 아니라 그대로 Drosophila / zebrafish 애벌레에 이미징 할 수 있습니다. 장치 고정 동물의 포스트 이미징 복구 유기체 생존 4 이하 해로운하기 때문에 이러한 장치도 더 이상 시간의 척도를 통해 발생하는 이벤트에 대한 유전 적 모델 유전 생물의 장기 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 C.에 nuIs25과 CGC를 들어, Drosophila 새장을 유지하기위한 Drosophila 주식, Tarjani Agarwal에 피터 Juo을 박사 Krishanu 레이 감사 elegans 긴장. SPK는 마이클 구 중창단의 연구실에서 jsIs609했다. 우리는 마이크로 유체 장치에서 jsIs609 동물의 미토콘드리아 교통 시간 경과 영상에서 자신의 도움을 Arpan Agnihotri (BITS Pilani)을 감사드립니다. 우리는 zebrafish 배아으로 우리를 제공하는 박사 Vatsala Thirumalai 및 Surya Prakash에 감사하고 있습니다. 우리는 나노 기술 (제 SR/55/NM-36-2005)의 과학 기술 - 센터의 부서에 의해 지원 회전 디스크 공 촛점 현미경의 사용에 대한 NCBS에서 박사 크리슈나와 CIFF 감사드립니다. 우리는 또한 토론을 Kaustubh Rau, V. Venkatraman과 Chetana Sachidanand 감사드립니다. 이 작품은 DBT 후 박사 휄로 십 (SM), DST 빠른 속도로 트랙 체계 (SM)와에 DBT 부여 (SPK)에 의해 재정 지원되었다. SA는 SPK에 DST와 CSIR 보조금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

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References

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에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish
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