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Bioengineering

Einfache mikrofluidischen Systemen für Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei durchführen

Abstract

Micro hergestellt fluidischen Geräten bereitzustellen ein zugängliches Mikroumgebung für in vivo Studien an kleinen Organismen. Einfache Fertigungsprozesse sind für mikrofluidischen Bauteilen mit weichen Lithographietechniken 1-3. Mikrofluidik-Geräte wurden für sub-zellulären Bildgebung 4,5, wurde in vivo Laser-Mikrochirurgie 2,6 und zelluläre Bildgebung 4,7 verwendet. In-vivo-Bildgebung Immobilisierung von Organismen erfordert. Dies wurde erreicht mit Absaugung 5,8, konische Kanäle 6,7,9, verformbaren Membranen 2-4,10, Saug mit zusätzlicher Kühlung 5, Narkosegas 11, Temperatur empfindliche Gele 12, Sekundenkleber 13 und Anästhetika wie Levamisol 14 , 15. Häufig verwendete Anästhetika beeinflussen synaptischen Transmission 16,17 und sind dafür bekannt, schädliche Auswirkungen auf sub-zellulären neuronalen Transport 4 haben. In dieser Rundeudy zeigen wir eine Membran auf Basis von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS)-Gerät, das Narkosemittel free Immobilisierung intakter genetischen Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven können. Diese Modellorganismen sind für in-vivo-Studien in mikrofluidischen Vorrichtungen aufgrund ihrer geringen Durchmessern und optisch transparenten oder transluzenten Körper. Körper Durchmesser reichen von ~ 10 um bis ~ 800 um für die frühen Larvenstadien von C. elegans und Zebrafisch-Larven und erfordern mikrofluidischen Bauteilen verschiedener Größen, um eine vollständige Immobilisierung für Hochauflösung Zeitraffer-Aufnahmen zu erzielen. Diese Organismen werden immobilisiert durch Druck mittels komprimierter Stickstoffgas durch eine Flüssigkeitssäule aufgebracht und abgebildet unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Tiere aus der Falle freigegeben normalen Fortbewegung zurück innerhalb von 10 min.

Wir zeigen vier Anwendungen von Zeitraffer-Aufnahmen in C. elegansnämlich Bildgebung mitochondrialen Transport in Neuronen, pre-synaptischen Vesikel Transport in einem Transport-Mutante, Glutamat-Rezeptor-Transport-und Q Neuroblast Zellteilung. Daten aus solchen Filmen erhalten zeigen, dass mikrofluidischen Immobilisierung ein nützliches und genaues Mittel zum Erwerb von in vivo-Daten der zellulären und subzellulären Ereignissen wann narkotisierten Tieren (Abb. 1J und 3C-F 4) verglichen wird.

Geräteabmessungen wurden verändert, um Zeitraffer-Aufnahmen der verschiedenen Stadien von C. ermöglichen elegans, im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven. Transport von Vesikeln mit Synaptotagmin mit GFP (syt.eGFP) in sensorischen Neuronen markiert markiert zeigt gerichtete Bewegung der synaptischen Vesikel Marker in cholinergen sensorischen Neuronen im intakten ersten Larvenstadium Drosophila-Larven ausgedrückt. Eine ähnliche Vorrichtung wurde verwendet, um durchzuführen Zeitraffer-Bildgebung von Herzschlag in ~ 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF)Zebrafischlarven. Diese Daten zeigen, dass die einfache Geräte wir entwickelt haben, zu einer Vielzahl von Modellsystemen, mehrere zellbiologische und Entwicklungsstörungen Phänomene in vivo zu untersuchen angewendet werden kann.

Protocol

Ein. SU8 Meister Fabrication

  1. Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen mit Clewin Software und drucken Sie es mit 65.024 DPI Laser Plotter mit minimalen Strukturgröße von 8 um auf der Leiterplatte Film.
  2. Reinigen 2 cm X 2 cm Siliciumscheiben mit nativem Oxid in 20% KOH für 1 min und Spülen in deionisiertem Wasser; einem Wafer jeweils für die Strömung Schicht und ihrer entsprechenden Steuerschicht.
  3. Föhnen Sie die Stücke mit Stickstoffgas und austrocknend auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 4 Stunden. Lassen Sie die Teile abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt.
  4. Ort Siliciumstücke nacheinander auf der Spinnvorrichtung Spannfutter und Einschalten des Vakuums. Bedecken Sie die Silizium-Oberflächen mit ~ 20 ul Hexamethyldisilazan (HMDS) und überziehen sie mit ein SPIN150 spinner bei 500 rpm für 5 sec, gefolgt von 3.000 rpm für 30 sec.
  5. Titelbild Silizium-Wafer vollständig mit ~ 1,5 ml SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) und Mantel Wafer mit SPIN150 spinner bei 500 rpm für 5 sec, gefolgt von 2.000 rpm für 30 sec. Dieses Spinnverfahren Protokoll erzeugt ein Photoresist Dicke von ~ 40 um, die geeignet für die Steuerung und für die frühe Strömungsschichten Larvenstadien C beträgt elegans.
  6. Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 unter Verwendung SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 2000 UpM für 30 Sekunden, um eine Photoresist Dicke von ~ 80 um, die sich für Durchfluss Schicht Herstellung ist für späte Larvenstadien von C zu erhalten elegans, basal Flow Schicht für Drosophila / Zebrafischlarven und deren entsprechende Steuerung Schichten.
  7. Legen Sie die Silizium-Stücke auf heißer Platte mit dem SU8 aufgetragene Schicht an der Spitze. Weichbacken die beschichteten Siliciumstücke bei 65 ° C für 1 min bei 95 ° C für 10 min folgte. Lassen Sie die Teile abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt.
  8. Legen Sie die Soft-gebackene Silizium-Stücke auf die Exposition der Bühne mit SU8-2025 beschichteten surFläche auf der Oberseite gegenüber der UV-Lampe. Verwenden der Photomaske mit Design I (L1, 1B) und Design II (L2, 1B) für die Strömung Schicht und Steuerschicht Muster jeweils für frühe Larvenstadien von C. elegans. Legen Sie das Foto-Maske auf der Oberseite des SU8 Schicht und sicherzustellen, dass die Maske ist flach gegen die aufgetragene Schicht. Öffnen Sie den Verschluss der UV-Lampe und setzen die Soft-gebackene SU8 Wafern bis 200 Watt UV-Lampe durch die Photomaske für 15 sec.
  9. Verwenden Sie die Photomaske mit Design I (L1, 1B) und Design II (L2, 1B) auf SU8-2050 beschichteten Stücke (hergestellt in Schritt 1,6), um den Fluss Schicht und Control Layer für den späten Larvenstadien von C. herzustellen elegans. Verwenden der Photomaske mit dem Motiv I (L1, 1C) und Design II (L2, 1C) für das basale Strömungsschicht und Steuerschicht jeweils für Drosophila / Zebrafischlarven auf Wafern mit SU8-2050 beschichtet (hergestellt in Schritt 1,6). Setzen Sie die SU8 Oberflächen durch das Foto Maske auf die 200 Watt UV-Lampe für 15 Sekunden.
  10. Legen der freigelegten Siliciumstücke auf einer heißen Platte mit der beschichteten Schicht auf die Oberseite. Stellen die Wafer backen bei 65 ° C für 1 min bei 95 ° C für 10 min folgte. Lassen Sie die Teile abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt.
  11. Entwickeln Sie die Stücke mit dem SU8 Entwicklerlösung für 20 min. Spülen Sie die Stücke in Isopropylalkohol (IPA) und Föhnen mit Hilfe von Stickstoff.
  12. Legen Sie die Silizium-Stücke in einem Exsikkator mit dem SU8 Muster auf. Beschichtung der Stücke mit 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Dampf im Exsikkator für 2 Stunden.

Vorsichtsmaßnahmen: Nehmen Sie Sicherheitsvorkehrungen für den Umgang mit Chemikalien in KOH Behandlung Photoresistbeschichtung und Entwicklung. Silan Bedampfung sollte in einem Exsikkator in einem belüfteten Bereich durchgeführt werden. Schützen SU8 aus über Belichtung zu widerstehen. Eine Schutzbrille mit einem UV light Quelle.

2. PDMS Mold Fabrication

  1. Bereiten 10.01 PDMS durch die Kombination von 50 g Sylgard 184 Sockel mit 5 g Härter in einem Plastikbecher. Mischen Sie den Inhalt manuell für ca. 3 min. Degas die Mischung in einem Exsikkator auf alle Luftblasen beim Mischen gebildet entfernen.
  2. Gießen einer 5 mm dicken PDMS-Gemisch in den Siliziumwafer mit SU8 Muster des Designs II, für Steuerschicht, sanft um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Bei Blasen während des Gießens, entgasen PDMS auf der SU8 Muster in geringem Vakuum, um alle Luftblasen zu entfernen gebildet.
  3. Legen Sie die Silizium-Wafer mit SU8-2025-Muster von Design I, für den Fluss Schicht, auf spinner Spannfutter und schalten Sie das Vakuum, um sie zu halten. Decken die Wafer mit ~ 1 ml PDMS Mischung und Beschichtung der Wafer mit Hilfe SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 1500 UpM für 30 sek.
  4. Mantel ~ 1 ml PDMS Mischung auf Siliziumwafern mit dem 80 um SU8-2050 Muster Motiv I (L1, 1B), für dieFlow-Schicht für den späten Larvenstadien von C. elegans mit der Schleudereinrichtung SPIN150 bei 500 UpM für 5 sec, gefolgt von 1000 UpM für 30 sek. Coat eine dicke Schicht von PDMS-Mix auf den Silizium-Stücke mit SU8-2050 Strömungsmuster Layer-Design I (L1, 1C) für Drosophila / Zebrafischlarven mit SPIN150 spinner bei 500 rpm für 35 sec.
  5. Bake PDMS beschichteten Silizium Stücke von Design I und Wafer mit entsprechenden Gestaltung II zur Steuerung Schicht PDMS für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven in einem Heißluft Ofen bei 50 ° C für 6 Stunden.
  6. Herausschneiden des PDMS Stück aus dem Siliziumsubstrat mit dem Muster SU8 II für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven mit einer scharfen Klinge. Stanzen ein kleines Loch von ~ 1 mm Durchmesser auf der Oberseite des Reservoirs Verbindung der Haupt-Falle in der PDMS-Form unter Verwendung einer Harris Puncher.
  7. Legen Sie die gestanzten PDMS-Block (mit der 40 um dicke Form zur SteuerungSchicht L2) auf einer Kunststoffwanne, mit dem geformten Seite der Steuerschicht nach oben weist. Legen Sie die PDMS beschichteten Silizium-Wafer mit der 40 um dicken SU8 Design Ich auf dem gleichen Tablett, mit dem PDMS beschichtete Oberfläche nach oben zeigt. Setzen Sie das Fach in der Kammer von Plasma cleaner und schalten Sie das Vakuum für 2 min. Anschließend auf dem Plasma-Gerät einzuschalten und senken den Kammerdruck, bis die Kammer sich hellrosa Farbe. Setzen beider Oberflächen bis 18 Watt Luftplasma unter niedrigem Vakuum für 2 min.
  8. Legen Sie die gestanzten PDMS-Block aus den 80 um dicke SU8 Master haltigen Muster II entfernt für den späten Larvenstadien von C. elegans oder Drosophila / Zebrafischlarven auf einer Kunststoffwanne, mit dem geformten Seite der Steuerschicht nach oben weist. Platzieren Sie das entsprechende gebackenen PDMS-Schicht Spin auf dem Silizium-Wafer mit 80 um dicken Entwurf, den ich für eine spätere C. beschichtet elegans Stufen oder Drosophila / Zebrafischlarven gleichzeitig auf dem gleichen Blech mit der flachen PDMS beschichteten surface nach oben. Das gleiche Protokoll oben erwähnt, um sie Luftplasma freizulegen.
  9. Legen Sie die beiden Plasma-behandelten Oberflächen für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven gemeinsam mit sanftem Druck und backen sie in Heißluft Ofen bei 50 ° C für 2 Stunden.
  10. Ausschneiden der verknüpften Geräte aus dem Silizium-Substrat mit SU8 Motiv I für C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafisch-Larven. Stempel Zugang Löcher an den Einlass und Auslass des Reservoirs Strömungskanals.
  11. Legen Sie die gebundene PDMS Schimmel auf einer Plastikschale für C. elegans, mit dem geformten Seite der Strömung Schichtaufbau nach oben weist. Saubere Deckglas (22 x 22 mm, Nr. 1 Dicke) und legen Sie es auf dem gleichen Kunststoff-Fach. Legen Sie das Fach mit PDMS Schimmel und Deckglas innerhalb der Plasmakammer. Freilegen unteren PDMS Oberfläche der Vorrichtung und Deckglas bis 18 Watt Luftplasma bei niedrigem Druck für 2 min. Legen Sie die beiden Plasma-behandelten Flächen mit Gen-tle Druck und backen sie in Heißluft Ofen bei 50 ° C für 2 Stunden.
  12. Lagern Sie das Gerät in einer sauberen Umwelt für zukünftige Verwendung.

3. Zusätzliche Schritte für Drosophila / Zebrafisch Geräte

  1. Freizulegen sauberen Glasoberfläche der Größe 2 cm X 2 cm mit 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Dampf im Exsikkator für 2 Stunden.
  2. Spin ~ 1 ml 10.01 PDMS Mischung in Schritt 2.1 auf der silanisierten Glasoberfläche unter Verwendung SPIN150 Schleudereinrichtung bei 500 Upm für 35 sec hergestellt. Backen die PDMS beschichteten Glassubstrate in einem Heißluftofen bei 50 ° C für 6 Stunden mit der beschichteten Oberfläche nach oben weist. Lassen Sie die PDMS-Schicht abkühlen auf Raumtemperatur, bevor Sie den nächsten Schritt.
  3. Stanze die beschichtete Schicht unter Verwendung eines speziell angefertigten scharfe Metallspitze Locher in der Mitte des PDMS, die PDMS Abstandsschicht bilden. Die Form des Metalls Stanzer ausgebildet ist ähnlich der Strömung Design für Drosophila / Zebrafisch (L1, 1C
  4. Freilegen PDMS Abstandsschicht und die einzelne gebundene Block (Strömungsschicht und Control-Schicht, im Schritt 2.9 für Drosophila / Zebrafischlarven gemacht) bis 18 Watt Luftplasma Verwendung von Plasma-Reiniger bei niedrigen Vakuum. Platzieren Sie die zwei Plasma behandelten Oberflächen zusammen und backen sie in einem Heißluftofen bei 50 ° C für 2 Stunden.
  5. Ausschneiden der verbundenen Gerät aus dem Glas, Stempel Zugang Löcher an den Einlass und Auslass Reservoirs und Bindung an einen Deckglas (22 x 22 mm, Dicke Nr. 1) unter Verwendung eines Plasma-Reiniger nach Schritt 2,11 erwähnt. Dies würde eine Vorrichtung zur Immobilisierung ersten Larvenstadium Drosophila-Larven mit einer Kanalhöhe von ~ 500 um erzeugen. Für Zebrafischlarven, duplizieren Sie die PDMS Abstandsschicht Herstellungsprozess mit einer zusätzlichen Verklebung Schritt. Die Doppelschicht aus PDMS-S produziert eine Kanalhöhe von 900 um für 30 hfp Zebrafisch-Larven.

Vorsichtsmaßnahmen: Vermeiden Sie Staub Partikel während der Herstellung der Vorrichtung. Zwei Plasma gereinigte Oberfläches brauchen, um vollständig Staub frei für die richtige Bindung. Bewahren Sie die Geräte in einem Exsikkator in Situationen, in denen eine spezielle Reinraum ist nicht verfügbar, um die Ansammlung von Staubpartikeln in Geräten zu minimieren.

4. Mit PDMS Membrane

  1. Das eine Ende eines Mikro-flex (Innendurchmesser ca. 1,6 mm, Außendurchmesser ~ 4,8 mm) zu einem unter Druck stehenden Stickstoff Gaszufuhr Regler und dem anderen Ende mit dem Haupt-Falle Reservoir durch eine 18-Gauge-Nadel (Außendurchmesser ~ 1,25 mm) geklebt, um die Röhre. Ein 3-Wege-Hahn in der Mitte der Rohrverbindung verwendet wird, erlaubt Anwendung oder Freisetzung von Druck auf der Membran.
  2. Das Rohr wird mit dem PDMS-Gerät mit einer 10 cm Säule von destilliertem Wasser vor dem Anschließen an das Reservoir des Haupt-Falle eines C. elegans und / oder Drosophila / Zebrafischlarven Gerät.
  3. Schalten des Ventils der Stickstoffversorgung 14 psi gelesen und überwachen die Membran des Haupt-Falle Ablenken Richtung the Strömungskanal bei geringer Vergrößerung eines invertierten Mikroskops. Länge der Wassersäule in der Mikro-flex Rohr zusammengedrückt wird, wenn das 3-Wege-Hahn geöffnet ist. Kanten des abgelenkten Membran sind im Durchlicht sichtbaren (Abbildung 1I und 1J). Membranauslenkung eine Verschiebung von Staubpartikeln / Blasen unter der PDMS-Membran und drückt sie an den Kanal hinweg.
  4. Warten Sie, bis die Flüssigkeit Frontfills den Mikrokanal ganz ohne Lufteinschlüsse.
  5. Lassen Sie den Druck mit Hilfe der 3-Wege-Hahn, um die Membran in ihre Ruheposition entspannen.

5. Einsetzen C. elegans, Drosophila und Zebrafisch Larven in das Gerät und Immobilisierung sie unter dem Flexible PDMS Membrane

  1. Füllen Sie den Strömungskanal mit M9-Puffer [3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O auf 1 l, mit aut sterilisierenoclaving] für C. elegans 18 oder 1X PBS für Drosophila / Zebrafischlarven 19 für 10 min, bevor ein [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, H 2 O auf 1 L, durch Autoklavieren sterilisieren] Experiment.
  2. Suchen Sie ein einzelnes C. elegans der erforderlichen Stufe auf einem NGM Platte 18 (oder im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven aus Agar Ei Platte oder manuell dechorionated 30 hpf Zebrafischlarven in flüssigem Medium 20) mit einer geringen Vergrößerung Stereomikroskop. Pick ein einzelnes Tier mit einem kleinen Volumen der Pufferlösung in eine Mikrospitze. Verwenden Sie ein Mikro-Spitze mit ihrem Ende geschnitten, um die größeren Drosophila oder Zebrafisch-Larven in Puffer unterzubringen.
  3. Schieben Sie den einzigen Organismus durch den Strömungskanal Einlass. Einstellen der Pipettiervorrichtung Druck, um das einzelne Tier unter dem Haupt-Falle zu positionieren.
  4. Erhöhen des Drucks des PDMS-Membran langsam, um das Tier gegen die chan positionierennel Grenze und immobilisieren mit 14 psi Druck für C. elegans, 7 psi für Drosophila und 3 psi Zebrafisch-Larven.
  5. Positionieren des immobilisierten Tier in der Mitte des mikroskopischen Sichtfeld. Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei gewünschten Einstellungen für Hochauflösung Hellfeld-oder Fluoreszenz-Bildgebung. Erwerben Sie Einzel-oder Zeitraffer-Fluoreszenz-Aufnahmen in vordefinierten Frame-Rate.
  6. Lassen Sie die Trap Druck und Überwachung der Fortbewegung des Tieres für 5-10 min bei niedriger Vergrößerung.
  7. Spülen Sie das Tier und eine neue Tier die obigen Schritte wiederholen.
  8. Waschen Sie alle Tiere aus dem Abfallreservoir mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer Spritze. Trocknen Sie den Kanal, indem Luft mit einer Spritze für die spätere Wiederverwendung.

Vorsichtsmaßnahmen: Tiere, die höhere Pipettieren Druck Strömung innerhalb des Hauptkanals dazu neigen, schlechte Fortbewegung / Gesundheit nach der Entlassung aus der Falle zeigen, und sollte für ima vermieden werdenGing. Reinigen des Strömungskanals für jede Spur von Puffer zu Verstopfung des Kanals durch Kristalle zu verhindern. Wenn Öl für hochauflösende Bildgebung verwendet wird, reinigen Sie das Deckglas in der Lage sein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten für nachfolgende Experimente.

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Representative Results

Die Immobilisierung Vorrichtung eine Doppelschicht PDMS Block durch Verbinden von zwei Schichten hergestellt: einer Strömung Schicht (Schicht 1) und eine Steuereinheit (Schicht 2), wie in Abbildung 1 gezeigt. Die wichtigste Falle an eine Stickstoffgas Zylinder durch einen Regler und einen 3-Wege-Hahn, notwendige (3-14 psi) Druck auf die Membran durch eine Flüssigkeitssäule (1A) gelten verbunden. Der abgelenkte Membran immobilisiert C. elegans, Drosophila oder Zebrafisch-Larven im Strömungskanal mit unterschiedlichen Abmessungen (1B und 1C) ausgebildet ist. Foto Masken werden verwendet, um Fixiereinrichtung Schichten mit unterschiedlichen Geometrien für C. entwerfen elegans (1D), Drosophila-Larven (1F) und Zebrafisch-Larven (Figur 1G). Die Kanalhöhe der Strömung Schicht (h1 in 1E, 1K) variiert wurde mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten Schleuderbeschichtung zur Aufnahme oderOrganismen verschiedener Durchmesser innerhalb des Strömungskanals. Flow Schichthöhen wurden bei 40 um, 80 um 500 um und 900 um für C. hergestellt elegans Larvenstadien, adult C. elegans, im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven (Tabelle 1). Die Vorrichtung mit einem Strömungskanal Höhe von 40 um ist zweckmäßig von L1 bis L4 frühen C. elegans Larven. Ein Gerät mit einer 80 um Strömungskanal Höhe ist für Ende L4-Larven und erwachsene C eingesetzt elegans wenn der Vulva beginnt vorstehen. Die größeren Zebrafisch-Geräte können auch für ältere Drosophila-Larven eingesetzt werden. Die PDMS-Membran Dicke (m) wurde bei 40 um und 300 um für C. hergestellt elegans und Drosophila / Zebrafisch-Geräte sind. Die Höhe des Mikrofluidkanals in Schicht 2 wurde bei 40 um für frühe Larvenstadien von C. gefertigt elegans und 80 um für den späten Larvenstadien von C. elegans und Drosophila/ Zebrafisch-Larven. Die Höhe des Strömungskanals, Membran-und Steuerkanal wurden in Geräten in mehreren unabhängigen Chargen hergestellt und vermessen wurden als höchstens ± 5 um von einander konsistent. Das Gerät verwendet einen Membranauslenkung Technik (Figur 1H-J), um Organismen in dem Strömungskanal zu immobilisieren.

Organismen Strömungskanal (PDMS-1) Spin Bedingungen für Strömungskanal Spacer PDMS (PDMS-S) Spin Bedingungen für Abstandhalter PDMS Immobilisierung Druck (psi)
C. elegans (L1 bis L4 frühen) 40 um (SU8-2025) 500 rpm (5 sec), 2.000 rpm (30 sec) NA NA 14
C. elegans (Ende L4 und Erwachsene) 80 μ m (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2.000 rpm (30 sec) NA NA 14
Drosophila (erstes Larvenstadium) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2.000 rpm (30 sec) 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sec) 7
Zebrafisch (30 hpf) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2.000 rpm (30 sec) 2x 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sec) 3

Tabelle 1. Geräteabmessungen des Strömungskanals (PDMS-1) und Abstandshalter PDMS-Schicht (PDMS-S) in C verwendet elegans und Drosophila / Zebrafisch-Geräte.

C. elegans L4-Larven wurden in der 80 um Kanalhöhe PDMS Mikrofluidikvorrichtung mit 14 psi Stickstoffgas (2A) immobilisiert. Zeitraffer-Fluoreszenz-Aufnahmen were mit der Geschwindigkeit von 2 Bildern pro Sekunde (fps) mit einem 60X Objektiv (numerische Apertur 1,4, Öl-Objektiv) zum Abbilden Transport von Mitochondrien erworbenen visualisiert mit einer mitochondrialen Matrix gezielte GFP in den Tastrezeptorneuronen 21. Alle 400 Bilder wurden unter Verwendung Kymographen ImageJ (umgerechnet www.rsbweb.nih.gov / ij ) und Mitochondrien wurden als anterograd gerichtet (weg vom Zellkörper) retrograd gerichtet (in Richtung der Zellkörper) oder stationäre (2E) klassifiziert. Wir beobachteten mitochondrialen Transport bis 21 psi der Immobilisierung Druck, aber der Fluss war etwas höher auf der untersten Immobilisierung Druck. Die anterograde und retrograde Fluss der Mitochondrien wurden gemessen, um 1,1 ± 0,23 und 1,6 ± 0,22 werden bei 7 psi während 0,8 ± 0,25 und 1,2 ± 0,34 bei 14 psi Immobilisierung Druck. Die Werte waren statistisch nicht unterschiedlich von 1,1 ± 0,33 und 1,3 & plusmn; 0,42 von Tieren gewonnen immobilisiert mit 3 mM Levamisol (p-Werte> 0,45, n = 30 Tiere).

Die größeren Geräte mit 500 um Höhe kann verwendet werden, um im ersten Larvenstadium Drosophila-Larven (2B) und 28-30 hpf Zebrafischlarven (Abbildung 2D) immobilisieren. Dissektion der ersten Larvenstadien Drosophila-Larven kann schwierig sein. Dagegen Mikrofluidikvorrichtungen stellen ein Verfahren zur Hochauflösung Hellfeld und / oder Fluoreszenz-Bildgebung unter Verwendung von intakten Organismen durchzuführen. Individuelle Drosophila-Larven immobilisiert wurden mit 7 psi von komprimierten Stickstoff (2B, Tabelle 1) und Fluoreszenz-Bilder von synaptotagmin.eGFP Transport in sensorischen Neuronen erworben wurden (Abbildung 2C). Zeitraffer-Filme zeigten sich bewegenden und stationären Synaptotagmin markierte Fracht in sensorischen Neuronen (2F). Durchschnittliche anterograde und retrograde Geschwindigkeit wurde von kym gemessenographs bis 0,92 ± 0,04 um / s und 1,00 ± 0,05 um / s bzw. (n = 6 Tiere, n> 40 Segmente) sein. Diese sind vergleichbar mit Geschwindigkeiten Synaptotagmin tragenden Transportvesikel in Drosophila seziert Motoneuronen Bewegen sowohl anterograd (0,84 ± 0,05 um / s) und retrograd (0,76 ± 0,03 um / s) 22 gemessen.

Ähnliche Geräte mit 900 um Höhe wurden verwendet, um verschiedene Stufen der Zebrafisch-Larven (2D, Tabelle 1) zu fixieren. Zebrafischlarven während seiner frühen Entwicklungsstadien Flips seinen Schwanz alle 10 bis 15 Sekunden und werden normalerweise immobilisiert mit 0,02% Tricain (MS-222) in Lösung oder auf Montage Medien für hochauflösende Bildgebung 23. Unsere PDMS Vorrichtung bietet eine alternative Einrichtung für schnelle Immobilisierung und beseitigt die Notwendigkeit eines unzuverlässigen Eindeckmedium im optischen Pfad während hochauflösende Abbildung 24. Wir manuell dechorionated 28-30 hpf Larven und immobilisiert sie einzeln in einem PDMS-Gerät mit 3 psi Stickstoffgas Zeitraffer-Filme der Larven Herzschlag zu erwerben. Die Rate des Herzschlags gemessen wurde, um 136,8 von ± 1,6 pro min (n = 8 Filme) und war ähnlich wie in anderen veröffentlichten Berichten 25.

Unsere einfache Mikrofluidik-Vorrichtung war bereits für die Messung einer Vielzahl von Sub-und zelluläre Ereignisse in Wildtyp-C nachgewiesen elegans 4. In unserem mikrofluidischen Vorrichtung, Wildtyp C. elegans zeigen eine größere Anzahl von Fracht wie synaptischen Vesikeln, die in Neuronen bewegen Vergleich zu Tieren, die mit immobilisierten Anästhetika werden. Allerdings hatten wir nicht unsere Geräte für mutierten Tieren getestet, um zu sehen, ob diese Befunde für wahr halten. Um diesen Test verwendeten wir eine starke hypomorphen Mutante im kinesin3 / UNC-104 molekularer Motor, unc-104 (e1265), die pre-synaptischen Vesikeln transportiert 26. Wir verglichen den Fluss der GFP :: RAB-3 markierten präsynaptischen Vesikelnpartikel in vordere laterale mechanosensorischen Neuronen in Anästhetikum immobilisiert und Vorrichtung immobilisiert Mutante aniamls (Abbildung 3A). Fluss von präsynaptischen Vesikeln war größer Flusses im Gerät immobilisiert Tiere gemäß Daten von unc-104 Tiere betäubt in 1 mM Levamisol (3B, 3C) 27 erworben verglichen. Dies zeigt, dass die Bildgebung starken Verkehrs Mutanten in mikrofluidischen Systemen wahrscheinlich ein effizientes Mittel zur Erhebung von Daten zu sein. Wir zeigen auch, dass andere Ladung zB dendritische Transport von Glutamat-Rezeptoren in URY Neuronen können im Gerät immobilisiert Tiere abgebildet werden (Abbildung 3D, 3E). Das Gerät kann auch zur Bilder zelluläre Prozesse in der frühen C eingesetzt werden elegans Entwicklung wie Q Neuroblast Division L1 Tiere. Der QR-Zelle wurde abgebildet, um zu teilen, um zwei Tochterzellen QR.a und QR.p ~ 3 Stunden nach dem Schlüpfen (3F) im Einklang mit bildenfrühere Beobachtungen 28.

Tabelle 1. Geräteabmessungen des Strömungskanals (PDMS-1) und Abstandshalter PDMS-Schicht (PDMS-S) in C verwendet elegans und Drosophila / Zebrafisch-Geräte.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung des PDMS mikrofluidischen Systemen für genetische Modellorganismen. (A) Der Organismus wird unter Verwendung eines geladenen Mikrospitze in den Strömungskanal und immobilisiert Verwendung komprimiertes Stickstoffgas kontrolliert unter Verwendung eines Reglers und Ventil. Das Gerät ist geeignet für Hellfeld / Fluoreszenz-Bildgebung in einem inversen Mikroskop. Die Konstruktion besteht aus einem 10 mm langen Strömungskanal (Design I, L1) und einem Steuerkanal (Design II, L2) jeweils für C. elegans (B) und Drosophila / Zebrafisch-Larven (C). Die Abmessungen sind auf die Gestaltung (B und C) angegeben. (D, F, G) Schematische Darstellung der verss Schichten aus PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS-Membran, PDMS-S und Glas e) in einer C. elegans, Drosophila und Zebrafisch Fixiereinrichtung. (E) Schematische Darstellung eines Querschnitts der Vorrichtung zeigt den Bulk-PDMS-Schicht (PDMS-2), ein Spin beschichteten PDMS-Schicht (PDMS-1), eine flexible Membran und einen Abstandshalter PDMS-Schicht (PDMS-S) zum Hinzufügen zu bilden Raster zum Strömungskanal (für Drosophila / Zebrafisch-Gerät). Die gesamte Struktur ist irreversibel zu einem optischen Grade Deckglas den Organismus (Kreis in braun) Platz gebunden. Die schematische zeigt Höhe des Steuerkanal 'h2', Strömungskanal 'h1', gestanzt Abstandsschicht 's' und Membrandicke 'm'. (H) Zeigt die Membranauslenkung in Richtung des Strömungskanals in Gegenwart Flüssigkeitssäule unter Druck in dem Steuerkanal. Hellfeld Bilder werden einer freien (I) und umgelenkt Membran (J) unter Null gezeigt und 14 psi unter Druck gesetzt bzw. Flüssigkeitssäule. Der Pfeil und Pfeilspitze zeigen bubble under und aus der Membran in dem Strömungskanal sind. (K) Cross Schnittbild des C. elegans Vorrichtung an der Stelle der Immobilisierung Bereich ergriffen. Maßstabsbalken 50 um (K) und 200 um (I, J). (D, F, G) Schaltpläne sind nicht maßstabsgetreu. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Imaging genetischen Modellorganismen immobilisiert in einer mikrofluidischen Vorrichtung. Hellfeldbild eines immobilisierten C. elegans (A), einen ersten Larvenstadium Drosophila-Larven (B) und eine 30 hpf Zebrafischlarven (D) in einem PDMS Mikrofluidikvorrichtung. Kymograph Analyse von Zeitraffer-Aufnahmen von jsIs609, ein C. elegans-Stamm, Exprimieren eines mitochondrialen Matrix gezielte GFP in einer vorderen seitlichen mechanosensorischen Neuron (ALM) einer Vorrichtung immobilized Tieres (E). Mitochondrien sind als anterograde ('down' Pfeilspitze), retrograde ('up' Pfeilspitze) und stationären ("Stern"-Zeichen) klassifiziert in der kymograph. (C) Fluoreszenzbild einer intakten ersten Larvenstadium Drosophila Larve. Die Box zeigt die Stelle, wo hohe Auflösung Zeitraffer-Aufnahmen von syt.eGFP Transport in einem cholinergen Neurons erfolgt. Montage von fünf Rahmen mit 5 Hz mit Rahmennummern erworbenen angedeutet an jedem Bild und GFP markierten Ladung als anterograde, retrograde und stationär in der Montage (F) gezeigt. Der Kasten in (D) zeigt den Bereich, der für die Berechnung der Geschwindigkeit der Herzschlag Zebrafischlarven überwacht wurde. Maßstabsbalken 5 um ist (F), 10 um (E), 100 um (A, B) und 200 um (D).

Abbildung 3
Abbildung 3. Cellular and sub-zellulären Bildgebung in C. elegans mit PDMS mikrofluidischen Bauteilen. (A) Schematische Darstellung einer Ameiseerior seitlichen mechanosensorischen (ALM) Neuron mit der anterograde und retrograde Richtungen markiert. Die gestrichelte Box zeigt die Region für axonalen Transport abgebildet. 350 Bilder erworben werden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops Rotationsscheibenreaktoren bei 5 fps mit Zellkörper (CB) auf der rechten und Nerv Ring (NR) auf der linken Seite. Daten werden mittels Kymographen für Tiere in einer Vorrichtung immobilisiert oder mit 1 mM Levamisol (C). Fracht bewegt sich in anterograde und retrograde Richtungen dargestellt mit Pfeilen 'down' und 'up' auf. (B) Anterograde und retrograde Fluss der Partikel in unc-104 (e1265) Tiere in einem 20 um Bereich des ALM Neuron über 350 Zeitraffer-Frames beobachtet. (D) Schematische Darstellung eines URY Neuron zur Abbildung GFP markiert Glutamatrezeptoren Verkehr. 350 Zeitraffer-Frames werden in Kymographen die Ladung zeigen sich in der anterograde und retrograde Richtungen Tieren in PDMS Vorrichtung immobilisiert oder mit 1 mM Levamisol (E) umgewandelt. Zeitraffer-Bilder während Q Neuroblast di erworbenenVision und Migration in frühen Larvenstadien von C. elegans. (F) Drei Zeitraffer-Frames, die QR unterziehen Sparte zeigen bilden ihre Tochterzellen QR.a und QR.p. Maßstab ist 5 um (C, E und F). Daten in (B) dargestellt wird Mittelwert ± SEM (n> 4). Vergleiche mit Werten in Bezug auf Anästhetikums erhalten wird und mit * (p <0,05) und ** (p <0,005).

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Discussion

PDMS Mikrofluidik-Geräte sind optisch transparent daher kann für hochauflösende in vivo Bildgebung von jedem transparente / transluzente Modellorganismus verwendet werden. Unser Design ist geeignet für hohe Vergrößerung räumlich-zeitliche Darstellung von zellulären und sub-zellulären Ereignissen in intakten lebenden Tieren. Microfabrication mit weichen Lithographie-Techniken ermöglicht eine leichte Handhabung des Gerätes Abmessungen für verschiedene Größen von Modell-Organismen. Geräte in verschiedenen Größen sind für verschiedene Stufen der C hergestellt elegans, Drosophila-Larven und Zebrafisch-Larven. Geräte mit unterschiedlichen Höhen von 40 um und 80 um in ihrer Strömungsschicht Kanälen zeigen verbesserte Immobilisierung und bessere post-Bildgebung Gesundheit sowohl frühe (L1) und später (späten L4) Stufen von C. elegans sind. Erreichen wir eine Erfolgsquote von 100% in Bauelementherstellung für C. elegans und Drosophila / Zebrafisch ohne defekte Geräte. Die Geräte können mehrere Male, bis verwendet werdender Steuerkanal mit Staubteilchen oder Bakterienwachstum kontaminiert. Vorrichtung immobilisiert C. elegans zeigen größere Ladung Fluss in sowohl Wildtyp und Mutante Tieren, wenn sie narkotisiert Tieren verglichen. Gerät Immobilisierung eliminiert die Notwendigkeit für technisch anspruchsvolle Dissektion Protokolle vor allem für die frühe Entwicklungsstadien von Drosophila-Larven 29.

Momentaner Immobilisierung Protokolle in PDMS Mikrofluidik-Geräte haben eine inhärente Vorteil der Reduzierung experimentellen Zeit wie den in der Regel längere Belichtungszeiten von außen angelegte Anästhesie erforderlich verglichen. Alle immobilisierten Organismen zur normalen Fortbewegung innerhalb von 5-10 min nach der Freigabe des Druckes auf den verformbaren PDMS-Membran. C. elegans sind an der Grenze zwischen dem Strömungskanal und weg von dem zentralen Abschnitt der Immobilisierung Membran immobilisiert. Tiere in der Mitte des Strömungskanals immobilisiert zeigen, schlechte Gesundheit post-Immobilisierungtion und sterben innerhalb eines Tages oder zwei. Unsere Mikrofluidikvorrichtung wurde zur L4-Stadium C. halten elegans immobilisiert für bis zu einer Stunde unter der Membran, ohne dabei die Gesundheit oder nachfolgende Entwicklung. Tiere für kürzere Zeiten (bis zu 10 min) immobilisiert konnte mehrmals zum Abbilden eingefangen werden. Für die frühen Entwicklungsstadien, C. elegans wurden mit leichten Unterdruck (7 psi) für längerfristige Zeitraffer-Experimente (~ 3 h) immobilisiert. Tiere unter der Membran nach der Freisetzung immobilisiert wurden in der gleichen Vorrichtung in der dazwischenliegenden Zeit. Diese Tiere sind vergleichbar mit Wildtyp sowohl in ihrer Entwicklung und die allgemeine Gesundheit. Adult C. elegans mit niedrigerem Druck (7 psi) immobilisiert zeigten langsame Drift bei hoher Auflösung Zeitraffer-Experimente und erfordern komplexe Analyse-Tools für den Transport Analyse. Allerdings niedrigere Drücke wurden verwendet, um längerfristige Studien wie Q Neuroblast Zellteilung / Migration über ~ 3 Stunden oder semi-quantitative mitoch durchführenondria transport Charakterisierung; Prozesse, die nicht brauchen vollständige Immobilisierung. So niedrigeren Drücken der Immobilisierung kann je nach Datenmenge, die gesammelt werden muss.

Zeitraffer-Aufnahmen von L4 C. elegans zeigt saltatory Bewegung GFP markiert in der ALM Neuron (Stamm jsIs609) Mitochondrien wie für Neuronen in anderen Modellsystemen 30-32 berichtet. Einige Mitochondrien in diesen Neuronen zeigen bidirektionalen Transport, während die meisten von ihnen über die Dauer des Films sind stationär. Trotz der geringen Unterschiede im Fluss geht es weiter mit 14 psi Immobilisierung Druck im Fall von C. elegans, um eine vollständige Immobilisierung zu erhalten und vermeiden Sie jegliche Drift bei hoher Auflösung Zeitraffer-Aufnahmen der axonalen Transport. Wir schlagen vor, unter Verwendung von 14 psi in einem allgemeinen Protokoll und je nach Bedarf experimentellen dies kann entweder erhöht oder verringert. Tiere dauerte fast zur gleichen Zeit, um zum normalen locomotio zurückn aus beiden unteren und oberen Immobilisierung Drücke und immobilisiert Tiere entwickelten identisch zu denen ohne Immobilisierung gewachsen.

Das Gerät, wenn unter Verwendung größerer Dimensionen mit Abstandsschichten können für größere Modellorganismen wie Drosophila und Zebrafisch-Larven eingesetzt werden. Imaging von synaptotagmin.eGFP Transport in intakten ersten Larvenstadium Drosophila sensorischen Neuronen zeigt aktive Transport in beide anterograde und retrograde Richtungen. Die mittlere Geschwindigkeit in der Vorrichtung immobilisiert Larven gemessenen höheren zu den Werten in seziert Motoneuronen 22 gemessen verglichen. Dieser Unterschied kann von einer schnelleren Erfassung der Daten in unseren Experimenten (5 hz v / s 1,1-1,4 hz), Neuronen-spezifische Unterschiede in Organellentransport (sensorische v / s Motoneuronen) und / oder die Auswirkungen aufgrund der Dissektion entstehen.

Unsere vorherige Versuche wurden ausschließlich in Wildtyp-Tieren 4 durchgeführt, so werden wir prüfen, obImaging-Mutanten in mikrofluidischen Systemen war auch vorteilhaft. Zeitraffer-Aufnahmen von C. elegans L4 Tieren zeigt reduziert Fluß von GFP :: RAB-3 markierte präsynaptischen Vesikeln in kinesin3/unc-104 Mutanten in 1,0 mM Levamisol immobilisiert um Flussmessungen bei Tieren erhaltenen immobilisierten Verwendung unserer PDMS Gerät (3B) verglichen. Wir haben oft beobachtet und zeigen ein Beispiel (3C), die in Mutanten sehr wenig Verkehr beobachtet, wenn die Tiere immobilisiert sind mit Betäubung Konzentrationen, die Wildtyp-Tieren immobilisieren wird. Die Zahlen von Vesikeln Bewegung in unc-104 Tieren ist signifikant höher, wenn wir Mikrofluidik-Geräte verwenden. Narkotisierten Tieren ähnliche Transporteigenschaften, wenn sie unter 14psi Druck auf die PDMS-Membran (3B) platziert. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in Wildtyp-Tieren 4 gemacht. Diese Daten legen nahe, dass die erhöhten Fluss wahrscheinlich nicht von im ergebenMobilisierung unter Stickstoff aber aufgrund eines Protokolls, das weniger schädlich für die intra-zellulären Transport war.

Prinzipiell können andere Ereignisse, wie Calcium Dynamik und Zellteilung alle in intakten Drosophila / Zebrafischlarven abgebildet als gut. Post-Bildgebung Rückgewinnung von Gerät immobilisiert Tieren weniger abträglich Organismus Lebensfähigkeit 4 und damit solche Vorrichtungen können auch verwendet werden, um langfristige Bildgebung von genetischen Modell genetischen Organismen für Ereignisse, die über längere Zeiträume auftreten, durchzuführen.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Krishanu Ray for Drosophila Aktien, Tarjani Agarwal für die Aufrechterhaltung einer Drosophila Käfig, Peter Juo für nuIs25 und CGC für C. elegans Stämme. SPK gemacht jsIs609 in Michael Nonett Labor. Wir danken Arpan Agnihotri (BITS Pilani) für seine Hilfe bei Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien Transport von jsIs609 Tiere in mikrofluidischen Bauteilen. Wir sind dankbar, dass Dr. Vatsala Thirumalai und Surya Prakash, die uns mit Zebrafischembryonen. Wir danken Herrn Dr. Krishna und CIFF am NCBS für die Nutzung des Spinning Disc konfokalen Mikroskop durch das Department of Science and Technology-Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005) unterstützt. Wir danken auch Kaustubh Rau, V. Venkatraman und Chetana Sachidanand für Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der DBT Postdoc-Stipendium (SM), DST Fast-Track-System (SM) und DBT Zuschuss (SPK) finanziert. SA wurde von DST und CSIR Zuschüsse SPK unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

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References

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Bioengineering Molekularbiologie Neurowissenschaften Mikrofluidik, Zebrafischlarven Anästhesie pre-synaptischen Vesikel Transport dendritischen Transport von Glutamat-Rezeptoren mitochondriale Transport Synaptotagmin transport Herzschlag
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