Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Enkle Microfluidic enheter for Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

En enkel microfluidic enheten er utviklet for å utføre bedøvelse gratis

Abstract

Mikro fabrikkert fluidic enheter gir et tilgjengelig mikro-miljø for in vivo studier på små organismer. Enkle fabrikasjonsprosesser er tilgjengelig for microfluidic enheter ved hjelp av myke litografi teknikker 1-3. Microfluidic enheter har blitt brukt for sub-cellulære 4,5 avbildning, in vivo laser mikrokirurgi 2,6 og cellulær imaging 4,7. In vivo avbildning krever immobilisering av organismer. Dette er oppnådd ved hjelp av sug 5,8, koniske kanaler 6,7,9, deformerbare membraner 2-4,10, sugekopper med ekstra kjøling 5, anestesi gass 11, temperatursensitive gels 12, cyanoakrylat lim 13 og bedøvelsesmidler som levamisol 14 , 15. Brukte bedøvelse påvirker synaptisk transmisjon 16,17 og er kjent for å ha skadelige effekter på sub-mobilnettet neuronal transport 4. I denne mUdy vi demonstrere en membran basert poly-dimetyl-siloksan (PDMS) enhet som gjør at bedøvelse gratis immobilisering av intakte genetiske modellorganismer som Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larver og sebrafisk larver. Disse modellorganismer er egnet for in vivo studier i microfluidic enheter på grunn av sine små diametre og optisk gjennomsiktig eller gjennomskinnelig organer. Body diameter varierer fra ~ 10 um til ~ 800 mikrometer for tidlige larvestadier av C. elegans og sebrafisk larver og krever microfluidic enheter i forskjellige størrelser for å oppnå fullstendig immobilisering for høy oppløsning time-lapse imaging. Disse organismene er immobilisert ved hjelp av trykk som påføres av komprimert nitrogen gass gjennom en væskesøyle og avbildes ved hjelp av en invertert mikroskop. Dyr løslatt fra fellen tilbake til normal bevegelse innen 10 min.

Vi viser fire søknader om time-lapse bildebehandling i C. elegansnemlig bildebehandling mitokondrie transport i nevroner, presynaptiske vesicle transport i en transport-defekt mutant, glutamat reseptor transport og Q neuroblast celledeling. Data fra slike filmer viser at microfluidic immobilisering er et nyttig og nøyaktige måte å skaffe in vivo data for cellulære og sub-cellulære hendelser når sammenlignet bedøvede dyr (figur 1J og 3C-F 4).

Enhet dimensjoner ble endret for å tillate time-lapse avbildning av ulike stadier av C. elegans, første stadium Drosophila larver og sebrafisk larver. Transport av vesikler merket med synaptotagmin merket med GFP (syt.eGFP) i sensoriske nevroner viser rettet bevegelse av synaptiske vesicle markører uttrykt i kolinerge sensoriske nevroner i intakt første stadium Drosophila larver. En lignende enhet har blitt brukt til å utføre time-lapse avbildning av hjerteslag i ~ 30 hr innlegg fertilisering (HPF)sebrafisk larver. Disse dataene viser at de enkle enheter vi har utviklet kan brukes til en rekke modellsystemer studere flere cellebiologiske og utviklingsmessige fenomener in vivo.

Protocol

1. Su8 Master Fabrication

  1. Designe microfluidic strukturer ved hjelp Clewin programvare og skrive den med 65024 DPI laser plotter med minimum funksjon størrelse på 8 mikrometer på kretskortet film.
  2. Ren 2 cm x 2 cm silisiumskiver med native oksyd i 20% KOH i 1 min og skyll i deionisert vann; en wafer hver for flyten laget og dens tilhørende kontroll laget.
  3. Føn bitene med nitrogengass og dehydrerer på en varm plate ved 120 ° C i 4 timer. Tillat brikkene til å kjøle ned til romtemperatur før du fortsetter til neste trinn.
  4. Sted silisium brikker, ett om gangen på spinner chuck og slå på vakuum. Dekker silisium flater med ~ 20 ul heksametyl-disilazane (HMDS) og belegge dem med en SPIN150 spinner ved 500 opm i 5 sek etterfulgt av 3000 rpm i 30 sek.
  5. Dekke silisiumskiver helt med ~ 1,5 ml Su8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) og belegge wafere hjelp SPIN150 spinner ved 500 opm i 5 sek etterfulgt av 2000 rpm i 30 sek. Denne spinne protokollen produserer en fotoresist tykkelse ~ 40 um som er egnet for kontroll og strømningsverdier lag for tidlige larvestadiene av C. elegans.
  6. Spin ~ 1,5 ml Su8-2050 ved hjelp av SPIN150 spinner ved 500 opm i 5 sek etterfulgt av 2000 rpm i 30 sekunder for å oppnå en tykkelse av fotoresist ~ 80 um som er egnet for flyt layer fabrikasjon for sene larvestadiene av C. elegans, basal flyt lag for Drosophila / sebrafisk larver og tilhørende kontrollsystemer lag.
  7. Plasser silisium brikker på varm plate med Su8 belagt lag på toppen. Myk bake de belagte silisium brikkene på 65 ° C i 1 min, etterfulgt av 95 ° C i 10 min. Tillat brikkene til å kjøle ned til romtemperatur før du fortsetter til neste trinn.
  8. Plasser soft-bakt silisium brikker på eksponeringen scenen med Su8-2025 belagt suransikt på toppen vender UV lampe. Bruke bildet maske med design I (L1, figur 1B) og design II (L2, figur 1B) for flyten laget og kontroll lag mønster henholdsvis for tidlig larvestadier av C. elegans. Plasser fotografiet maske oppå Su8 lag og sikrer masken ligger flatt mot den belagte lag. Åpne lukkeren av UV-lampen og utsett soft-bakt Su8 wafere til 200 watt UV lampe gjennom bilder maske for 15 sek.
  9. Bruke bildet maske med design I (L1, figur 1B) og design II (L2, figur 1B) på Su8-2050 belagte stykker (utarbeidet i trinn 1.6) å dikte flyten laget og kontroll lag for sent larvestadier av C. elegans. Bruke bildet maske med design I (L1, figur 1C) og design II (L2, figur 1C) for basal flyt lag og kontroll lag henholdsvis for Drosophila / sebrafisk larver på wafere belagt med Su8-2050 (utarbeidet in trinn 1.6). Avdekke Su8 overflater gjennom bilder masken til 200 watt UV lampe for 15 sek.
  10. Plasser de eksponerte silisium stykker på en varm plate med den belagte lag på toppen. Innlegg bake wafere ved 65 ° C i 1 min, etterfulgt av 95 ° C i 10 min. Tillat brikkene til å kjøle seg ned før du går videre til neste trinn.
  11. Utvikle bitene ved hjelp Su8 fremkallerløsning for 20 min. Skyll bitene i Iso-propylalkohol (IPA) og blåse tørt med nitrogengass.
  12. Plasser silisium brikker i en eksikkator med Su8 mønster på toppen. Coat bitene med 50 pl tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorinert) silan damp i en eksikator i 2 timer.

Forholdsregler: Ta sikkerhetsforanstaltninger for håndtering av kjemikalier under KOH behandling, fotoresist belegg og utvikling. Silan damp belegg bør utføres i en desikator i et ventilert område. Beskytt Su8 motstå fra over eksponering for lys. Bruk vernebriller med UV LIGht kilde.

2. PDMS Mold Fabrication

  1. Forbered 10:01 PDMS ved å kombinere 50 g Sylgard 184 base med 5 g herder i en plastkopp. Bland innholdet manuelt for ~ 3 min. Degas blandingen inne i en eksikator for å fjerne alle luftbobler dannet under blanding.
  2. Hell en 5 mm tykk PDMS blandingen over silisiumskiver med Su8 mønster av motivet II, for kontroll lag, forsiktig for å unngå dannelse av luftbobler. I tilfelle bobler dannes ved å helle, Degas den PDMS på Su8 mønster i lavt vakuum for å fjerne alle boblene.
  3. Plasser silisiumskiver med Su8-2025 mønster av design jeg, for flyten laget, på spinner chuck og slå på vakuum for å holde dem. Dekk wafere med ~ 1 ml PDMS blanding og belegge wafere hjelp SPIN150 spinner ved 500 opm i 5 sek etterfulgt av 1500 rpm i 30 sek.
  4. Belegge ~ 1 ml PDMS blanding på silisiumskiver med 80 mikrometer Su8-2050 mønster av motivet I (L1, figur 1B), forflyt lag for sent larvestadier av C. elegans bruker SPIN150 spinneren ved 500 rpm i 5 sek etterfulgt av 1000 rpm i 30 sek. Coat et tykt lag av PDMS mix på silisium brikker med Su8-2050 mønster av flyt lags design I (L1, figur 1C) for Drosophila / sebrafisk larver, ved hjelp SPIN150 spinner på 500 rpm for 35 sek.
  5. Bake PDMS belagt silisium biter av design jeg og wafere med tilsvarende utforming II for kontroll lag som inneholder PDMS for C. elegans og / eller Drosophila / sebrafisk larver i en varm luft konveksjonsovn ved 50 ° C i 6 timer.
  6. Klipp ut PDMS stykke fra silisiumsubstrat inneholder Su8 mønster II for C. elegans og / eller Drosophila / sebrafisk larver ved hjelp av en skarp kniv. Punch et lite hull på ~ 1 mm diameter på toppen av reservoaret forbinder hoved felle i PDMS formen ved hjelp en Harris puncher.
  7. Plasser stemplet PDMS blokken (inneholdende 40 um tykke støpeform for kontrolllags L2) på et plastbrett, med den støpte side av styrelaget vendt opp. Plasser PDMS belagt silisium wafer inneholder de 40 mikrometer tykk Su8 design jeg på samme magasin, med PDMS overflate vender opp. Sett inn skuffen inne i kammeret av plasmarenser og slå på vakuum i 2 min. Deretter slår du på plasma makt og senke kammertrykk til kammeret blir lys rosa i fargen. Eksponer begge flatene til 18 watt air plasma under lav vakuum i 2 min.
  8. Plasser slo PDMS blokken fjernet fra de 80 mikrometer tykk Su8 master inneholder mønster II for sent larvestadier av C. elegans eller Drosophila / sebrafisk larver på et plastbrett med støpte siden av kontroll lag opp. Plasser den tilsvarende bakt PDMS lag spinn belagt på silisiumskiven inneholdende 80 um tykk design jeg for senere C. elegans stadier eller Drosophila / sebrafisk larver samtidig på samme magasin med den flate PDMS belagt surface opp. Bruk samme protokollen nevnt ovenfor å utsette dem for luft plasma.
  9. Plasser de to plasma behandlede overflater for C. elegans og / eller Drosophila / sebrafisk larver sammen med lett trykk og bake dem i varmluft konveksjonsovn ved 50 ° C i 2 timer.
  10. Klipp ut limte enhetene fra silisium underlaget med Su8 design jeg for C. elegans og / eller Drosophila / sebrafisk larver. Punch tilgangshullene ved innløp og utløp reservoarer av strømningskanalen.
  11. Plasser limt PDMS mold på et plastbrett for C. elegans, med den støpte side av flyten lags design vendt opp. Rene glass dekkglass (22 X 22 mm, nr. 1 tykkelse) og legg den på samme plast skuffen. Sett inn skuffen som inneholder PDMS mugg og glass dekkglass inne i plasma kammeret. Eksponer bunnen PDMS overflaten av innretningen og glass dekkglass til 18 watt air plasma ved lavt trykk i 2 min. Plasser de to plasma behandlede overflater med gentle trykk og bake dem i varmluft konveksjonsovn ved 50 ° C i 2 timer.
  12. Oppbevar telefonen i et rent miljø for fremtidig bruk.

3. Flere trinn for Drosophila / Sebrafisk Device

  1. Eksponer ren glassflate størrelse 2 cm x 2 cm med 50 pl tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorinert) silan damp i en eksikator i 2 timer.
  2. Spinn ~ 1 ml 10:01 PDMS mix utarbeidet i trinn 2.1 på silanbehandlede glass overflate ved hjelp SPIN150 spinner på 500 rpm for 35 sek. Stek PDMS belagt glass substrater i en varmluftsovn ved 50 ° C i 6 timer med den belagte overflaten vender opp. La PDMS laget for å kjøle seg ned til romtemperatur før du fortsetter til neste trinn.
  3. Punch belagt lag med en tilpasset bygget skarp metall puncher ved midten av PDMS, å danne PDMS spacer lag. Formen av metallet puncher er utformet lik den flyten design for Drosophila / sebrafisk (L1, figur 1C
  4. Utsett PDMS spacer laget og single-limt blokk (flow lag og kontroll lag, gjorde i trinn 2.9 for Drosophila / sebrafisk larver) til 18 watt luft plasma bruker plasma renere på lavt vakuum. Plasser de to plasmapistoler behandlede overflater sammen og bake dem i en varmluftsovn ved 50 ° C i 2 timer.
  5. Skjær limt enheten fra glass, punch tilgang hull på innløp og utløp reservoarer og obligasjonsfond det til et glass dekkglass (22 X 22 mm, nr. 1 tykkelse) med en plasma renere som nevnt i trinn 2.11. Dette ville frembringe en immobilisering enhet for første instar Drosophila larver med en kanal høyde ~ 500 mikrometer. For sebrafisk larver, duplisere PDMS spacer lag fabrikasjon prosessen med en ekstra binding trinn. Den doble lag av PDMS-S produserer en kanal høyde på 900 mikrometer i 30 HFP sebrafisk larver.

Forholdsregler: Unngå støvpartikler under enheten fabrikasjon. To plasma rengjorte overflatenbehov for å være helt støvfritt for riktig binding. Oppbevar enheter i et eksikator i situasjoner der en spesiell clean room er ikke tilgjengelig for å minimere opphopning av støvpartikler i enheter.

4. Bruke PDMS Membran

  1. Koble en ende av en mikro-flex rør (indre diameter ~ 1,6 mm, ytre diameter ~ 4,8 mm) til en trykksatt nitrogengasstilførsel regulator og den andre enden til de viktigste felle reservoaret gjennom en 18 gauge kanyle (ytre diameter 1,25 mm ~) limt til røret. En 3-veis stoppekran brukt i midten av rørforbindelse tillater applikasjon eller utslipp av trykk på membranen.
  2. Fyll røret koblet til PDMS enheten med en 10 cm kolonne av destillert vann før den kobles til reservoaret av viktigste felle av en C. elegans og / eller Drosophila / sebrafisk larver enhet.
  3. Skru ventilen av nitrogentilførsel lese 14 psi og overvåke membranen av viktigste fellen deflecting mot the strømningskanalen ved lav forstørrelse av en omvendt mikroskop. Lengde av vannsøylen i mikro-flex røret komprimeres når 3-veis stoppekran er åpen. Kantene av deflected membran er synlige i overført lys (Figur 1I og 1J). Membran avbøyning forårsaker forskyvning av støvpartikler / blærer under PDMS membran og presser dem til kanalen grenser.
  4. Vent til flytende foran fyller microchannel helt uten innestengt luft.
  5. Avlaster trykket ved hjelp av 3-veis stoppekran å slappe membranen til sin hvileposisjon.

5. Sette C. elegans, Drosophila og Sebrafisk larvene inn i Enhets-og immobilizing dem under Fleksibel PDMS Membran

  1. Fyll strømningskanalen med M9 buffer [3 g KH 2 4 PO, 6 g Na 2 4 HPO, 5 g NaCl, 1 ml 1 M 4 MgSO, 2 H O til 1 L, sterilisere etter autoclaving] for C. elegans 18 eller 1X PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 4 HPO, 0,24 g KH 2 4 PO, H 2 O til 1 L, sterilisere ved autoklavering] for Drosophila / sebrafisk larver 19 i 10 minutter før en eksperiment.
  2. Finn en C. elegans av nødvendig stadium på en NGM plate 18 (eller første stadium Drosophila larver fra agar egg plate eller manuelt dechorionated 30 HPF sebrafisk larver i flytende medium 20) ved hjelp av en lav forstørrelse stereo mikroskop. Pick et enkelt dyr ved hjelp av en liten mengde buffer løsning inn i en mikro tips. Bruke en mikro spissen med slutten kuttet for å imøtekomme større Drosophila eller sebrafisk larver i buffer.
  3. Skyv enkelt organisme gjennom strømningskanalen fjord. Juster pipettering press for å plassere det enkelte dyr under den viktigste felle.
  4. Øk trykket av PDMS membranen langsomt å posisjonere dyret mot channel grense og immobilize det med 14 psi trykk for C. elegans, 7 psi for Drosophila og 3 psi for sebrafisk larver.
  5. Plasser den immobiliserte dyret på sentrum av den mikroskopiske synsfelt. Bruk en omvendt mikroskop på ønskede innstillinger for høy oppløsning lyse felt eller fluorescens bildebehandling. Erverve én eller time-lapse fluorescens bilder på forhåndsdefinerte bildefrekvens.
  6. Slipp fellen trykket og overvåke locomotion av dyret i 5-10 min ved lav forstørrelse.
  7. Skyll dyret og sett en frisk dyr å gjenta prosedyren ovenfor.
  8. Vaske alle dyrene fra avfallet reservoaret bruker destillert vann påføres med en sprøyte. Tørk kanalen ved å trykke luften ved hjelp av en sprøyte for fremtidig gjenbruk.

Forholdsregler: Dyr som krever høyere pipettering press for å flyt på innsiden av hovedkanalen tendens til å vise dårlig bevegelse / helse etter løslatelse fra fellen og bør unngås for imaging. Rengjør strømningskanalen for noen spor av buffer for å hindre tilstopping av kanalen ved krystaller. Hvis olje brukes for høy oppløsning, rengjøre glasset dekkglass å kunne opprettholde god signal til støyforhold for påfølgende eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immobilisering enheten er en dobbeltlag PDMS blokk fabrikkert av bonding to lag: en flyt (lag 1) og en kontroll (lag 2), som vist i figur 1. Den viktigste fellen er koblet til en nitrogengasstrøm sylinderen gjennom en regulator og en 3-veis stoppekranen å anvende nødvendig (3-14 psi) trykk mot membranen gjennom en væskesøyle (figur 1A). Den forandret retning membran immobilizes C. elegans, Drosophila eller sebrafisk larver i strømningskanalen utformet med forskjellige dimensjoner (figur 1B og 1C). Foto masker brukes til å designe immobilisering enheten lag med forskjellige geometrier for C. elegans (figur 1D), Drosophila larver (figur 1F) og sebrafisk larver (figur 1G). Kanalen høyde flyten laget (H1 i figur 1E, 1K) ble variert ved hjelp av ulike spin coating hastigheter å imøtekomme ellernismer av ulike diametere inne strømningskanalen. Flow lag høyder ble fabrikkert på 40 mikrometer, 80 mikrometer, 500 mikrometer og 900 mikrometer for C. elegans larvestadier, voksen C. elegans, første instar Drosophila larver og sebrafisk larver henholdsvis (tabell 1). Enheten med en strømningskanal høyde på 40 um er hensiktsmessig fra L1 til tidlig L4 C. elegans larver. En enhet med en 80 mikrometer strømningskanalen høyde brukes til sent L4 larver og voksen C. elegans når vulva begynner å stikke. De større sebrafisk enhetene kan også brukes for eldre Drosophila larver. Den PDMS membrantykkelse (m) ble fremstilt på 40 mikrometer og 300 mikrometer for C. elegans og Drosophila / sebrafisk enheter hhv. Høyden microfluidic kanalen i lag 2 ble fabrikert ved 40 mikrometer for tidlige larvestadiene av C. elegans og 80 mikrometer for sen larvestadier av C. elegans og Drosophila/ Sebrafisk larver. Høyden på strømningskanalen, membran og styrekanal ble målt i enheter fabrikkert i flere uavhengige grupper og ble funnet å være konsistent innenfor ± 5 mikrometer fra hverandre. Enheten bruker en membran nedbøyning teknikk (figur 1H-J) for å immobilisere organismer i strømningskanalen.

Organismer Strømningskanalen (PDMS-1) Spin forutsetningene for flow kanal Spacer PDMS (PDMS-S) Spin betingelser for spacer PDMS Immobilisering (psi)
C. elegans (L1 til tidlig L4) 40 mikrometer (Su8-2025) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) NA NA 14
C. elegans (sen L4 og voksne) 80 &mu, m (Su8-2050) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) NA NA 14
Drosophila (første stadium) 80 mikrometer (Su8-2050) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) 400 mikrometer (PDMS) 500 rpm (35 sek) 7
Sebrafisk (30 HPF) 80 mikrometer (Su8-2050) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) 2X 400 mikrometer (PDMS) 500 rpm (35 sek) 3

Tabell 1. Device dimensjoner strømningskanalen (PDMS-1) og avstandsstykket PDMS lag (PDMS-S) som brukes i C. elegans og Drosophila / sebrafisk enheter.

C. elegans L4 larver ble immobilisert i 80 mikrometer kanalen høyde PDMS microfluidic enhet ved hjelp av 14 psi nitrogengass (Figur 2A). Time-lapse fluorescens bilder were kjøpt med en hastighet på 2 bilder per sekund (fps) med en 60X objektiv (numerisk 1,4 blenderåpning, olje mål) for imaging transport av mitokondrier visualisert ved hjelp av en mitokondriematrix målrettet GFP i touch reseptor neurons 21. Alle 400 rammer ble konvertert til kymographs bruker ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) og mitokondrier ble klassifisert som anterogradely rettet (bort fra cellen kroppen), retrogradely rettet (mot cellen kroppen) eller stasjonær (figur 2E). Vi har observert mitokondrie transport opp til 21 psi med immobilisering press, men fluksen var noe større ved laveste immobilisering press. Den anterograd og retrograd fluks av mitokondriene ble målt til å være 1,1 ± 0,23 og 1,6 ± 0,22 på 7 psi mens 0,8 ± 0,25 og 1,2 ± 0,34 ved 14 psi immobilisering press. Verdiene var ikke statistisk forskjellig fra 1,1 ± 0,33 og 1,3 & plusmn; 0,42 oppnådd fra dyr immobilisert ved anvendelse av 3 mM levamisol (p-verdier> 0,45, n = 30 dyr).

De større enheter med 500 um høyde kan brukes for å immobilisere første instar Drosophila larver (Fig. 2B) og 28-30 HPF sebrafisk larver (figur 2D). Disseksjon av første instars Drosophila larver kan være utfordrende. I motsetning microfluidic enheter gir en fremgangsmåte for å utføre høy oppløsning lyse felt og / eller fluorescens imaging hjelp intakte organismer. Individuell Drosophila larver ble immobilisert med 7 psi komprimert nitrogen gass (figur 2B, Tabell 1) og fluorescens bilder av synaptotagmin.eGFP transport i sensoriske nevronene ble kjøpt (figur 2C). Time-lapse filmer viste bevegelige og stasjonære synaptotagmin markert last i sensoriske nevroner (figur 2F). Gjennomsnittlig anterograd og retrograd hastighet ble målt fra Kymographs å være 0,92 ± 0,04 mikrometer / s og 1,00 ± 0,05 um / s henholdsvis (n = 6 dyr, n> 40 segmenter). Disse er sammenlignbare med hastigheter på synaptotagmin bærer transport vesikler målt i dissekert Drosophila motor nevroner flytte både anterogradely (0,84 ± 0,05 mikrometer / s) og retrogradely (0.76 ± 0.03 mikrometer / s) 22.

Lignende enheter med 900 um høyde ble brukt for å immobilisere ulike stadier av zebrafisk larver (Fig. 2D, Tabell 1). Sebrafisk larver i løpet av sin tidlige utviklingsstadier knipser halen hver 10 til 15 sek og er vanligvis immobilisert med 0,02% Tricaine (MS-222) i oppløsning eller på montering medier for høy oppløsning 23. Våre PDMS enheten gir et alternativt hjelpemiddel for rask immobilisering og eliminerer behovet for en upålitelig monteringsmedium i den optiske banen under høy oppløsning 24. Vi manuelt dechorionated 28-30 HPF larver og immobilisert dem enkeltvis i en PDMS enhet ved hjelp av tre psi nitrogengass for å skaffe time-lapse filmer av larvenes hjerterytme. Frekvensen av hjerteslag ble målt til å være 136,8 ± 1,6 per min (n = 8 filmer) og var lik andre publiserte rapporter 25.

Vår enkle microfluidic enheten hadde allerede vært vist for å måle en rekke sub-cellulære og cellulære hendelser i villtype C. elegans 4. I vår microfluidic enhet, vill type C. elegans viser et større antall last som synaptiske vesikler som beveger seg i forhold til nevroner dyr som immobiliserte bruker bedøvelsesmidler. Men vi hadde ikke testet våre enheter for muterte dyr å se om disse funnene holder sant. For å teste dette brukte vi en sterk hypomorphic mutant i kinesin3 / UNC-104 molekylær motor, UNC-104 (e1265), som transporterer presynaptiske vesikler 26. Vi sammenlignet det stadig GFP :: RAB-3 markert presynaptiske Vesiklene i fremre laterale mechanosensory nevroner i narkose immobilisert og enheten immobilisert mutant aniamls (figur 3A). Flux av presynaptiske vesikler var større flux i enheten immobiliserte dyr sammenlignet med data innsamlet fra UNC-104 dyr bedøvet i en mM levamisol (Figur 3B, 3C) 27. Dette viser at bildebehandling sterke transport defekte mutanter i microfluidic enheter er sannsynlig å være en mer effektiv måte å samle inn data. Vi viser også at annen last f.eks dendrittiske transport av glutamatreseptorer i URY nevroner kan avbildes i enheten immobiliserte dyr (Figur 3D, 3E). Enheten kan også brukes til å avbilde cellulære prosesser under tidlig C. elegans utvikling som Q neuroblast divisjon i L1 dyr. QR cellen ble fotografert å dele for å danne to datter celler QR.a og QR.p ~ 3 timer etter klekking (figur 3F) konsistent medtidligere observasjoner 28.

Tabell 1. Device dimensjoner strømningskanalen (PDMS-1) og avstandsstykket PDMS lag (PDMS-S) som brukes i C. elegans og Drosophila / sebrafisk enheter.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av PDMS microfluidic enheter for genetiske modellorganismer. (A) Organismen er lastet ved hjelp av en mikro spissen inn i strømningskanalen og immobilisert ved hjelp av komprimert nitrogen gass styres ved hjelp av en regulator og ventil. Enheten er egnet for lyse felt / fluorescens bildebehandling i en omvendt mikroskop. Konstruksjonen består av en 10 mm lang strømningskanal (motivet I, L1) og en styrekanal (motivet II, L2) henholdsvis for C. elegans (B) og Drosophila / sebrafisk larver (C). Dimensjonene er vist på motivet (B og C). (D, F, G) Skjematisk av various lag av PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membran, PDMS-S og Glass) til stede i et C. elegans, Drosophila og sebrafisk immobilisering enhet. (E) Skjematisk representasjon av et tverrsnitt av apparatet som viser hoveddelen PDMS laget (PDMS-2), en spin belagt PDMS lag (PDMS-1) for å danne en fleksibel membran og et avstandsstykke PDMS lag (PDMS-S) for å legge til høyde til strømningskanalen (for Drosophila / sebrafisk enhet). Hele strukturen er bundet irreversibelt til en optisk klasse glass dekkglass å imøtekomme organismen (sirkel i brunt). Den skjematiske indikerer høyden styrekanalen 'h2', strømningskanal 'h1', punchet spacer lag 's »og membrantykkelse' m '. (H) Indikerer membranen nedbøyning mot strømningskanalen i nærvær av væskesøyle under trykk i styrekanalen. Mørkefelt bilder vises en fri (I) og avbøyes membran (J) under null og 14 psi trykksatt væskesøyle henholdsvis. Pilen og pilhodet indikerer boble under og ut av membranen i strømningskanalen hhv. (K) tverrsnitt bilde av C. elegans enheten tatt på plasseringen av det immobiliserende området. Målestokk er 50 mikrometer (K) og 200 mikrometer (I, J). (D, F, G) Skjema er ikke i riktig skala. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Imaging genetiske modellorganismer immobilisert i en microfluidic enhet. Lyse feltet bilde av en immobilisert C. elegans (A), et første stadium Drosophila larver (B) og en 30 HPF sebrafisk larver (D) i en PDMS microfluidic enhet. Kymograph analyse av time-lapse avbildning av jsIs609, en C. elegans belastning, uttrykker en mitokondriematrix målrettet GFP i en anterior lateral mechanosensory neuron (ALM) av en enhet immobilized dyr (E). Mitokondrier er klassifisert som anterograd ("ned" pilhodet), retrograd ("opp" pilen hode) og stasjonær ("stjerne" mark) i kymograph. (C) Fluorescens bilde av en intakt første instar Drosophila larve. Boksen indikerer plasseringen der høyoppløselig intervallopptak avbildning av syt.eGFP transporten utføres i en kolinerg neuron. Montasje av fem rammer ervervet ved 5 Hz med rammenumrene angitt på hvert bilde og GFP merkede last vist som anterograd, retrograd og ro i montasjen (F). Boksen i (D) angir området som ble overvåket for beregning hastighet av hjerteslag av sebrafisk larver. Skala bar er 5 mikrometer (F), 10 mikrometer (E), 100 mikrometer (A, B) og 200 mikrometer (D).

Figur 3
Figur 3. Cellular og sub-mobilnettet bildebehandling i C. elegans med PDMS microfluidic enheter. (A) Skjematisk fremstilling av en maurerior lateral mechanosensory (ALM) nervecellen med anterograd og retrograd retninger merket. Den stiplede boksen viser regionen avbildes for aksonal transport. 350 rammer anskaffes ved hjelp av en roterende plate confocal mikroskop på 5 fps med cellen kroppen (CB) på høyre og nerve ring (NR) til venstre. Data analyseres ved hjelp av kymographs for dyr immobilisert i en enhet eller ved å bruke 1 mM levamisol (C). Cargo beveger seg i anterograd og retrograd retninger vises med piler som peker "ned" og "opp" hhv. (B) Anterograd og retrograd fluks av partikler observert i UNC-104 (e1265) dyr i en 20 mikrometer region av ALM nervecellen over 350 time-lapse rammer. (D) Skjematisk fremstilling av et URY nervecellen brukes til å avbilde GFP merket glutamat reseptorer transport. 350 time-lapse rammer omdannes til kymographs som viser lasten beveger seg i anterograd og retrograd retninger i dyr immobilisert i PDMS enheten eller bruke en mM levamisol (E). Time-lapse bilder ervervet under Q neuroblast divisjon og migrasjon i tidlige larvestadier av C. elegans. (F) Tre time-lapse rammer som viser QR gjennomgår divisjon for å danne sin datter celler QR.a og QR.p. Målestokk er 5 mikrometer (C, E og F). Data representert i (B) er gjennomsnittlig ± SEM (n> 4). Sammenligninger med hensyn til verdiene oppnådd i bedøvelse og betegnet med * (p <0,05) og ** (p <0,005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS microfluidic enheter er optisk transparent kan derfor brukes for høy oppløsning in vivo avbildning av eventuelle gjennomsiktig / gjennomskinnelig modell organisme. Vår design er egnet for høy forstørrelse spatio-temporal avbildning av cellulære og sub-mobilnettet hendelser i intakte levende dyr. Microfabrication med myke litografi teknikker gjør det enkelt manipulering av enheten dimensjoner for ulike størrelser av modellorganismer. Enheter av forskjellige størrelser er fabrikkert for ulike stadier av C. elegans, Drosophila larver og sebrafisk larver. Enheter med forskjellige høyder på 40 mikrometer og 80 mikrometer i sine flyt lag kanalene viser forbedret immobilisering og bedre post-avbildning helsen til både tidlig (L1) og senere (sent L4) stadier av C. elegans hhv. Vi oppnår en 100% suksessrate i enheten fabrikasjon for C. elegans og Drosophila / sebrafisk uten defekte enheter. Enhetene kan brukes flere ganger tilstyrekanalen er forurenset med støvpartikler eller bakterievekst. Enhet immobilisert C. elegans vise større last fluks i både villtype og mutante dyr når sammenlignet anesthesized dyr. Enhet immobilisering eliminerer behovet for teknisk utfordrende disseksjon protokoller spesielt for tidlige utviklingsstadier av Drosophila larver 29.

Momentant immobilisering protokoller i PDMS microfluidic enheter har en iboende fordel at den reduserer eksperimentell tid i forhold til de vanligvis lengre eksponeringstider kreves for eksternt anvendt anestesimidler. Alle immobiliserte organismer tilbake til normal bevegelse innen 5-10 min etter utgivelsen av press på den deformerbare PDMS membran. C. elegans immobiliseres på grensen strømningskanalen og bort fra den sentrale delen av det immobiliserende membran. Dyr immobilisert i midten av strømningskanalen viser dårlig helse etter immobilizasjon og dø innen en dag eller to. Vår microfluidic enheten har blitt brukt til å holde L4 stadiet C. elegans immobilisert i opptil en time under membranen uten å påvirke sin helse eller senere utvikling. Dyr immobilisert for kortere tider (opp til 10 min) kan bli fanget flere ganger for avbildning. For tidlige utviklingsstadier, C. elegans ble immobilisert med litt lavere trykk (7 psi) for lengre sikt time-lapse eksperimenter (~ 3 t). Dyr immobilisert under membranen etter utgivelsen ble forlatt i den samme enheten i den mellomliggende tid. Disse dyrene er sammenlignbare med villtype i både deres utvikling og generell helse. Voksen C. elegans immobilisert med lavere trykk (7 psi) viste treg drift i løpet av høyoppløselige time-lapse eksperimenter og krever komplekse analyseverktøy for transport analyse. Men lavere trykk ble brukt til å utføre langtidsstudier som Q neuroblast celledeling / migrasjon over ~ 3 timer eller semi kvantitative mitochondria transport karakterisering, prosesser som ikke trenger full immobilisering. Dermed lavere presset av immobilisering kan brukes avhengig av datasettet som må samles inn.

Time-lapse avbildning av L4 C. elegans viser saltatory bevegelse av GFP merket mitokondrier i ALM nervecellen (stamme jsIs609) som har blitt rapportert for nevroner i andre modellsystemer 30-32. Noen mitokondriene i disse nevronene viser toveis transport mens flertallet av dem står stille over varigheten av filmen. På tross av de små forskjeller i flux vi fortsetter ved hjelp av 14 psi immobilisering trykk i tilfelle av C. elegans å få fullstendig immobilisering og unngå drift i løpet av høy oppløsning time-lapse avbildning av aksonal transport. Vi foreslår at du bruker 14 psi i en generell protokoll og avhengig eksperimentelle behov kan dette enten økes eller reduseres. Dyr tok nesten samme tid for å gå tilbake til normal locomotion fra både lavere og høyere trykk og immobilisering immobiliserte dyrene utviklet identisk til de som var dyrket uten immobilisering.

Enheten når fremstille bruker større dimensjoner med spacer lag kan brukes for større modell organismer som Drosophila og sebrafisk larver. Avbildning av synaptotagmin.eGFP transport i intakte første stadium Drosophila sensoriske nevroner viser aktiv transport i både anterograd og retrograd retninger. Gjennomsnittlig hastigheter målt i enheten immobilisert larvene er høyere enn verdiene målt i dissekert motor nevroner 22. Denne forskjellen kan oppstå fra raskere datainnsamling i våre eksperimenter (5 Hz V / s 1,1 til 1,4 Hz), neuron-spesifikke forskjeller i organeller transport (sensorisk v / s motor neurons) og / eller virkningene grunnet disseksjon.

Våre tidligere eksperimenter ble utført utelukkende i vill type dyr 4, så vi fastslått ombildebehandling mutanter i microfluidic enheter var også en fordel. Time-lapse avbildning av C. elegans L4 dyr viser redusert fluks av GFP :: Rab-3 merkede presynaptiske vesikler i kinesin3/unc-104 mutanter immobilisert i 1,0 mM levamisol mot flux målinger oppnådd i dyr ved hjelp av vår immobiliserte PDMS enheten (figur 3B). Vi har ofte observert og viser et eksempel (Figur 3C) som i mutanter svært lite transport er observert dersom dyrene er immobilisert med bedøvende konsentrasjoner som immobilize villtype dyr. Tallene for vesikler som beveger seg i UNC-104 dyr er betydelig høyere når vi bruker microfluidic enheter. Bedøvede dyr viser lignende transport egenskaper når den plasseres under 14psi trykket til PDMS membran (Figur 3B). Lignende observasjoner er også gjort i vill type dyr 4. Disse dataene antyder at den økte fluksen er ikke sannsynlig å oppstå fra immobilisering under nitrogen, men grunnet en protokoll som var mindre skadelig for intracellulært transport.

I prinsippet kan andre arrangementer som kalsium dynamikk og celledeling alle være avbildet i intakt Drosophila / sebrafisk larver i tillegg. Post-avbildning utvinning av enheten immobiliserte dyr er mindre skadelig for organismen levedyktighet 4 og dermed slike enheter kan også brukes til å utføre langsiktig avbildning av genetisk modell genetiske organismer for hendelser som oppstår over lengre tidsskala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Krishanu Ray for Drosophila aksjer, Tarjani Agarwal for å opprettholde en Drosophila bur, Peter Juo for nuIs25 og CGC for C. elegans stammer. SPK har jsIs609 i Michael Nonet laboratorium. Vi takker Arpan Agnihotri (BITS Pilani) for hans hjelp i time-lapse avbildning av mitokondriene transport av jsIs609 dyr i microfluidic enheter. Vi er takknemlige for Dr. Vatsala Thirumalai og Surya Prakash for å gi oss med sebrafisk embryo. Vi takker Dr. Krishna og CIFF på NCBs for bruk av roterende disk confocal mikroskop støttet av Institutt for vitenskap og teknologi-senter for nanoteknologi (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi vil også takke Kaustubh Rau, V. Venkatraman og Chetana Sachidanand for diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av DBT post-doc (SM), DST fast-track ordning (SM) og en DBT stipend til (SPK). SA ble støttet av sommertid-og CSIR tilskudd til SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Bioteknologi Molecular Biology nevrovitenskap MicroFluidics, sebrafisk larver anestesi presynaptiske vesicle transport dendrittiske transport av glutamat reseptorer mitokondrie transport synaptotagmin transport hjerterytme
Enkle Microfluidic enheter for<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Og Sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter